Fuji ImageJ Clock Scan 플러그인 버전을 우리와 공유하고이 프로그램 버전을 개발하도록 고무시켜 준 Tanja Maritzen 박사와 Fabian Feutlinske 박사 (Leibniz Institute of Molecular Pharmacology, Berlin, Germany)에게 감사드립니다. 우리는 또한 플 뢰즈 멜 처 박사 (Max Plck Institute for Infection Biology) 림프구 개발 부서 (Department of Fritz Melchers)에게 플러그인 테스트 및 개선 목적으로 그의 부서의 데이터베이스에서 이미지를 사용하는 것에 대한 허락감에 감사드립니다. 지원 : Translational Neurosciences 센터; NIH 교부금 : P30-GM110702-03.

1. 소프트웨어 설치 <ol><li> 번들로 제공되는 Java 및 ImageJ 또는 Fiji ImageJ의 최신 버전을 각 웹 사이트에 권장대로 설치하십시오 (해당 웹 사이트 링크는 자료 표 참조). 아래 텍스트에서 두 프로그램을 모두 &quot;ImageJ&quot;라고합니다. </li><li> Materials 테이블에 제공된 링크를 사용하여 &quot;Clock_Scan-1.0.1. jar&quot;및 &quot;Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar&quot;플러그인 파일을 복사하여 ImageJ 플러그인 디렉토리에 붙여 넣으십시오. 또는 &quot;플러그인 | 플러그인 설치&quot;메뉴 옵션을 사용하여 파일을 컴퓨터 하드 드라이브에 저장 한 후에 설치하십시오. </li></ol> 2. 클록 스캔 분석 <ol><li> 표준 클럭 스캔 플러그인 ( 그림 1 ) : <ol><li> ImageJ &quot;File | Open&quot;메뉴 명령을 사용하여 관심있는 이미지를 엽니 다. </li><li> &#39;다각형&#39;도구 또는 &#39;세그먼트 선 선택&#39;을 클릭하십시오.도구를 선택한 다음 이미지 위에 그려 전체 ROI 또는이 영역의 세그먼트를 윤곽으로 나타냅니다. 다각형 선택의 예는 그림 1A 를 참조하십시오 (내부 파선 테두리). 참고 : 소프트웨어에서 사용할 수있는 기타 선택 도구 (직사각형, 타원형 및 프리 핸드 라인 선택)도 사용할 수 있습니다. </li><li> 메뉴에서 &quot;Plugins | Clock Scan&quot;을 선택하여 표준 클럭 스캔 프로토콜 팝업 옵션 창을 엽니 다. 이 명령은 개요가 자동으로 추가 된 ROI 관리자 창을 엽니 다. </li><li> 플러그인 옵션 창을 사용하여 다음을 수행하십시오. <ol><li> 스크롤 막대를 사용하거나 해당 입력 상자의 값을 변경하여 ROI 센터의 X 및 Y 좌표 (물리적으로 매스 센터의 좌표로 자동 계산 됨)를 검토하고 변경하십시오. 그림 1B 참조. </li><li> 객체의 바깥 쪽 배경 영역의 양에 따라스캔으로 덮히려면 &quot;스캔 제한&quot;스크롤 막대를 사용하여 스캔 제한을 조정하십시오. 그림 1A를 참조하십시오. 참고 : 스캔 제한은 주어진 방향에서 개체의 경계를 넘어서 스캔이 진행되어야하는 거리를 나타내는 분수입니다. 기본값은 스캔 길이가 스캔 방향의 오브젝트 반경보다 20 % 길다는 것을 나타내는 1.20입니다. 도 1a , 바깥 쪽 점선 참조). </li><li> &quot;실제 반지름&quot;, &quot;배경 빼기&quot;, &quot;극좌표 변환&quot;및 / 또는 &quot;표준 편차가있는 플롯&quot;확인란을 사용하여 플러그인의 출력을 수정하십시오. </li><li> &quot;확인&quot;을 클릭하여 플러그인을 실행하십시오. 그림 1 C-H를 참조하십시오. 참고 : &quot;표준 편차&quot;및 &quot;극좌표 변환&quot;또는 &quot;실제 반경&quot;및 &quot;극좌표 변환&quot;을 사용하는 프로토콜 출력의 예(SD) 값은 대상의 방사형 픽셀 강도 스캔 사이의 차이를 나타냅니다. 또한 &quot;ROI 선택&quot;에 유의하십시오. 또한 &quot;ROI&quot;선택 사항은 그림 1C 및 1D 와 그림 1E 및 1F 에 각각 표시됩니다. 픽셀 단위로 측정 된 ROI 개요 길이에 대한 정보를 표시하는 플러그인 창에서 &quot;길이&quot;행을 선택합니다. </li></ol></li><li> 생성 된 &quot;Clock Scan Profile Plot&quot;에서 &quot;List&quot;명령을 사용하여 그레이 스케일 이미지의 X, Y 열 두 개와 RGB 이미지의 X 및 Y 열 데이터에 표시된 값을 플롯합니다.이 중 Y0, Y1, Y2 및 Y3 열은 정수 및 개별 (빨강, 녹색 및 파랑) 색상 채널 픽셀 강도 값으로 채워집니다. </li></ol></li><li> 다중 ROI 클록 스캔 플러그인 - 다중 ROI ( <strongclass = &quot;xfig&quot;&gt; 그림 2 ) : <ol><li> ROI가 여러 개인 이미지를 엽니 다. </li><li> &quot;Analyze | Tools | ROI Manager&quot;를 클릭하여 ROI 관리자를 엽니 다. </li><li> 순차적으로 개요 (단계 2.1.2 참조)하고 ROI 관리자 창에서 &quot;추가&quot;를 클릭하여 ROI 관리자에 각 ROI를 추가하십시오. 이미지 내의 모든 ROI에 대해이 작업을 수행하십시오. ROI 메트릭이 중요한 경우 &quot;Analyze | Measure&quot;명령을 사용하십시오. <ol><li> 다중 분할 라인 선택의 예는 그림 2A 를, 다중 다각형 선택의 예는 그림 2E를 참조 하십시오. </li></ol></li><li> &quot;Plugins&quot;메뉴에서 &quot;Multi Clock Scan&quot;을 선택하여 프로토콜 옵션 팝업 창을 엽니 다. </li><li> 프로토콜 옵션 창을 사용하여 다음을 수행하십시오. <ol><li> 필요한 경우 단계 2.1.4.2에 따라 스캔 제한을 재설정하십시오. 기본값은 1.20입니다. </li><li> 필요한 경우 opt를 선택하십시오.표준 편차로 플롯 (Plot with Standard Deviation) &quot;상자를 선택하여 SD 막대를 사용하여 평균 클록 스캔 프로파일을 플롯합니다. 그림 2 C 와 D를 참조하십시오. 참고 : 계산 된 SD 값은 서로 다른 물체의 적분 클럭 스캔 프로파일 간의 편차를 나타냅니다. 또한 플러그인 창에서 &quot;선택한 ROI 수&quot;에 대한 정보가 표시된 행을 기록하십시오. </li><li> &quot;확인&quot;을 클릭하여 프로토콜을 실행하십시오. </li></ol></li><li> 생성 된 &quot;Clock Scan Profile Plot&quot;에서 &quot;List&quot;명령을 사용하여 &quot;Plot Values&quot;창에 표시된 값을 플로팅하십시오. 컬러 채널 별 열 지정에 대해서는 &quot;멀티 클록 스캔 프로파일 플롯&quot;창 범례를 참조하십시오. </li><li> ROI에는 번호가 매겨지고 주어진 컬러 채널에 대한 클록 스캔 프로파일은 ROI가 윤곽이 그어지고 ROI 관리자에 추가 된 순서와 동일한 순서로 그려집니다. </li></ol></li><li> 멀ROI 클럭 스캔 플러그인 - 이미지 스택 작업 ( 그림 3 ) : <ol><li> 관심있는 이미지 스택을 엽니 다. </li><li> &quot;Analyze | Tools | ROI Manager&quot;를 클릭하여 ROI 관리자를 엽니 다. </li><li> 스택 내의 이미지의 ROI를 요약하고 2.1.2 및 2.2.3 단계에서 설명한대로 ROI 관리자에 추가하십시오. ROI 메트릭에 관심이 있다면 &quot;Analyze | Measure&quot;명령을 사용하십시오. </li><li> &quot;Plugins&quot;메뉴에서 &quot;Multi Clock Scan&quot;을 선택하여 프로토콜 옵션 팝업 창을 엽니 다. </li><li> 프로토콜 옵션 창을 사용하여 다음을 수행하십시오. <ol><li> 단계 2.1.4.2에서 설명한대로 스캔 제한을 재설정하십시오. 기본값은 1.20입니다. </li><li> &#39;표준 편차로 플롯 (Plot with Standard Deviation)&#39;상자를 선택하여 SD 막대가있는 평균 시계 스캔 프로파일을 플롯하는 옵션을 선택하십시오. 참고 : 계산 된 SD 값은 이미지 sta에서 선택한 오브젝트의 서로 다른 인스턴스 간 차이를 나타냅니다ck. 또한, &quot;스택의 이미지 수&quot;에 대한 정보를 표시하는 플러그인 창에서 라인을 주목하십시오. </li><li> &quot;확인&quot;을 클릭하여 프로토콜을 실행하십시오. </li></ol></li><li> &quot;Clock Scan Profile Plot&quot;창에서 &quot;Plot Values&quot;창에 표시된 값을 플롯하려면 &quot;List&quot;를 클릭하십시오. 여기서 Y 열 번호는 스택 내의 이미지 위치를 나타냅니다 (1). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Dobretsov, M., Romanovsky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Clock-scan"+protocol+for+image+analysis.">"Clock-scan" protocol for image analysis.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 291, 869-879 (2006).</li><li>Feutlinske, F., Browarski, M., Ku, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stonin1+mediates+endocytosis+of+the+proteoglycan+NG2+and+regulates+focal+adhesion+dynamics+and+cell+motility.">Stonin1 mediates endocytosis of the proteoglycan NG2 and regulates focal adhesion dynamics and cell motility.</a> Nat Commun. 6, 8535 (2015).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Dobretsov, M., Hastings, S. L., Stimers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-uniform+expression+of+alpha+subunit+isoforms+of+the+Na+/K++pump+in+rat+dorsal+root+ganglia+neurons.">Non-uniform expression of alpha subunit isoforms of the Na+/K+ pump in rat dorsal root ganglia neurons.</a> Brain Res. 821, 212-217 (1999).</li><li>Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+patch+clamp+recording+and+calcium+imaging+of+neurons+in+the+intact+dorsal+root+ganglion+in+rats.">An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats.</a> J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).</li><li>Dobretsov, M., Pierce, D., Light, K. E., Kockara, N. T., Kozhemyakin, M., Wight, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mouse+model+to+selectively+identify+alpha3+Na,K-ATPase+expressing+cells+in+the+nervous+system.">Transgenic mouse model to selectively identify alpha3 Na,K-ATPase expressing cells in the nervous system.</a> Society for Neuroscience. , 1 (2015).</li><li>Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., Ao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445, 168-176 (2007).</li><li>Romanovsky, D., Mrak, R. E., Dobretsov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+decline+in+density+of+human+nerve+and+spinal+ganglia+neurons+expressing+the+alpha3+isoform+of+Na/K-ATPase.">Age-dependent decline in density of human nerve and spinal ganglia neurons expressing the alpha3 isoform of Na/K-ATPase.</a> Neuroscience. 310, 342-353 (2015).</li><li>Campbell, J., Singh, D., Hollett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+selective+photoconductive+stimulation+of+live+neurons.">Spatially selective photoconductive stimulation of live neurons.</a> Front Cell Neurosci. 8, 142 (2014).</li><li>Yuryev, M., Pellegrino, C., Jokinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Calcium+Imaging+of+Evoked+Calcium+Waves+in+the+Embryonic+Cortex.">In vivo Calcium Imaging of Evoked Calcium Waves in the Embryonic Cortex.</a> Front Cell Neurosci. 9, 500 (2015).</li><li>Qiao, M., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Method+for+Labeling+Electrically+Coupled+Cells:+Application+to+Retina.">Genetic Method for Labeling Electrically Coupled Cells: Application to Retina.</a> Front Mol Neurosci. 8, 81 (2015).</li></ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해 관계 또는 다른 이해 상충이 없다고 선언합니다.

클럭 스캔 프로토콜 : 클록 스캔 프로토콜은 이미지 분석의 빠르고 간단한 도구입니다. 선형 픽셀 강도 스캔 또는 ROI의 평균 픽셀 강도 계산과 같은 기존의 일반적인 이미지 분석 방법과 비교하여이 프로토콜의 이점은 이전 출판물 1 , 9 에 자세히 설명되어 있습니다. 간단히 말해서,이 프로토콜은 물체의 경계선과 같은 ROI 중심으로부터 다?...

이 작업의 목표는이 유형의 이미지 분석에 관심이있는 모든 연구원이 플랫폼없이 무료로 사용할 수있는 클록 스캔 프로토콜을 제시하는 것입니다. 클럭 스캔 프로토콜은 2006 년 1 월에 개발되었으며 볼록형 관심 영역 (ROI) 내에서 기존의 픽셀 강도 정량화 방법을 개선하기위한 목적으로 개발되었습니다.이 방법은보다 우수한 통합 용량과 향상된 공간 해상도를 제공합니다. 수집하는 동안 프로토콜은 &quot;배경&quot;픽셀 강도를 측정 할 목적으로 ROI 센터에서 경계까지 스캔 한 여러 방사형 픽셀 강도 프로파일 또는 ROI 외부의 미리 결정된 거리를 순차적으로 수집합니다. 프로토콜은 스캔 방향으로 측정 된 셀 반경에 따라 이러한 프로파일의 크기를 조정합니다. 따라서 각 개별 방사형 스캔의 중심에서 ROI 경계까지의 거리는 항상 X 축의 100 %입니다. 마지막으로,이 프로그램은이 Individualu1 개의 통합 된 방사형 픽셀 - 강도 프로파일로 프로파일 링된다. 스케일링 때문에 &quot;클럭 스캔&quot;프로토콜에 의해 생성 된 평균 픽셀 강도 프로필은 ROI 크기 나 ROI 모양에 대한 합리적인 범위 내에서도 결정되지 않습니다. 이 방법을 사용하면 다른 ROI의 프로파일을 직접 비교하거나 필요할 경우 평균화 또는 뺄셈을 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 물체 외부에 위치한 픽셀의 평균 강도를 간단히 뺄셈하여 배경 잡음에 대한 모든 물체의 적분 픽셀 강도 프로파일을 수정할 수있게합니다. 그것은 생물학적 샘플에서만 테스트되었지만, 우리의 프로토콜은 원점 (point source)에서 물질의 확산과 같은 물리적 또는 화학적 프로세스의 이미지를 연구하는 데 사용되는 기존의 다른 이미지 분석 도구에 가치있는 추가 기능을 제공합니다 ) 1 . 그러나 원본 이미지 분석 방법의 주요 한계는 프로토콜이비주얼 베이직 6 (VB6) (코드, 따라서 플랫폼에 따라 다르고 배포하기가 어려웠습니다 (VB6 필요).)이 문제를 해결하고 다른 수사관 2 와 비슷한 최근의 노력에 동참하기 위해 VB6 클록 스캔 프로그램 코드를 NIH가 후원하고 자유롭게 사용할 수있는 오픈 소스 및 플랫폼 독립적 인 이미지 분석 프로그램 인 ImageJ 3 및 Fiji ImageJ 4 와 호환되는 두 개의 Java 기반 플러그인으로 통합 할 수 있습니다. 여러 개의 ROI와 이미지 스택을 처리하기위한 원래의 프로토콜을 사용하는 것이 좋습니다. 많은 이미지 분석 애플리케이션은 여러 객체의 통계 분석을 수행하는 것과 관련하여 사용자 친화적이지 않으므로 종종 대표 데이터 만 표시됩니다. 다중 Clock Scan ImageJ 플러그인을 사용하면, 동시에 여러 객체의 분석을 용이하게 할 수 있습니다. 현미경 데이터의 견고한 통계적 평가,단일 셀 / 객체의 신호 강도 분포와 관련하여이 플러그인 확장을 사용하여 가능합니다. 여기에서는 클럭 스캔 플러그인을 설명하고 이미지 분석에서 해당 응용 프로그램의 예를 보여줍니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="896">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Computer</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:289px;"></td>
			<td style="width:320px;">compatible with software listed below</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ or Fiji ImageJ</td>
			<td style="width:71px;">NIH</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/</td>
			<td>bundled with Java 1.8 or higher</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Clock-scan plugins</td>
			<td style="width:71px;">freeware</td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/clockscan/</td>
			<td>Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Origin 9.0</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td style="width:289px;">Northampton, MA, USA</td>
			<td style="width:320px;">This program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

clock scan protocol for image analysis: imagej plugins

이미지 분석을위한 클록 스캔 프로토콜은 클로즈 또는 세그먼트 화 된 볼록한 관심 영역을 테두리, 내부 및 외부 (배경) 내에서 평균 픽셀 강도를 정량화하는 효율적인 도구로서, 평균 적분 된 방사형 픽셀 - 강도 프로파일. 이 프로토콜은 원래 Visual Basic 6 스크립트로 2006 년에 개발되었지만 배포가 제한적이었습니다. 이 문제를 해결하고 다른 사람들의 비슷한 노력에 동참하기 위해 원본 시계 스캔 프로토콜 코드를 ImageJ 또는 피지 ImageJ와 같은 NIH가 후원하고 자유롭게 사용할 수있는 이미지 분석 프로그램과 호환되는 두 개의 Java 기반 플러그인으로 변환했습니다. 또한 이러한 플러그인에는 관심 영역 및 이미지 스택의 여러 분석과 같은 원래 프로토콜의 기능 범위를 확장하여 몇 가지 새로운 기능이 추가되었습니다. 프로그램의 후자의 기능은 변경 사항을 결정하는 것이 중요합니다 응용 프로그램에서 특히 유용합니다시간과 위치. 따라서 생체 이미지 스택의 시계 스캔 분석은 단일 세포 내에서의 Na + 또는 Ca ++ 의 확산뿐 아니라 시냅스 집단에서의 확산 활동 ( 예 : Ca ++ 파도) 분석에 잠재적으로 적용될 수 있습니다 - 연결 또는 갭 접합 - 결합 된 전지. 여기에서는 이러한 새로운 클럭 스캔 플러그인에 대해 설명하고 이미지 분석에서 응용 프로그램의 몇 가지 예를 보여줍니다.

설명 목적으로 여기에 사용 된 이미지는 이전 세포 및 조직 생물학 연구 5 , 6 , 7 및 Allen Mouse Brain Atlas 8 에서 작성된 데이터베이스에서 가져온 것입니다. 두 플러그인 모두 ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 및 피지 ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1.8.0_66 프로그램 환경을...

Watch this Scientific Journal Video about Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins at JoVE.com

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

이 논문은 &#39;Clock Scan&#39;이미지 분석을위한 두 가지 새로운 ImageJ 플러그인을 설명합니다. 이 플러그인은 원본 Visual Basic 6 프로그램의 기능을 확장하고, 가장 중요한 것은 ImageJ 무료 이미지 분석 소프트웨어 패키지와 함께 번들로 제공하여 대규모 연구 커뮤니티에 프로그램을 제공 할 수있게합니다.

이미지 분석을위한 클록 스캔 프로토콜 : ImageJ Plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a ...

clock-scan-protocol-for-image-analysis-imagej-plugins

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

17.3K 조회수.  University of Arkansas for Medical Sciences.  이 논문은 'Clock Scan'이미지 분석을위한 두 가지 새로운 ImageJ 플러그인을 설명합니다. 이 플러그인은 원본 Visual Basic 6 프로그램의 기능을 확장하고, 가장 중요한 것은 ImageJ 무료 이미지 분석 소프트웨어 패키지와 함께 번들로 제공하여 대규모 연구 커뮤니티에 프로그램을 제공 할 수있게합니다. 

비디오: Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

모스키토 리어링 (A. gambiae)에 대한 프로토콜

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

연구

생물학

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

호중구 격리 프로토콜

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

로보틱스 및 식물 조직에서 유전자 발현의 연구 동적 이미지 분석

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells. While fluorescent 
proteins such as green fluorescence protein (GFP) have been extensively used as fusion partners to proteins to track the properties of a protein of interest1, recent 
developments with smaller tags enable new functionalities of proteins to be examined in cells such as conformational change and protein-association 2, 3. One small 
tag system involves a tetracysteine motif (CCXXCC) genetically inserted into a target protein, which binds to biarsenical dyes, ReAsH (red fluorescent) and FlAsH 
(green fluorescent), with high specificity even in live cells 2. The TC/biarsenical dye system offers far less steric constraints to the host protein than 
fluorescent proteins which has enabled several new approaches to measure conformational change and protein-protein interactions 4-7. We recently developed 
a novel application of TC tags as sensors of oligomerization in cells expressing mutant huntingtin, which when mutated aggregates in neurons in Huntington 
disease 7. Huntingtin was tagged with two fluorescent dyes, one a fluorescent protein to track protein location, and the second a TC tag which only 
binds biarsenical dyes in monomers. Hence, changes in colocalization between protein and biarsenical dye reactivity enabled submicroscopic oligomer 
content to be spatially mapped within cells. Here, we describe how to label TC-tagged proteins fused to a fluorescent protein (Cherry, GFP or CFP) 
with FlAsH or ReAsH in live mammalian cells and how to quantify the two color fluorescence (Cherry/FlAsH, CFP/FlAsH or GFP/ReAsH combinations).

The biarsenical dyes FlAsH and ReAsH bind specifically to tetracysteine motifs in proteins and can selectively label proteins in live cells. Recently this labeling strategy has been used to develop sensors for different protein conformations or oligomeric states. We describe the labeling approach and methods to quantitatively analyze binding.

ReAsH / 플래시 라벨링 및 전지 Tetracysteine​​ 센서 단백질의 이미지 분석

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ : 세미 자동 리프 형상 측정을위한 ImageJ 플러그인

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

동적 칼슘의 자동 분석<sup&gt; 2 +</sup이미지 시퀀스에서&gt; 신호

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to large-scale screening formats in every step of a drug screen, including large-scale image analysis. Currently there is no ready-to-use and free image analysis software to meet this large-scale format. Most existing methods involve manually drawing the length and width of the imaged 3D spheroids, which is a tedious and time-consuming process. This study presents a high-throughput image analysis software application &#8211; SpheroidSizer, which measures the major and minor axial length of the imaged 3D tumor spheroids automatically and accurately; calculates the volume of each individual 3D tumor spheroid; then outputs the results in two different forms in spreadsheets for easy manipulations in the subsequent data analysis. The main advantage of this software is its powerful image analysis application that is adapted for large numbers of images. It provides high-throughput computation and quality-control workflow. The estimated time to process 1,000 images is about 15 min&#160;on a minimally configured laptop, or around 1 min&#160;on a multi-core performance workstation. The graphical user interface (GUI) is also designed for easy quality control, and users can manually override the computer results. The key method used in this software is adapted from the active contour algorithm, also known as Snakes, which is especially suitable for images with uneven illumination and noisy background that often plagues automated imaging processing in high-throughput screens. The complimentary &#8220;Manual Initialize&#8221; and &#8220;Hand Draw&#8221; tools provide the flexibility to SpheroidSizer in dealing with various types of spheroids and diverse quality images. This high-throughput image analysis software remarkably reduces labor and speeds up the analysis process. Implementing this software is beneficial for 3D tumor spheroids to become a routine in vitro model for drug screens in industry and academia.

We present a high-throughput image analysis software application to measure the size of three-dimensional tumor spheroids imaged with bright-field microscopy. This application provides a fast and effective way to examine the effects of therapeutic drugs on spheroids, which is beneficial for researchers who wish to use spheroids in drug screens.

종양 상체의 높은 처리량의 이미지 분석 : 자동으로 정확하게 상체의 크기를 측정하는 사​​용자 친화적 인 소프트웨어 응용 프로그램

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

렌티 바이러스 형질 도입 및 장내 Organoids의 다운 스트림 분석을위한 프로토콜

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

발광 시계 기자와 애기 장대 원형질체 트랜의 일주기 표현형의 신속한 분석

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

이미지 분석을위한 클록 스캔 프로토콜 : ImageJ Plugins

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

모스키토 리어링 (A. gambiae)에 대한 프로토콜

호중구 격리 프로토콜

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

로보틱스 및 식물 조직에서 유전자 발현의 연구 동적 이미지 분석

ReAsH / 플래시 라벨링 및 전지 Tetracysteine 센서 단백질의 이미지 분석

LeafJ : 세미 자동 리프 형상 측정을위한 ImageJ 플러그인

동적 칼슘의 자동 분석

종양 상체의 높은 처리량의 이미지 분석 : 자동으로 정확하게 상체의 크기를 측정하는 사용자 친화적 인 소프트웨어 응용 프로그램

렌티 바이러스 형질 도입 및 장내 Organoids의 다운 스트림 분석을위한 프로토콜

발광 시계 기자와 애기 장대 원형질체 트랜의 일주기 표현형의 신속한 분석

이미지 분석을위한 클록 스캔 프로토콜 : ImageJ Plugins

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

모스키토 리어링 (A. gambiae)에 대한 프로토콜

호중구 격리 프로토콜

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

로보틱스 및 식물 조직에서 유전자 발현의 연구 동적 이미지 분석

ReAsH / 플래시 라벨링 및 전지 Tetracysteine​​ 센서 단백질의 이미지 분석

LeafJ : 세미 자동 리프 형상 측정을위한 ImageJ 플러그인

동적 칼슘의 자동 분석

종양 상체의 높은 처리량의 이미지 분석 : 자동으로 정확하게 상체의 크기를 측정하는 사​​용자 친화적 인 소프트웨어 응용 프로그램

렌티 바이러스 형질 도입 및 장내 Organoids의 다운 스트림 분석을위한 프로토콜

발광 시계 기자와 애기 장대 원형질체 트랜의 일주기 표현형의 신속한 분석

ReAsH / 플래시 라벨링 및 전지 Tetracysteine 센서 단백질의 이미지 분석

종양 상체의 높은 처리량의 이미지 분석 : 자동으로 정확하게 상체의 크기를 측정하는 사용자 친화적 인 소프트웨어 응용 프로그램