この研究はマックス・プランク・ソサエティによって支持された。

1.エレクトロコンピテントV.腸炎ビブリオ菌細胞の調製およびスイマー細胞へのプラスミドDNAのエレクトロポレーション注記：プロトコルの次のセクションでは、エレクトロコンピテント細胞の調製とその後のスイマー細胞へのプラスミドDNAのエレクトロポレーションが可能です。蛍光タンパク質がプラスミドから異所的に発現される場合、この工程は重要である。 <ol><li> 100μg/ mLのアンピシリンを含有する新鮮なLB寒天プレート上に-80℃のグリセロールストックからのV.parahaemolyticus細胞をストリークし、37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>翌日、200mLのLB培地にV.parahaemolyticusの単一コロニーを接種し、振盪条件下でOD 600が1.0に達するまで37℃でインキュベートする。それは、細胞培養物が所望の光学濃度に達するために通常5〜6時間のインキュベーションを要する。 </li><li>直ちに細胞を氷上に移し、perf氷上で4℃の予冷した遠心分離機でさらにすべてのステップを行う。 </li><li>細胞を4℃で10分間2,000 x gで収穫する。 </li><li>デカンテーションにより上清を捨て、25mLの氷冷273mMスクロース溶液（pH7.4、KOHで緩衝化した）に細胞ペレットを再懸濁する。 </li><li> 4℃で10分間、2000×gで細胞を再度採取する。さらに2回繰り返します。 </li><li>洗浄した細胞ペレットを400μLの氷冷273mMスクロース溶液に再懸濁する。続いてグリセロールを15％vol / volの最終濃度に添加する。細胞はエレクトロポレーションの準備が完了していますが、後で使用するために-80℃で70μLのアリコートで凍結することもできます。 </li><li>エレクトロポレーションのために、エレクトロコンピテント細胞の70μLアリコートを100〜1,000ngのプラスミドDNAと混合し、混合物を氷冷エレクトロポレーションキュベット（0.2cmの電極ギャップ）に移す。 25μF、2400 V、200Ωの設定でエレクトロポレーションを行います。 </li><li>中断する細胞をLBブロス600μL中のエレクトロポレーションキュベットに入れ、2mLチューブに移し、37℃で3時間振とうしながらインキュベートする。 </li><li>細胞を2,000 xgで5分間遠心し、100μlのLBブロスにペレットを再懸濁する。必要な抗生物質を含む選択的LB寒天プレートに細胞懸濁液を広げ、37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>翌日、コロニー形成についてプレートをチェックする。増殖するコロニーはプラスミド上にコードされた正しい抗生物質耐性遺伝子を保有し、さらなる実験に使用することができる。 </li></ol>スワマー細胞分化誘導注：以下のステップは、V.parahaemolyticusのスワマー細胞のライフサイクルへの分化を誘導する方法、および固体表面上の増殖を刺激する方法を記載する。 <ol><li>スワンミングプレートを調製するために、4mLのハートインフュージョン（HI）寒天を100mLのddH 2 O中に懸濁する。 </li><li>HI寒天溶液を電子レンジで注意深く沸騰させ、粉末が溶解するまで瓶を随時振とうする。 121℃で20分間オートクレーブ処理する。 </li><li>オートクレーブ後、HI寒天を60〜65℃に冷却する。最終濃度50μM（100％エタノール中50mMのストック溶液）に2,2&#39;-ビピリジルを添加する。 4mMの最終濃度（ddH 2 O中の4Mのストック溶液）にCaCl 2を添加する。必要に応じて、抗生物質を溶液に加えてプラスミドを維持する。 注：誘導性プラスミドを使用する場合は、最終濃度に誘導剤を加えてください。 注意：2,2&#39;-ビピリジル：急性毒性（経口、経皮、吸入）。この化学物質を取り扱う際には、手袋および安全ゴーグルを使用する。 </li><li>最後のHI寒天溶液30〜35mLを丸150mmペトリ皿に注ぎ、寒天を凝固させる。 </li><li>細胞培養物をスポッティングする直前に、寒天プレートを37℃で少なくとも10分間乾燥させます（または液体残渣にdisappeared、しかしもはや）右上に開いた蓋があります。 注：乾燥時間は、使用したインキュベーターに大きく依存し、重度に乾燥したプレートは、 腸炎ビブリオの蔓延を許さない 。 （このステップは非常に重要です！）プレートは新しく使用する必要があり、2〜3時間以上経過してはいけません。古いプレートはあまりにも乾燥して群れを刺激することはありません。 </li><li>単一コロニーの端から少量の細胞を5mLのLBブロスに接種する。 OD 600 = 0.8に達するまで37℃で振とう培養物をインキュベートする。通常、約2〜3時間かかる。その後、細胞はHIスウィング寒天プレート上にスポットされる準備が整う。 </li><li> HI寒天プレート（ 図1A ）の中央に細胞培養液1μLをスポットする。 </li><li>スポットを乾燥させる（ 図1B ）。 </li><li>透明なプラスチックテープでプレートを密封し、しっかりと取り付けてください。そうでなければ、一晩のインキュベーション中に取り外す可能性があります（ 図1C ）。 注：これはシールが完璧であることが非常に重要です。適用時にテープに気泡や折れ曲がりが発生しないように注意してください。 </li><li> 24℃で一晩インキュベートする。これにより、鞭毛コロニー（ 図2 ）の周辺部から伸びる群発虫が発生した腸炎ビブリオの群集が形成される。 </li></ol> 3.蛍光顕微鏡用のV.parahaemolyticus Swarmer細胞の調製注：以下のプロトコールは、顕微鏡検査のための単一のスマーマー細胞を得るために、顕微鏡アガローススライドを調製する方法およびアガロースパッド上に猛烈なフレアの続くインプリンティングを記載する。 <ol><li>顕微鏡用アガローススライドを調製するには、20％vol / vol PBSおよび10％vol / vol LBブロス溶液100 mLに1 gのアガロースを加えます。注意深く電子レンジで溶液を沸騰させてアガロースを溶解させ、マグネチックスターラーで混合しながら65〜70℃に冷却します。 </li><li>交流する場所リーン顕微鏡は作業台の完全な水平部分にスライドします。スライドの両端を汎用ラボ用ラベリングテープの2つの層で覆い、スライドを作業台に固定します。 2枚のテープの間隔は3cm程度にしてください。 注：テープの2つの層は、アガロースパッドの高さを決定する非常に小さな標高を作成します。細胞が顕微鏡分析のために同じ平面内にあることを確認するために作業空間が水平であることが重要です。 </li><li>先に調製したアガロース溶液250μLを非被覆ガラス表面上にピペットで入れる。 </li><li> 2番目の顕微鏡スライドを底に1つの上と同じ向きに置き、少し残して残ったアガロースが側面に流れ出るようにします。 </li><li>アガロースを1〜2分間固化させ、次に水平方向の動きで上部ガラススライドを底部ガラススライドからゆっくりと引っ張ります。 </li><li>メスを使用し、メスに付着している残りのアガロースをすべて切り取ってください。顕微鏡スライドの両側をゆっくりとスライドさせ、顕微鏡スライドの端部からテープをゆっくりはずします。 注：アガローススライドはすぐに準備ができており、ゆっくりと乾燥が始まるので、できるだけ早く使用する必要があります。 </li><li>スマーマー細胞で顕微鏡検査を行うには、群集のコロニーの最も外側の端から3mm×10mmのスウォーミング寒天片を切り取ってください（ 図1D ）。スイマーセルを顕微鏡スライドに移す直前まで、スウォームプレートのテープシールを壊さないことは非常に重要です。テープを剥がすと、 鞭毛鞭毛虫細胞はスイマー細胞への分化を開始する。 注：群集の端から外へのカットをコロニーの内側に向けるようにしてください（ 図1D ）。この方法で、群れのコロニーの端に「水泳者の汚染」を防ぐことができます。 </li><li>細胞がアガロースpaに面している顕微鏡アガローススライド上に群れの寒天片を転送d（ 図1E ）。これは、群れの細胞をアガロースパッド上にインプリントする。 </li><li>約30秒待ってから、アガロースパッドから寒天片を注意深く取り除いてください（ 図1F ）。 </li><li>細胞がインプリントされたアガロースパッド上にガラスカバースリップを置く。細胞は顕微鏡検査の準備ができています。 注：スマーマー細胞はゆっくりとスイマー状態への分化を開始するので、スマーマー細胞を直ちにイメージングすることが重要です。 </li></ol> 4.蛍光顕微鏡検査のためのV.parahaemolyticusスイマー細胞培養物の調製注：プロトコールのこのセクションでは、スイマー細胞型で蛍光顕微鏡検査を行うためにV.parahaemolyticusの培養液を調製する方法について説明します。 <ol><li>単一コロニーの端から少量の細胞を5mLのLBブロスに接種する。培養物を37℃で1時間、またはわずかな細胞増殖が見えるようになるまで振とうする。 </li><li>でこの段階は、必要であれば、目的のタンパク質の発現のための誘導剤を添加する。この実施例では、YFP-CheW9の発現を誘導するために、L-アラビノースを0.2％（w / vol）の最終濃度まで添加した。 </li><li>培養物を37℃でさらに2時間振とうさせる。 </li><li>顕微鏡のアガローススライドを準備するために、3.1-3.7のステップに従ってください。 </li><li>アガロースパッドの中央に細胞培養液1μLをスポットし、乾燥するまでインキュベートします。 </li><li>ガラスカバースリップを細胞が見つかったアガロースパッド上に置く。細胞は、蛍光顕微鏡下で画像化する準備が整っている。 </li></ol> 5.画像解析このプロトコルの部分では、画像分析のワークフロー、特に、人口統計解析のための単一細胞の蛍光データの抽出方法について説明します。 <ol><li>画像解析を開始する前に、すべての顕微鏡画像が16ビットTIF形式で保存されていることを確認してください。 </li><li> DIC（または位相コントラスト）および対応する蛍光チャネル画像をソフトウェアにロードします。 </li><li> 「表示/オーバーレイ画像」を選択して、両方のチャンネルのオーバーレイ画像を生成します。画像の数（「＃Images：」）を2に設定し、第1チャンネルのDIC画像と第2チャンネルの蛍光画像を選択します。 </li><li>ツールバーから「マルチライン」ツールを選択し、セルの中央から一方のポールから他方のポールにセルをマーキングします。生成されたすべての線（線オブジェクト）のリストを取得するには、「Measure / Region Measurements」を開きます。領域のラベル、距離、および平均強度のみを表示するように、領域の測定値を設定します。 </li><li> 「測定/キャリブレーション距離」のピクセルサイズを、顕微鏡セットアップに特有のピクセルサイズに較正し、「すべての開いている画像に適用」をクリックします。 </li><li>すべての領域（線オブジェクト）を蛍光チャネル画像に転送します。 「地域/トランスフソース画像（オーバーレイ画像）とデスティネーション画像（蛍光灯画像）を選択し、「すべての領域」を選択して「OK」を押します。 注記：後で正確な線（線オブジェクト、領域、ROI）を再生成するには、「領域/領域の保存」を開いて領域を保存します。 </li><li> &quot;Measure / Region Measurements&quot;を開いて &quot;Open Log&quot;を押して、すべての領域測定値をスプレッドシートにエクスポートします。データを開いてエクスポートすることを確認します。スプレッドシートをバックグラウンドで開くと、最後に &quot;F9：Log Data&quot;を押してデータをエクスポートします。 </li><li> セルに沿って蛍光焦点の位置を決定するには、 &quot;Measure / Linescan&quot;を開きます。セルの全幅が、以前に作成した領域で覆われるように、「線の幅」を値に設定します。ラインスキャングラフを右クリックし、「グラフデータを表示」を選択します。マウスを左クリックしてドラッグすると、ラインスキャンに沿って「Graph Data」ウィンドウには、2点間の対応するピクセル/距離が表示されます。青色の強調表示された行を選択し、内容をコピーします。 注：ラインスキャン強度プロファイル全体は、「ラインスキャン」ウィンドウで「ログデータ」を押すことでスプレッドシートに記録できます。抽出されたデータは、グラフやその他の統計分析での視覚化に使用できます。細胞周期にわたる局在化パターンは、細胞体に沿った細胞長および蛍光強度の人口統計学的表現で容易に視覚化することができる。これらの表現は、前に選択した同じROIを使用して取得できます。以下のステップは、 図3Cおよび4Cに示されるものと同様の人口統計を生成する方法の例を与える。 <ol><li> &quot;Metamorph nd＆ROI files importer&quot;を使用して、ソフトウェアで以前に作成されたフィジー/ ImageJのロード領域マーキング（.rgn）（ステップ5.6）;あるいは、分析される細胞の関心領域（ROI）は、組み込み「セグメント化された線」ツールを使用して、Fiji / ImageJで直接作成することができる。 </li><li> 「Analyze / Tools / ROI manager」を開き、すべてのアクティブなリスト項目をマークします。 </li><li>その後、 &quot;More / Multi Plot&quot;をクリックし、新しい &quot;Multi Plot&quot;ウィンドウで &quot;List&quot;を選択します。テーブルエントリをクリックして、「すべてコピー」を選択します。その後、新しいスプレッドシートに貼り付けます。 注：最も長いセル（対応する2つのXとYの列が最も多くの行を持つ）のデータがスプレッドシートの最後のものであることを確認してください。 </li><li>スプレッドシートを「CSV（カンマ区切り）（* .csv）」として保存します。 </li><li> Rスクリプトはここからダウンロードしてください。 &quot;https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles&quot; 10.スクリプトは長さ別に細胞を分類し、各細胞の蛍光強度の平均としてすべての細胞の蛍光強度プロファイルを正規化しますe。 </li><li> R [バージョン3.0.1のスクリプト &quot;cell profiles function.R&quot;全体を実行します。 11 ]。 </li><li> 30行目の &quot;example plots.R&quot;スクリプトを編集して、ファイルパスが以前に生成された.csvファイルが保存されているフォルダを参照するようにします。さらに、31行目のファイル名 &quot;profile.csv&quot;を、手順5.9.4で生成した.csvファイル用に選択したファイル名に変更します。その後、 &quot;example plots.R&quot;を実行し、 &quot;https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles&quot;のドキュメントとスクリプトファイルのコメントに従って、人口統計解析を生成します。 </li></ol></li></ol>

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	<li>McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+dynamometer+controls+swarmer+cell+differentiation+of+V.+parahaemolyticus.">Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus.</a> Cell. 54 (3), 345-351 (1988).</li><li>Kawagishi, I., Imagawa, M., Imae, Y., McCarter, L., Homma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sodium-driven+polar+flagellar+motor+of+marine+Vibrio+as+the+mechanosensor+that+regulates+lateral+flagellar+expression.">The sodium-driven polar flagellar motor of marine Vibrio as the mechanosensor that regulates lateral flagellar expression.</a> Mol. Microbiol. 20 (4), 693-699 (1996).</li><li>Ulitzur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+swarming+in+Vibrio+parahaemolyticus.">Induction of swarming in Vibrio parahaemolyticus.</a> Arch. Microbiol. 101 (4), 357-363 (1974).</li><li>Ulitzur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+temperature,+salts,+pH,+and+other+factors+on+the+development+of+peritrichous+flagella+in+Vibrio+alginolyticus.">Effect of temperature, salts, pH, and other factors on the development of peritrichous flagella in Vibrio alginolyticus.</a> Arch. Microbiol. 104 (3), 285-288 (1975).</li><li>Ulitzur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+swarming+of+Vibrio+alginolyticus.">The mechanism of swarming of Vibrio alginolyticus.</a> Arch. Microbiol. 104 (1), 67-71 (1975).</li><li>Gode-Potratz, C. J., Chodur, D. M., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+iron+regulate+swarming+and+type+III+secretion+in+Vibrio+parahaemolyticus.">Calcium and iron regulate swarming and type III secretion in Vibrio parahaemolyticus.</a> J. Bacteriol. 192 (22), 6025-6038 (2010).</li><li>McCarter, L., Silverman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+regulation+of+swarmer+cell+differentiation+of+Vibrio+parahaemolyticus.">Iron regulation of swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus.</a> J. Bacteriol. 171 (2), 731-736 (1989).</li><li>Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+sensing+in+Vibrio+parahaemolyticus+triggers+a+programme+of+gene+expression+that+promotes+colonization+and+virulence.">Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence.</a> Mol. Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).</li><li>Heering, J., Ringgaard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Localization+of+Chemotactic+Signaling+Arrays+during+the+Lifecycle+of+Vibrio+parahaemolyticus.">Differential Localization of Chemotactic Signaling Arrays during the Lifecycle of Vibrio parahaemolyticus.</a> Front Microbiol. 7 (November), 1-12 (2016).</li><li>Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidoglycan+synthesis+machinery+in+Agrobacterium+tumefaciens+during+unipolar+growth+and+cell+division.">Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division.</a> mBio. 5 (3), (2014).</li><li>Development Core Team, R. F. F. S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R:+A+Language+and+Environment+for+Statistical+Computing.">R: A Language and Environment for Statistical Computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. 1, 2673 (2008).</li><li>Ringgaard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ParP+prevents+dissociation+of+CheA+from+chemotactic+signaling+arrays+and+tethers+them+to+a+polar+anchor.">ParP prevents dissociation of CheA from chemotactic signaling arrays and tethers them to a polar anchor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (2), E255-E264 (2014).</li><li>Ringgaard, S., Schirner, K., Davis, B. M., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+of+ParA-like+ATPases+promotes+cell+pole+maturation+by+facilitating+polar+localization+of+chemotaxis+proteins.">A family of ParA-like ATPases promotes cell pole maturation by facilitating polar localization of chemotaxis proteins.</a> Genes Dev. 25, 1544-1555 (2011).</li><li>Vischer, N. O. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+age+dependent+concentration+of+Escherichia+coli+divisome+proteins+analyzed+with+ImageJ+and+ObjectJ.">Cell age dependent concentration of Escherichia coli divisome proteins analyzed with ImageJ and ObjectJ.</a> Front Microbiol. 6 (JUN), (2015).</li><li>Schneider, C. a., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics.">High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Mol. Microbiol. 80 (3), 612-627 (2011).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nat. Microbiol. 1, 16077 (2016).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+Imaging,+and+Quantification+of+Bacterial+Surface+Motility+Assays.">Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays.</a> J. Vis. Exp. (98), e52338 (2015).</li><li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oufti:+An+integrated+software+package+for+high-accuracy,+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis.">Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Mol. Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).</li><li>de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+Automated+Time-lapse+Microscopy.">Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (53), e1-e6 (2011).</li></ol>

利害の衝突は宣言されていない。

本稿では、 V. parahaemolyticus swarmer細胞の顕微鏡画像化方法とそれに続く下流分析を用いて、細胞内局在および研究された蛍光標識タンパク質の他の特徴を解明および定量する方法を報告する。顕微鏡検査画像処理および分析のためのいくつかのツールが存在するが、V.parahaemolyticusスウォーム細胞の分析は、大部分が高密度細胞集団内に通常存在し、細胞長の変動が大きいために依然とし...

細菌は、常に外部環境の変化を経験し、それに応じて行動を変化させ適応させるためのいくつかの技術を開発してきた。そのような機構の1つは、変化した環境をよりよく補う別個の細胞型への分化を含む。分化は、しばしば、細胞周期の調節、細胞形態学、および細胞の時空間組織化における主要な変化を伴う。分化を受けることができる1つの生物は、腸炎ビブリオである 。 V.parahaemolyticusはVibrionaceaeに属し、これは通常新鮮なまたは塩水に棲むプロテオバクテリアのファミリーである。 Vibrionaceaeは環境に広く分布しており、Vibrio cholerae.Vを含むヒトに腸管感染を引き起こすいくつかの種を含む。腸炎菌は二形性生物であり、その変化に対応するための応答として2つの異なる細胞型に分化することができる外部環境。水性環境では、それは古い棒状のスイマー細胞として存在し、単一の極性鞭毛が古い細胞極に位置する。表面が接触すると、スマーマーセルへの分化が引き起こされる。スワマー細胞の分化には、2つの大きな変化が含まれる：細胞分裂の阻害によるスワマー細胞の形態形成、および第2の鞭毛系の誘導。この結果、蠕虫状の非常に細長い棒状のスマーマー細胞が形成され、スマーマーライフスタイルを続けることができ、分裂イベントは後代のスマーマー細胞を生じるか、または代わりにスイマー細胞に分化する。 スウォーマーの分化を誘導または影響するいくつかの因子が報告されている。一次刺激は、 V.腸炎菌が表面接触時の回転の阻害を検出する触覚センサとして極性鞭毛を使用するメカノセンシングによって駆動されると思われるが、他のいくつかの要因がウェル1 。実験室では、フェナミルを添加することにより、極性鞭毛の回転を人為的に阻害することができます。フェナミルは、ナトリウムチャネル駆動の鞭毛回転を阻止し、それによりスワマー分化を誘発します2 。さらに、初期の研究では、細胞を透明なプラスチックテープでシールしたペトリ皿中で増殖培地上で増殖させると、 ビブリオ・アルギノリチカスは固体培地上に集まるように誘導された。アルカリ性の濾紙は、これらの条件下での群れを防ぎ、したがって、1つまたは複数の揮発性酸が群れ誘導に関与している可能性があることを示唆している。従って、プラスチックテープでペトリ皿を密封することは、プレートのヘッドスペース内で、細胞代謝の副生成物として形成される揮発性酸の蓄積を可能にする可能性が高い。培地成分を加水分解することによって人工的に揮発性酸を生成するために、シールされていないペトリ皿中で増殖培地にH 2 O 2を添加した場合にも同じ効果が達成された<supclass = &quot;xref&quot;&gt; 3、4、5。それにもかかわらず、このような揮発性酸のアイデンティティは未知のままである。さらに、カルシウム6および鉄制限7の過剰な利用は、固体表面上のスマーマー分化および増殖を促進することが示されている。化合物2,2&#39;-ビピリジルをスウォーマー分化に影響することが示されている増殖培地に添加することにより、細胞を鉄で飢えさせることができる8 。分化を調節することが知られている因子は、スワマー細胞への腸炎ビブリオ寄生虫の分化および固体寒天表面上でのそれらの増殖を再現可能に誘導するプロトコールの設計において現在実施されている。 V.腸炎ビブリオの分化は、細胞分裂、細胞形態の調節、および鞭毛のような巨大分子機械の配置における主要な変化を伴うaおよび走化性装置 - 細胞周期に従ってタンパク質の特異的局在を必要とするプロセス。従って、このようなタンパク質の細胞内局在を研究する能力は、前述の細胞プロセスの理解に必須である。そのような研究を行うためには、単一細胞に対する蛍光顕微鏡法が必要である。これは、スマーマー細胞の場合のように、高密度細菌集団内に存在する細胞を画像化する場合に特に困難であり得る。顕微鏡検査のために単一細胞を潜在的に生成する可能性がある液体培地中のスマーマー分化を誘導する試みがなされている。そして、転写レベルでは、これらの細胞は部分的にスワマー分化プログラムを誘導したが、固体培地上で増殖させた完全に分化したスマーマー細胞と同じ形態変化を受けなかった8 。この論文は、スワーマーを誘発する方法の堅牢で再現性のあるプロトコルを提供する寒天表面での分化。プロトコールは、単一細胞顕微鏡法およびその後の分析のために容易に入手可能な容易に入手可能なスマーマー細胞の集団を産生する。さらに、このプロトコールは、スイマー細胞およびスワマー細胞型（セクション1,2,3,4）の両方において蛍光標識タンパク質の局在化研究を可能にする。さらに、このプロトコルは、細菌顕微鏡の人口統計的分析を可能にする蛍光顕微鏡検査（セクション5）から生成されたデータを処理および分析する方法に関する後続のワークフローを記述する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Media components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-medium</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X968.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar, granulated</td>
			<td>BD</td>
			<td>214510</td>
			<td>For preparation of LB agar with LB-medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Heart Infusion Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>244400</td>
			<td>For preparation of HI agar swarming plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose NEEO, ultra quality</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2267.3</td>
			<td>For preparation of microscopy agarose pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additives</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5118.3</td>
			<td>Used to induce pBAD derivatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2`-Bipyridyl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D216305-25G</td>
			<td>For preparation of HI agar swarming plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.1</td>
			<td>For preparation of HI agar swarming plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K029.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3886.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Standard recipe for Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+) Sucrose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td>For preparation of electrocompetent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.5</td>
			<td>For preparation of electrocompetent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 150x20mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td>For preparation of HI agar swarming plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kelvitron t (B 6420)</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>-</td>
			<td>Used for drying HI agar swarming plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Microbial System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652662</td>
			<td>Used for elctroporation of plasmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph Offline (version 7.7.5.0)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td>Used for microscopy image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>Used for microscopy data analsis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of cellular differentiation and single cell imaging of vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells

タンパク質の細胞内局在を研究する能力は、多くの細胞プロセスの理解に不可欠です。これは、蛍光顕微鏡検査のための単一細胞を得る能力を必要とし、細菌集団内に存在する細胞を画像化する場合に特に困難であり得る。例えば、ヒト病原体Vibrio parahaemolyticusは、表面接触時に固体表面上での増殖に特化した非常に細長いスマーマー細胞の亜集団に分化する液体状態の短い棒状のスイマー細胞として存在する。本稿では、 V.parahaemolyticusの 2つの異なる状態における単一細胞蛍光顕微鏡分析を行う方法を提示する。このプロトコールは、V.parahaemolyticusのスワマー細胞ライフサイクルへの分化を非常に再現性よく誘導し、固体表面上でのそれらの増殖を促進する。この方法は、tから伸びる分化したスマーマー細胞のフレアを生成する群れコロニーの縁である。注目すべきは、群れのフレアの先端では、スワマー細胞が細胞の単一層内に存在し、顕微鏡スライドおよびその後の単一細胞の蛍光顕微鏡画像化への容易な移行が可能になることである。さらに、細菌学の人口学的表現のための画像分析のワークフローが提示されている。原理の証明として、V.parahaemolyticusのスイマーおよびスマーマー細胞における走化性シグナル伝達アレイの細胞内局在の分析が記載されている。

集団コロニーの分化誘導 図1は、 V.parahaemolyticus （ 図1A〜C）の 鞭打ちコロニーを産生することに関与する重要なステップのスキーマを提供する。スイマー培養物を群寒天にスポットし、24℃でインキュベートし、固体寒天表面上のスマーマー分化および増殖を誘導した。群れたコロニー...

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Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

このプロトコールは、差異的に異なる腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）スイマーおよびスマーマー細胞の単一細胞顕微鏡検査を可能にする。この方法は、単細胞分析のために容易に入手可能なスマーマー細胞の集団を産生し、細胞培養の調製、スマーマー分化の誘導、試料調製および画像分析を包含する。

細胞分化および単細胞イメージングの誘導<em&gt;腸炎ビブリオ</em&gt;スイマーとスマーマー細胞

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

induction-cellular-differentiation-single-cell-imaging-vibrio

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

9.3K ビュー.  Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology. このプロトコールは、差異的に異なる腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）スイマーおよびスマーマー細胞の単一細胞顕微鏡検査を可能にする。この方法は、単細胞分析のために容易に入手可能なスマーマー細胞の集団を産生し、細胞培養の調製、スマーマー分化の誘導、試料調製および画像分析を包含する。 

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Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an effective invasin for human epithelial and endothelial cells. We have identified endothelial surface-located integrins as major receptors for Opc, a process which requires Opc to first bind to integrin ligands such as vitronectin and via these to the cell-expressed receptors1. This process leads to bacterial invasion of endothelial cells2. More recently, we observed an interaction of Opc with a 100kDa protein found in whole cell lysates of human cells3. We initially observed this interaction when host cell proteins separated by electrophoresis and blotted on to nitrocellulose were overlaid with Opc-expressing Nm. The interaction was direct and did not involve intermediate molecules. By mass spectrometry, we established the identity of the protein as &alpha;-actinin. As no surface expressed &alpha;-actinin was found on any of the eight cell lines examined, and as Opc interactions with endothelial cells in the presence of serum lead to bacterial entry into the target cells, we examined the possibility of the two proteins interacting intracellularly. For this, cultured human brain microvascular endothelial cells (HBMECs) were infected with Opc-expressing Nm for extended periods and the locations of internalised bacteria and &alpha;-actinin were examined by confocal microscopy. We observed time-dependent increase in colocalisation of Nm with the cytoskeletal protein, which was considerable after an eight hour period of bacterial internalisation. In addition, the use of quantitative imaging software enabled us to obtain a relative measure of the colocalisation of Nm with &alpha;-actinin and other cytoskeletal proteins. Here we present a protocol for visualisation and quantification of the colocalisation of the bacterium with intracellular proteins after bacterial entry into human endothelial cells, although the procedure is also applicable to human epithelial cells.

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &#945;-actinin by Confocal Imaging

Neisseria meningitidis (Nm), a gram negative human-specific respiratory pathogen, can bind to human &alpha;-actinin. Here we present a protocol for visualisation of colocalisation of the bacterium with intracellular &alpha;-actinin after bacterial entry into human brain microvascular endothelial cells (HBMECs).

の細胞内相互作用の可視化と定量化髄膜炎菌</em共焦点イメージングによるα-アクチニン>と人間

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

免疫・感染学

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no fitness consequence (commensal), or be beneficial (mutualistic). While much attention has been given to pathogenic interactions, little is known about the processes that dictate the reproducible acquisition of beneficial/commensal bacteria from the environment. The light-organ mutualism between the marine Gram-negative bacterium V. fischeri and the Hawaiian bobtail squid, E. scolopes, represents a highly specific interaction in which one host (E. scolopes) establishes a symbiotic relationship with only one bacterial species (V. fischeri) throughout the course of its lifetime6,7. Bioluminescence produced by V. fischeri during this interaction provides an anti-predatory benefit to E. scolopes during nocturnal activities8,9, while the nutrient-rich host tissue provides V. fischeri with a protected niche10. During each host generation, this relationship is recapitulated, thus representing a predictable process that can be assessed in detail at various stages of symbiotic development. In the laboratory, the juvenile squid hatch aposymbiotically (uncolonized), and, if collected within the first 30-60 minutes and transferred to symbiont-free water, cannot be colonized except by the experimental inoculum6. This interaction thus provides a useful model system in which to assess the individual steps that lead to specific acquisition of a symbiotic microbe from the environment11,12.
Here we describe a method to assess the degree of colonization that occurs when newly hatched aposymbiotic E. scolopes are exposed to (artificial) seawater containing V. fischeri. This simple assay describes inoculation, natural infection, and recovery of the bacterial symbiont from the nascent light organ of E. scolopes. Care is taken to provide a consistent environment for the animals during symbiotic development, especially with regard to water quality and light cues. Methods to characterize the symbiotic population described include (1) measurement of bacterially-derived bioluminescence, and (2) direct colony counting of recovered symbionts.

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

The method outlines the procedure by which the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes and its bacterial symbiont, Vibrio fischeri, are raised separately and then introduced to allow for specific colonization of the squid light organ by the bacteria. Colonization detection by bacterially-derived luminescence and by direct colony counting are described.

の植民地化 Euprymna scolopesイカでビブリオフィシャリ</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T細胞の定量的なハイスループットシングルセル細胞毒性アッセイ

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

の臨床応用<em&gt;眠れる森の美女</em遺伝的に末梢及び臍帯血由来のT細胞を変更する&gt;と人工抗原提示細胞

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

離とナイーブCD4 Tリンパ球のTh17分化

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the majority of Vibrio-associated infections. Thus, accurate differentiation among Vibrio spp. and detection of V. parahaemolyticus is critically important to ensure the safety of our food supply. Although molecular techniques are increasingly common, culture-depending methods are still routinely done and they are considered standard methods in certain circumstances. Hence, a novel chromogenic agar medium was tested with the goal of providing a better method for isolation and differentiation of clinically relevant Vibrio spp. The protocol compared the sensitivity, specificity and detection limit for the detection of V. parahaemolyticus between the new chromogenic medium and a conventional medium. Various V. parahaemolyticus strains (n=22) representing diverse serotypes and source of origins were used. They were previously identified by Food and Drug Administration (FDA) and Centers for Disease Control and Prevention (CDC), and further verified in our laboratory by tlh-PCR. In at least four separate trials, these strains were inoculated on the chromogenic agar and thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS) agar, which is the recommended medium for culturing this species, followed by incubation at 35-37 &#176;C for 24-96 hr. Three V. parahaemolyticus strains (13.6%) did not grow optimally on TCBS, nonetheless exhibited green colonies if there was growth. Two strains (9.1%) did not yield the expected cyan colonies on the chromogenic agar. Non-V. parahaemolyticus strains (n=32) were also tested to determine the specificity of the chromogenic agar. Among these strains, 31 did not grow or exhibited other colony morphologies. The mean recovery of V. parahaemolyticus on the chromogenic agar was ~96.4% relative to tryptic soy agar supplemented with 2% NaCl. In conclusion, the new chromogenic agar is an effective medium to detect V. parahaemolyticus and to differentiate it from other vibrios.

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

の検出のためのより高感度で特異的な発色性寒天培地の開発<em&gt;腸炎ビブリオ</em&gt;その他<em&gt;ビブリオ</em&gt;種

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.

madSTORMを用いたT細胞の高度に多重化された超解像イメージング

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression of proteins known to respond to metabolic stress was measured in brain-nuclei isolates using Western blotting. This was done to assess whether metabolic stress-induced nutrient insufficiency in the body triggered neuronal stress. We have previously demonstrated that nutrient insufficiency in neonates elicits metabolic stress in the gut. Furthermore, colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi prior to and after first feed. Signaling protein markers associated with the endoplasmic reticulum stress [ER chaperone binding immunoglobulin protein (BiP), eukaryotic translation initiation factor 2A (eIF2a), and eIF2a kinase protein kinase R (p-PKR)], as well as two inflammation-signaling proteins [nuclear factor-&#954;B (NF-kB) and inhibitor &#954;B (IkB)], were measured in newborn brain nuclei [nucleus of the solitary tract (NTS), paraventricular nucleus (PVN), supra-optic nucleus (SON), cortex (CX), striatum nuclei (STR), and medial preoptic nucleus (MPO)] before the first feed (unprimed by colostrum) and after the start of nursing (primed by colostrum). Expression of BiP/GRP78 and p-eIF2a were upregulated in unprimed and downregulated in primed NTS tissue. NF-kB was retained (high) in the CX, STR, and MPO cytoplasm, whereas NF-kB was lower and unchanged in NTS, PVN, and SON in both conditions. The collective BiP and p-eIF2 findings are consistent with a stress response. eIf2a was phosphorylated by dsRNA dependent kinase (p-PKR) in the SON, CX, STR, and MPO. However, in the NTS (and to a lesser extent in PVN), eIf2a was phosphorylated by another kinase, general control nonderepressible-2 kinase (GCN2). The stress-modulating mechanisms previously observed in newborn gut enterocytes appear to be mirrored in some OTR-rich brain regions. The NTS and PVN may utilize a different phosphorylation mechanism (under nutrient deficiency) from other regions and be refractory to the impact of nutrient insufficiency. Collectively, this data suggests that brain responses to nutrient insufficiency stress are offset by signaling from colostrum-primed enterocytes.

Here, we present a protocol to isolate brain nuclei in the neonatal rat brain in conjunction with first colostrum feeding. This technique allows the study of nutrient insufficiency stress in the brain as modulated by enterocyte signaling.

前に、最初の初乳の授乳後細胞ストレスと新生児ラットにおける離散のオキシトシン分泌脳核の炎症を評価します。

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

免疫学的単一細胞力分光法のための単一T細胞または単一粒子による原子間力顕微鏡片持ちの機能化

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

細胞分化および単細胞イメージングの誘導

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