이 작업은 Max Planck Society에서 지원했습니다.

1. Electro-competent V. parahaemolyticus 세포의 준비 및 형질 전환 체 세포의 전기 영동 참고 : 프로토콜의 다음 섹션에서는 electro-competent 세포의 준비 및 수영 세포에 플라스미드 DNA의 electroporation을 수행 할 수 있습니다. 이 단계는 형광 단백질이 플라스미드로부터 정상적으로 발현되는 경우 중요합니다. <ol><li> 37 ° C에서 밤새 100 μg / ML 암피실린과 부화가 포함 된 신선한 LB 한천 플레이트에 -80 ° C 글리세롤 주식에서 V.의 parahaemolyticus 세포를 스트레칭. </li><li> 다음날, V. parahaemolyticus 의 단일 식민지로 LB 배지 200 ML을 접종하고 OD 600 이 1.0에 도달 할 때까지 흔들어주는 조건하에 37 ° C에서 배양합니다. 보통 세포 배양이 원하는 광학 밀도에 도달하기 위해 5 ~ 6 시간의 배양이 필요합니다. </li><li> 즉시 얼음과 퍼프로 세포를 옮긴다.얼음과 4 ℃ 사전 냉각 원심 분리기에서 모든 추가 단계를 수행하십시오. </li><li> 4 ℃에서 10 분간 2,000 x g에서 세포 수확. </li><li> decantation하여 상등액을 버리고 얼음 - 차가운 273 MM 자당 솔루션 (산도 7.4, KOH로 버퍼링) 25 ML의 세포 펠렛을 다시 일시 중단합니다. </li><li> 4에서 다시 세포를 수확 2000 x 10 분 10 분. 두 번 더 반복하십시오. </li><li> 얼음 추위 273 MM 자당 솔루션 400 μL에 씻어 셀 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 이어서 글리세롤을 15 % vol / vol의 최종 농도로 첨가한다. 세포는 이제 electroporation을위한 준비가되어 있지만 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 70 μL의 일정량으로 동결 될 수 있습니다. </li><li> electroporation 들어, 플라스미드 DNA의 100 ~ 1,000 NG와 electro-competent 세포의 70 μL 나누기를 섞어 얼음처럼 차가운 electroporation cuvette (0.2 cm 전극 간격)에 혼합물을 전송하십시오. 25 μF, 2400 V 및 200 Ω 설정으로 전기 천공을 수행하십시오. </li><li> 일시 중지LB broth의 600 μL에 electroporation 큐벳의 세포, 2 ML 튜브에 전송하고 3 시간 37 ° C에서 떨고있는 동안 품어. </li><li> 5 분 2,000 XG에서 세포를 스핀하고 LB 국물의 100 μL에 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 필요한 항생제가 들어있는 선택적인 LB 한천 플레이트에 세포 현탁액을 퍼 내고 밤새 37 ° C에서 품을 수 있습니다. </li><li> 다음날 식민지 형성에 대한 접시를 확인하십시오. 자라는 콜로니는 플라스미드에 코드화 된 올바른 항생제 내성 유전자를 가지고 있으며 이제 더 많은 실험에 사용될 수 있습니다. </li></ol> 2. Swarmer 세포 분화의 유도 주 : 다음 단계는 V.parahaemolyticus의 분화 세포 수명주기로의 분화 를 유도하는 방법과 고체 표면에서의 증식을 자극하는 방법을 설명합니다. <ol><li> 뭉툭한 판을 준비하기 위해 심장 주입 (HI) 한천 4 g을 100 mL ddH 2 O에 현탁하십시오. </li><li>조심스럽게 마이크로파에서 HI 한천 용액을 끓여서 분말이 용해 될 때까지 때때로 병을 흔든다. 121 ℃에서 20 분간 오토 클레이브한다. </li><li> 고압 증기 멸균 후, HI 한천을 60-65 ° C로 냉각시킵니다. 50 μM (100 % 에탄올 중 50 mM의 원액)의 최종 농도로 2,2&#39;- 비 피리 딜을 첨가한다. 4 mM의 최종 농도 (ddH 2 O에서 4 M의 원액)에 CaCl 2 를 첨가한다. 필요한 경우 플라스미드를 유지하기 위해 항생제를 용액에 첨가하십시오. 참고 : 유도 성 플라스미드를 사용하려는 경우 유도제를 최종 농도에 첨가하십시오. 주의 : 2,2&#39;- 바이 피리 딜 : 급성 독성 (경구, 피부, 흡입). 이 화학 물질을 취급 할 때는 장갑과 안전 안경을 착용하십시오. </li><li> 둥근 150mm 배양 접시에 최종 HI 한천 솔루션 30 - 35 ML을 부어하고 한천이 고형하자. </li><li> 세포 배양 물을 발견하기 직전에 적어도 10 분 동안 37 ℃에서 한천 평판을 말린 다음 (또는 액체 잔류 물이 disa를 가질 때까지)ppeared하지만 더 이상은 아닙니다) 열린 뚜껑이있는 오른쪽 위. 참고 : 건조 시간은 사용 된 인큐베이터에 따라 크게 달라지며 건조 된 판은 V.parahaemolyticus의 덤불을 허용하지 않습니다. (이 단계는 매우 중요합니다!) 플레이트는 신선한 상태로 사용해야하며 2 ~ 3 시간 이상 경과되어서는 안됩니다. 오래된 플레이트는 너무 마르기 때문에 떼 지어 모이게됩니다. </li><li> 단일 식민지의 가장자리에서 소량의 LB를 5 mL의 LB 배지에 접종하십시오. OD 600 = 0.8이 될 때까지 37 ° C에서 흔들어주는 배양 물을 배양하십시오. 보통 2-3 시간 정도 걸립니다. 그 후에, 세포는 HI 떼 지어 다니는 한천 플레이트에 얼룩을지게 될 준비가되었습니다. </li><li> HI agar swarming plate ( 그림 1A )의 중앙에 1 μL의 세포 배양 물을 놓습니다. </li><li> 현장을 말리십시오 ( 그림 1B ). </li><li> 플레이트를 투명한 플라스틱 테이프로 밀봉하고 단단히 부착되었는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 밤새 배양하는 동안 분리 될 수 있습니다 ( 그림 1C ). 참고 :인감이 완벽하다는 점이 매우 중요합니다. 공기 방울이 형성되는 것을 피하고 테이프를 적용 할 때 접 힙니다. </li><li> 24 ° C 밤새 플레이트를 품어. 이것은 군집 (swarm-colony)의 주변에서 뻗어 나온 떼 지어 발적과 함께 V. parahaemolyticus 군집 (swarm-colony)의 형성을 초래할 것이다 ( 그림 2 ). </li></ol> 3. 형광 현미경 검사를위한 V. parahaemolyticus Swarmer 세포의 준비 참고 : 다음 프로토콜은 현미경에 대한 단일 swarmer 세포를 얻기 위해 아가로 오스 패드에 득실 거리는 플레어의 현미경 아가로 오스 슬라이드 및 후속 임 프린팅을 준비하는 방법을 설명합니다. <ol><li> 현미경 검사를 위해 아가로 오스 슬라이드를 준비하려면 20 % vol / vol PBS와 10 % vol / vol LB broth 용액 100 mL에 1 g의 아가로 오스를 첨가하십시오. 조심스럽게 전자 레인지에서 용액을 끓여 아가로 오스를 녹이고 자기 교반기로 혼합하면서 65-70 ° C로 식히십시오. </li><li> 장소 AC기울기를 가진 현미경 슬라이드를 작업대의 완벽하게 수평 부분에 올려 놓습니다. 슬라이드의 양쪽 끝을 범용 실험실 라벨 테이프로 덮고 슬라이드를 작업대에 고정시킵니다. 두 테이프 사이의 거리는 약 3cm가되어야합니다. 참고 : 테이프의 두 레이어는 아가로 오스 패드의 높이를 결정하는 매우 작은 높이를 만듭니다. 세포가 현미경 분석을 위해 동일한 평면에 있는지 확인하기위한 작업 공간의 높이는 중요합니다. </li><li> 이전에 준비한 아가로 오스 용액 250 μL을 피복되지 않은 유리 표면에 피펫 팅하십시오. </li><li> 이제 두 번째 현미경 슬라이드를 아래쪽 상단과 동일한 방향으로 놓고 약간 아래로 눌러 잔여 아가로 오스가 측면으로 흘러 나오도록하십시오. </li><li> 아가로 오스가 1 ~ 2 분 동안 고형화되도록 한 다음 천천히 상단 유리 슬라이드를 수평 이동으로 하단 유리에서 빼냅니다. </li><li> 메스를 사용하여 잔류 아가로 오스를 제거하십시오.현미경 슬라이드의 측면과 천천히 현미경 슬라이드의 끝 부분에서 테이프를 제거합니다. 참고 : 아가로 오스 슬라이드는 이제 준비가되었으며 천천히 건조하기 시작하므로 최대한 빨리 사용해야합니다. </li><li> 스머머 세포에서 현미경 검사를 수행하려면 떼 지어 서식하는 콜로니 ( 그림 1D )의 가장 바깥 쪽 가장자리에서 ~ 3mm x 10mm의 무리한 한천 조각을 잘라내십시오. 스 마머 셀을 현미경 슬라이드로 옮기기 직전까지 떼 지음 판의 테이프 씰을 끊지 않는 것이 매우 중요합니다. 일단 테이프가 제거되면, V. parahaemolyticus의 떼죽음 세포가 수영 세포로 분화를 시작합니다. 참고 : 떼 지어 서식하는 모서리 바깥 쪽에서부터 식민지 안쪽까지 컷을 향하게하십시오 ( 그림 1D ). 이런 식으로 당신은 군집하는 식민지의 가장자리로 &quot;헤엄 치는 사람 오염&quot;을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 세포가 아가로 오스 PA를 마주보고 현미경 아가로 오스 슬라이드에 무리 한천의 조각을 전송d ( 도 1E ). 이것은 덤불 세포를 아가로 오스 패드 위에 각인시킵니다. </li><li> ~ 30 초 기다린 후, 아가로 오스 패드 ( 그림 1F )에서 한천 조각을 조심스럽게 제거하십시오. </li><li> 세포가 각인 된 아가로 오스 패드 위에 유리 coverslip을 놓습니다. 세포는 이제 현미경 검사를 할 준비가되었습니다. 참고 : swarmer 세포가 수영 선수 상태로 천천히 분화를 시작하기 때문에 swarmer 세포를 즉시 이미지화하는 것이 중요합니다. </li></ol> 4. 형광 현미경 검사를위한 V. parahaemolyticus 수영 세포 배양의 준비 참고 : 프로토콜의이 섹션은 수영 세포 유형에 형광 현미경 검사 를 수행하기 위해 V.parahaemolyticus의 문화를 준비하는 방법을 설명합니다. <ol><li> 단일 식민지의 가장자리에서 소량의 LB를 5 mL의 LB 배지에 접종하십시오. 37 ° C에서 1 시간 동안 또는 약간의 세포 성장이 보일 때까지 흔들어주는 배양 물을 인큐베이션한다. </li><li> 에서필요한 경우이 단계에서 관심 단백질의 발현 유도제를 추가합니다. 이 실시 예에서, L- 아라비 노스는 YFP-CheW 9의 발현을 유도하기 위해 0.2 % (w / vol)의 최종 농도로 첨가되었다. </li><li> 37에서 추가 2 시간 동안 흔들어 문화를 품어 ° C. </li><li> 현미경 검사 아가로 오스 슬라이드를 준비하려면 3.1-3.7 단계를 수행하십시오. </li><li> 아가로 오스 패드 중앙에 1 μL의 세포 배양 물을 놓고 마를 때까지 배양하십시오. </li><li> 세포가 발견 된 아가로 오스 패드 위에 유리 coverslip을 놓습니다. 세포는 이제 형광 현미경으로 이미징 준비가되었습니다. </li></ol> 5. 이미지 분석 프로토콜의이 부분은 이미지 분석을위한 작업 흐름, 특히 인구 통계 학적 분석을 위해 단일 셀의 형광 데이터를 추출하는 방법을 설명합니다. <ol><li> 이미지 분석을 시작하기 전에 모든 현미경 이미지가 16 비트 TIF 형식으로 저장되었는지 확인하십시오. </li><li> DIC (또는 위상차) 및 해당 형광 채널 이미지를 소프트웨어에로드하십시오. </li><li> &quot;디스플레이 / 오버레이 이미지&quot;를 선택하여 두 채널의 오버레이 이미지를 생성하십시오. 사진 수 ( &quot;# Images :&quot;)를 2로 설정하고 첫 번째 채널의 DIC 이미지와 두 번째 채널의 형광 이미지를 선택하십시오. </li><li> 툴바에서 &quot;Multi-Line&quot;도구를 선택하고 셀 가운데를 통해 한 극에서 다른 극으로 셀을 표시하십시오. 생성 된 모든 선 (선 객체)의 목록을 가져 오려면 &quot;측정 / 지역 측정&quot;을 엽니 다. 영역 레이블, 거리 및 평균 강도 만 표시하도록 영역 측정을 구성하십시오. </li><li> &quot;Measure / Calibrate Distance&quot;아래의 픽셀 크기를 현미경 설정에 맞는 픽셀 크기로 조정하고 &quot;열려있는 모든 이미지에 적용&quot;을 클릭하십시오. </li><li> 모든 영역 (라인 객체)을 형광 채널 이미지로 전송합니다. &quot;지역 / Transf영역 &quot;에서 소스 이미지 (오버레이 이미지)와 대상 이미지 (형광 채널 이미지)를 선택하고&quot;All Regions &quot;를 선택하고&quot;OK &quot;를 누릅니다. 참고 : 정확한 선 (선 객체, 지역, ROI)을 나중에 다시 생성하려면 &quot;영역 / 영역 저장&quot;을 열고 영역을 저장하십시오. </li><li> &quot;측정 / 지역 측정&quot;을 열고 &quot;로그 열기&quot;를 눌러 모든 지역 측정 값을 스프레드 시트로 내 보냅니다. 데이터를 열고 내보내려면 확인하십시오. 스프레드 시트가 백그라운드에서 열리면 마침내 &quot;F9 : 데이터 기록&quot;을 눌러 데이터를 내 보냅니다. </li><li> 셀을 따라 형광 초점의 위치를 ​​결정하려면 &quot;Measure / Linescan&quot;을 엽니 다. 셀의 전체 너비가 이전에 만든 영역으로 덮여 지도록 &quot;선폭&quot;을 값으로 설정합니다. 라인 스캔 그래프를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 &quot;그래프 데이터 표시&quot;를 선택하십시오. 라인 - 스캔을 따라 마우스 - 커서를 마우스 왼쪽 - 클릭하고 끌어서&quot;Graph Data&quot;창에는 두 지점 사이의 해당 픽셀 / 거리가 표시됩니다. 파란색으로 강조 표시된 행을 선택한 다음 내용을 복사하십시오. 참고 : 전체 라인 스캔 강도 프로파일은 &quot;라인 스캔&quot;창에서 &quot;로그 데이터&quot;를 눌러 스프레드 시트에 기록 할 수 있습니다. 추출 된 데이터는 이제 그래프 또는 추가 통계 분석에서 시각화에 사용할 수 있습니다. 세포주기에 걸친 현지화 패턴은 세포체와 세포의 길이에 따른 인구 통계 학적 표현으로 쉽게 시각화 될 수 있습니다. 이러한 표현은 이전에 선택된 동일한 투자 수익 (ROI)을 사용하여 얻을 수 있습니다. 다음 단계는 그림 3C 및 4C에 표시된 것과 유사한 인구 통계를 생성하는 방법의 예를 제공합니다. <ol><li> &quot;Metamorph nd &amp; ROI 파일 임포터&quot;를 사용하여 소프트웨어 (단계 5.6)에서 이전에 생성 된 피지 / ImageJ로드 영역 표시 (.rgn); 또는 분석 할 셀의 관심 영역 (ROI)을 빌드 인 &quot;세그먼트 선&quot;도구를 사용하여 Fiji / ImageJ에서 직접 만들 수 있습니다. </li><li> &quot;Analyze / Tools / ROI manager&quot;를 열고 모든 활성 목록 항목을 표시하십시오. &quot; </li><li> 그런 다음 &quot;More / Multi Plot&quot;을 클릭 한 다음 새로운 &quot;Multi Plot&quot;창에서 &quot;List&quot;를 선택하십시오. 표 항목을 클릭 한 다음 &quot;모두 복사&quot;를 선택하십시오. 그런 다음 새 스프레드 시트에 붙여 넣습니다. 참고 : 스프레드 시트에서 가장 긴 셀 (가장 많은 행이있는 두 개의 해당 X 및 Y 열)이 마지막 것임을 확인하십시오. </li><li> 스프레드 시트를 &quot;CSV (쉼표로 구분) (* .csv)&quot;로 저장하십시오. </li><li> 여기에서 R 스크립트를 다운로드하십시오. &quot;https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles&quot;10. 스크립트는 길이별로 세포를 분류하고 모든 세포의 형광 강도 프로파일을 각 세포의 형광등의 평균으로 정규화합니다이자형. </li><li> 전체 스크립트 &quot;cell profiles function.R&quot;을 R [버전 3.0.1; 11 ]. </li><li> 30 번째 줄에있는 &quot;예제 plots.R&quot;스크립트를 편집하여 파일 경로가 이전에 생성 된 .csv 파일이 저장된 폴더를 참조하도록합니다. 또한 31 행의 &quot;profile.csv&quot;파일 이름을 5.9.4 단계에서 생성 한 .csv 파일에 대해 선택한 파일 이름으로 변경하십시오. 그런 다음 &quot;example plots.R&quot;을 실행하고 스크립트 파일의 설명뿐만 아니라 &quot;https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles&quot;의 설명서를 따라 인구 통계 분석을 생성하십시오. </li></ol></li></ol>

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아무런 이해 상충이 없다고 선언했다.

이 논문은 V. parahaemolyticus swarmer 세포의 현미경 검사법에 대한 방법을보고하고, subcellular localization과 연구 된 형광 표지 단백질의 다른 특징을 분석하고 정량화하기위한 하향 분석을 수행 하였다. 현미경 검사 이미지 처리 및 분석을위한 몇 가지 도구가 있지만 14 , 15 , 16 , 17 , <sup class="x...

박테리아는 끊임없이 외부 환경에 변화를 경험하고 이에 따라 행동을 변경하고 적응시키는 여러 기술을 개발했습니다. 그러한 메커니즘 중 하나는 변경된 환경을보다 잘 보완하는 별개의 세포 유형으로의 분화를 포함한다. 분화에는 종종 세포주기의 조절, 세포 형태학 및 세포의 시공간적 조직화에 주요 변화가 따른다. 분화를 겪을 수있는 한 가지 유기체는 부비강염 ( Vibrio parahaemolyticus) 입니다. V. parahaemolyticus 는 Vibrionaceae 에 속하며, 이는 일반적으로 신선한 물이나 소금물에 서식하는 proteobacteria 계열입니다. Vibrionaceae 는 환경 에 널리 분포하며 Vibrio cholerae.V를 포함하여 사람에서 장관 감염을 일으키는 몇 종을 포함 합니다. parahaemolyticus 는 이형 체 (dimorphic organism)이며, 그 변이 형 생물체에 대한 변화를 수용하기위한 반응으로서 2 가지 별개의 세포 유형으로 분화 할 수있다외부 환경. 수성 환경에서, 그것은 오래 막대 기둥에 위치한 단 극성 편모가있는 짧은 막대 모양의 수영 세포로 존재합니다. 표면 접촉시, 스머머 셀로의 분화가 유발된다. Swarmer 세포 분화는 두 가지 주요 변화를 포함한다 : 세포 분열의 억제를 통한 swarmer 세포 형태 형성 및 두 번째 편모 계의 유도. 그 결과 분열이 일어나고 매우 길어진 봉 모양의 swarmer 세포가 형성되는데, 분열 현상은 분열 현상을 일으켜 자손 swarmer 세포가되거나 swimer 세포로 다시 분화된다. swarmer differentiation을 유도하거나 영향을 미치는 몇 가지 요인이보고되었다. 1 차 자극은 V. parahaemolyticus 가 표면 편에 회전의 억제를 감지하는 촉각 센서로 극모를 사용하는 메토 노 센싱 (mechanosensing) 에 의해 구동되는 것처럼 보이지만 몇 가지 다른 요인이우물 1 . 연구실에서는 북극 편모의 회전이 phenamil의 첨가에 의해 인위적으로 억제 될 수 있는데, 이는 나트륨 채널 구동 편모의 회전을 차단하여 스머머 분화를 유도한다. 또한, 초기 연구에서, Vibrio alginolyticus 는 투명한 플라스틱 테이프로 봉인 된 페트리 접시의 성장 배지에서 세포가 증식 될 때 고체 배지에서 떼 지어 유도되었다. 알칼리가 포화 된 여과지는 이러한 조건에서 휩쓸 기를 방지하여 하나 이상의 휘발성 산이 휩쓸 기의 유도에 관여 할 수 있음을 암시합니다. 따라서, 페트리 접시를 플라스틱 테이프로 밀봉하면 판의 헤드 공간 내에 세포 대사의 부산물로 형성된 휘발성 산이 축적 될 가능성이 높습니다. H2O2를 밀봉되지 않은 배양 접시에서 성장 배지에 첨가하여 배지 성분을 가수 분해하여 휘발성 산을 인위적으로 생산할 때도 동일한 효과가 나타났다 <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 3 , 4 , 5 . 그럼에도 불구하고 그러한 휘발성 산의 정체는 알려지지 않았습니다. 또한, 칼슘 6 과 철 제한 7 의 과도한 가용성은 모두 고체 표면보다 스와머 분화 및 증식을 강화시키는 것으로 나타났습니다. 세포는 화합물 2.2&#39;-Bipyridyl을 swarmer differentiation 8 에 영향을 미치는 것으로 보이는 성장 배지에 첨가함으로써 철분을 굶어 죽을 수있다. 분화를 조절하는 것으로 알려진 인자는 현재 스와머 세포로의 비장 세포 분화를 유도하고 고체 한천 표면에서 그의 증식을 재현 가능하게 유도하는 프로토콜의 설계에서 실행된다. 베로니카 parahemolyticus 의 분화는 세포 분열의 조절, 세포 형태 및 깃대와 같은 거대 분자 기계의 위치의 주요 변화를 포함한다화학 주성기구 (chemotaxis apparatus) - 세포주기에 따라 단백질의 특정 위치를 요구하는 과정. 따라서, 그러한 단백질의 세포 내 국지화를 연구하는 능력은 전술 한 세포 과정의 이해에 필수적이다. 이러한 연구를 수행하기 위해서는 단일 세포에서 형광 현미경 검사가 필요합니다. 이것은 swarmer 세포의 경우처럼 밀도가 높은 세균 집단 내에 존재하는 세포를 영상화 할 때 특히 어려울 수 있습니다. 현미경 연구를 위해 잠재적으로 단일 세포를 생성 할 수있는 액체 배지에서 스머머 분화를 유도하려는 시도가 있었다. 그리고 전사 수준에서이 세포들은 부분적으로 swarmer-differentiation 프로그램을 유도하지만 고체 배지에서 완전히 분화 된 swarmer 세포와 동일한 형태 학적 변화를 겪지는 않습니다 8 . 이 논문은 강력하고 재현성있는 방법을 제안한다.한천 표면의 차별화. 이 프로토콜은 단일 셀 현미경 검사 및 후속 분석을 위해 쉽게 접근 할 수있는 스머머 세포 집단을 쉽게 생성합니다. 또한, 프로토콜은 수영과 swarmer 세포 유형 (섹션 1, 2, 3, 4) 모두에서 형광 라벨 단백질의 현지화 연구를 가능하게합니다. 또한이 프로토콜은 박테리아 사회의 인구 통계 학적 분석을 가능하게하는 형광 현미경 실험에서 생성 된 데이터를 처리하고 분석하는 방법에 대한 후속 작업 과정을 설명합니다 (섹션 5).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Media components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-medium</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X968.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar, granulated</td>
			<td>BD</td>
			<td>214510</td>
			<td>For preparation of LB agar with LB-medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Heart Infusion Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>244400</td>
			<td>For preparation of HI agar swarming plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose NEEO, ultra quality</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2267.3</td>
			<td>For preparation of microscopy agarose pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additives</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5118.3</td>
			<td>Used to induce pBAD derivatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2`-Bipyridyl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D216305-25G</td>
			<td>For preparation of HI agar swarming plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.1</td>
			<td>For preparation of HI agar swarming plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K029.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3886.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Standard recipe for Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+) Sucrose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td>For preparation of electrocompetent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.5</td>
			<td>For preparation of electrocompetent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 150x20mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td>For preparation of HI agar swarming plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kelvitron t (B 6420)</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>-</td>
			<td>Used for drying HI agar swarming plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Microbial System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652662</td>
			<td>Used for elctroporation of plasmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph Offline (version 7.7.5.0)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td>Used for microscopy image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>Used for microscopy data analsis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of cellular differentiation and single cell imaging of vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells

단백질의 세포 내 지방화를 연구하는 능력은 많은 세포 과정을 이해하는 데 필수적입니다. 이것은 세균 공동체 내에 존재하는 세포를 영상화 할 때 특히 어려울 수있는 형광 현미경 검사를 위해 단일 세포를 얻을 수있는 능력을 필요로합니다. 예를 들어, 인간 병원체 Vibrio parahaemolyticus 는 액상 조건에서 짧은 막대 모양의 수영 세포로 존재하며, 표면 접촉시 고체 표면에서의 성장을 위해 특수화 된 고도로 연장 된 스웜머 세포의 하위 모집단으로 분화한다. 이 논문은 V. parahaemolyticus 의 두 가지 미분 상태에서 단일 세포 형광 현미경 분석을 수행하는 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 V.parahaemolyticus의 분열 세포주기를 매우 재현 가능하게 유도하여 고체 표면에 대한 증식을 촉진합니다. 상기 방법은 t로부터 연장되는 분화 된 스머머 셀의 플레어를 생성한다그는 군집 식민지의 가장자리에있다. 특히, 떼죽음의 끝에는 세포의 단일 층에 스머머 세포가 존재하기 때문에 현미경 슬라이드 및 단일 세포의 후속 형광 현미경 이미징으로 쉽게 전송할 수 있습니다. 또한, 박테리아 사회의 인구 통계 학적 표현을위한 이미지 분석의 워크 플로우가 제시됩니다. 원리의 증거로서, V.parahaemolyticus의 수영 세포 및 스머머 세포에서의 화학 주성 신호 전달 배열의 세포 내 국소화 분석 이 기재되어있다.

맹목적인 식민지의 분화 및 생성 유도 그림 1 은 V. parahaemolyticus ( 그림 1A-C )의 군집 콜로니 생산에 관련된 중요한 단계의 스키마를 제공합니다. Swarmmer 한천 배지를 24 ℃에서 배양하여 고형 한천 표면에서 스머머 분화 및 증식을 유도 하였다. 떼 지어 서식하는 콜로니의 대표적인 입체 현미경 이?...

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Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

이 프로토콜은 차별적으로 구별되는 Vibrio parahaemolyticus 헤모글로빈 과 swarmer 세포의 단일 세포 현미경 검사를 가능하게합니다. 이 방법은 단일 세포 분석을 위해 쉽게 얻을 수있는 덩어리 세포 집단을 생산하고 세포 배양의 준비, 스웜머 분화의 유도, 샘플 준비 및 이미지 분석을 다루고있다.

세포 분화 및 단일 세포 이미징의 유도<em&gt; 비브리오 균 (Vibrio parahaemolyticus)</em&gt; Swimmer and Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

induction-cellular-differentiation-single-cell-imaging-vibrio

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

9.3K 조회수.  Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology.  이 프로토콜은 차별적으로 구별되는 Vibrio parahaemolyticus 헤모글로빈 과 swarmer 세포의 단일 세포 현미경 검사를 가능하게합니다. 이 방법은 단일 세포 분석을 위해 쉽게 얻을 수있는 덩어리 세포 집단을 생산하고 세포 배양의 준비, 스웜머 분화의 유도, 샘플 준비 및 이미지 분석을 다루고있다. 

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Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an effective invasin for human epithelial and endothelial cells. We have identified endothelial surface-located integrins as major receptors for Opc, a process which requires Opc to first bind to integrin ligands such as vitronectin and via these to the cell-expressed receptors1. This process leads to bacterial invasion of endothelial cells2. More recently, we observed an interaction of Opc with a 100kDa protein found in whole cell lysates of human cells3. We initially observed this interaction when host cell proteins separated by electrophoresis and blotted on to nitrocellulose were overlaid with Opc-expressing Nm. The interaction was direct and did not involve intermediate molecules. By mass spectrometry, we established the identity of the protein as &alpha;-actinin. As no surface expressed &alpha;-actinin was found on any of the eight cell lines examined, and as Opc interactions with endothelial cells in the presence of serum lead to bacterial entry into the target cells, we examined the possibility of the two proteins interacting intracellularly. For this, cultured human brain microvascular endothelial cells (HBMECs) were infected with Opc-expressing Nm for extended periods and the locations of internalised bacteria and &alpha;-actinin were examined by confocal microscopy. We observed time-dependent increase in colocalisation of Nm with the cytoskeletal protein, which was considerable after an eight hour period of bacterial internalisation. In addition, the use of quantitative imaging software enabled us to obtain a relative measure of the colocalisation of Nm with &alpha;-actinin and other cytoskeletal proteins. Here we present a protocol for visualisation and quantification of the colocalisation of the bacterium with intracellular proteins after bacterial entry into human endothelial cells, although the procedure is also applicable to human epithelial cells.

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &#945;-actinin by Confocal Imaging

Neisseria meningitidis (Nm), a gram negative human-specific respiratory pathogen, can bind to human &alpha;-actinin. Here we present a protocol for visualisation of colocalisation of the bacterium with intracellular &alpha;-actinin after bacterial entry into human brain microvascular endothelial cells (HBMECs).

의 세포 상호 작용 Visualisation 및 부량 Neisseria meningitidis</em공촛점 이미징에 의해 α - actinin>과 인간

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

연구

면역학 및 감염병학

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no fitness consequence (commensal), or be beneficial (mutualistic). While much attention has been given to pathogenic interactions, little is known about the processes that dictate the reproducible acquisition of beneficial/commensal bacteria from the environment. The light-organ mutualism between the marine Gram-negative bacterium V. fischeri and the Hawaiian bobtail squid, E. scolopes, represents a highly specific interaction in which one host (E. scolopes) establishes a symbiotic relationship with only one bacterial species (V. fischeri) throughout the course of its lifetime6,7. Bioluminescence produced by V. fischeri during this interaction provides an anti-predatory benefit to E. scolopes during nocturnal activities8,9, while the nutrient-rich host tissue provides V. fischeri with a protected niche10. During each host generation, this relationship is recapitulated, thus representing a predictable process that can be assessed in detail at various stages of symbiotic development. In the laboratory, the juvenile squid hatch aposymbiotically (uncolonized), and, if collected within the first 30-60 minutes and transferred to symbiont-free water, cannot be colonized except by the experimental inoculum6. This interaction thus provides a useful model system in which to assess the individual steps that lead to specific acquisition of a symbiotic microbe from the environment11,12.
Here we describe a method to assess the degree of colonization that occurs when newly hatched aposymbiotic E. scolopes are exposed to (artificial) seawater containing V. fischeri. This simple assay describes inoculation, natural infection, and recovery of the bacterial symbiont from the nascent light organ of E. scolopes. Care is taken to provide a consistent environment for the animals during symbiotic development, especially with regard to water quality and light cues. Methods to characterize the symbiotic population described include (1) measurement of bacterially-derived bioluminescence, and (2) direct colony counting of recovered symbionts.

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

The method outlines the procedure by which the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes and its bacterial symbiont, Vibrio fischeri, are raised separately and then introduced to allow for specific colonization of the squid light organ by the bacteria. Colonization detection by bacterially-derived luminescence and by direct colony counting are described.

의 식민지 Euprymna scolopes 오징어에 의한 장염 fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

임상 신청<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em유전자 주변과 배꼽 탯줄 혈액에서 T 세포를 수정하는 셀을 제시&gt;과 인공 항원

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

구조화 조명 현미경 데이터의 시공간적 이미지 상관 분광학에 의해 정량화 T 세포에서 대뇌 피질 굴지 흐름

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the majority of Vibrio-associated infections. Thus, accurate differentiation among Vibrio spp. and detection of V. parahaemolyticus is critically important to ensure the safety of our food supply. Although molecular techniques are increasingly common, culture-depending methods are still routinely done and they are considered standard methods in certain circumstances. Hence, a novel chromogenic agar medium was tested with the goal of providing a better method for isolation and differentiation of clinically relevant Vibrio spp. The protocol compared the sensitivity, specificity and detection limit for the detection of V. parahaemolyticus between the new chromogenic medium and a conventional medium. Various V. parahaemolyticus strains (n=22) representing diverse serotypes and source of origins were used. They were previously identified by Food and Drug Administration (FDA) and Centers for Disease Control and Prevention (CDC), and further verified in our laboratory by tlh-PCR. In at least four separate trials, these strains were inoculated on the chromogenic agar and thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS) agar, which is the recommended medium for culturing this species, followed by incubation at 35-37 &#176;C for 24-96 hr. Three V. parahaemolyticus strains (13.6%) did not grow optimally on TCBS, nonetheless exhibited green colonies if there was growth. Two strains (9.1%) did not yield the expected cyan colonies on the chromogenic agar. Non-V. parahaemolyticus strains (n=32) were also tested to determine the specificity of the chromogenic agar. Among these strains, 31 did not grow or exhibited other colony morphologies. The mean recovery of V. parahaemolyticus on the chromogenic agar was ~96.4% relative to tryptic soy agar supplemented with 2% NaCl. In conclusion, the new chromogenic agar is an effective medium to detect V. parahaemolyticus and to differentiate it from other vibrios.

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

의 검출을위한 더 민감하고 특정 원체 한천 배지의 개발<em&gt; 장염 비브리오 균</em&gt; 및 기타<em&gt; 비브리오</em&gt; 종

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.

madSTORM을 이용한 T 세포의 고해상도 이미징

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression of proteins known to respond to metabolic stress was measured in brain-nuclei isolates using Western blotting. This was done to assess whether metabolic stress-induced nutrient insufficiency in the body triggered neuronal stress. We have previously demonstrated that nutrient insufficiency in neonates elicits metabolic stress in the gut. Furthermore, colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi prior to and after first feed. Signaling protein markers associated with the endoplasmic reticulum stress [ER chaperone binding immunoglobulin protein (BiP), eukaryotic translation initiation factor 2A (eIF2a), and eIF2a kinase protein kinase R (p-PKR)], as well as two inflammation-signaling proteins [nuclear factor-&#954;B (NF-kB) and inhibitor &#954;B (IkB)], were measured in newborn brain nuclei [nucleus of the solitary tract (NTS), paraventricular nucleus (PVN), supra-optic nucleus (SON), cortex (CX), striatum nuclei (STR), and medial preoptic nucleus (MPO)] before the first feed (unprimed by colostrum) and after the start of nursing (primed by colostrum). Expression of BiP/GRP78 and p-eIF2a were upregulated in unprimed and downregulated in primed NTS tissue. NF-kB was retained (high) in the CX, STR, and MPO cytoplasm, whereas NF-kB was lower and unchanged in NTS, PVN, and SON in both conditions. The collective BiP and p-eIF2 findings are consistent with a stress response. eIf2a was phosphorylated by dsRNA dependent kinase (p-PKR) in the SON, CX, STR, and MPO. However, in the NTS (and to a lesser extent in PVN), eIf2a was phosphorylated by another kinase, general control nonderepressible-2 kinase (GCN2). The stress-modulating mechanisms previously observed in newborn gut enterocytes appear to be mirrored in some OTR-rich brain regions. The NTS and PVN may utilize a different phosphorylation mechanism (under nutrient deficiency) from other regions and be refractory to the impact of nutrient insufficiency. Collectively, this data suggests that brain responses to nutrient insufficiency stress are offset by signaling from colostrum-primed enterocytes.

Here, we present a protocol to isolate brain nuclei in the neonatal rat brain in conjunction with first colostrum feeding. This technique allows the study of nutrient insufficiency stress in the brain as modulated by enterocyte signaling.

처음 초 유 수 유 전후 개별 Oxytocin 분 비 뇌 핵 신생아 쥐에 있는 염증과 세포 스트레스 평가

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

단일 T 세포또는 면역 학적 단세포 힘 분광학을 위한 단입자를 가진 원자력 현미경 캔틸레버의 기능화

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

세포 분화 및 단일 세포 이미징의 유도

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의 세포 상호 작용 Visualisation 및 부량 Neisseria meningitidis과 인간

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