אנו מודים לד&quot;ר טניה מריץ וד&quot;ר פביאן Feutlinske (מכון לייבניץ של פרמקולוגיה מולקולרית, ברלין, גרמניה) לחלוק איתנו את הגירסה של Fuji ImageJ שעון סריקה תוסף ומעורר השראה לנו לפתח את הגירסה של התוכנית. אנו מודים גם לד&quot;ר פריץ מלצ&#39;רס (המחלקה לפיתוח לימפוציטים, מכון מקס פלנק לזיהום ביולוגיה) על רשותו להשתמש בתמונות ממסד הנתונים של המחלקה שלו לצורך בדיקה ושיפור של התוסף. תמיכה: המרכז עבור מדעי המוח טרנסציונל; מענק NIH: P30-GM110702-03.

1. התקנת תוכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את הגרסאות העדכניות ביותר של Java ארוזות או ImageJ או פיג&#39;י ImageJ כפי שמומלץ באתרים המתאימים (ראה טבלת חומרים עבור קישורים לאתרים המתאימים). בטקסט שלהלן, שתי התוכניות נקראות &quot;ImageJ&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העתק &quot;Clock_Scan-1.0.1 צנצנת&quot; ו &quot;Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar&quot; קבצי תוסף באמצעות הקישור בתנאי חומרים השולחן ולהדביק אותם בספרייה תוסף ImageJ. לחלופין, השתמש באפשרות &quot;Plugins | Install plugin&quot; כדי להתקין קבצים אלה לאחר שמירתם בכונן הקשיח של המחשב. </li></ol> 2. ניתוח סריקה השעון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוסף שעון רגיל ( איור 1 ): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ImageJ &quot;קובץ | פתח&quot; הפקודה בתפריט לפתוח תמונה של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;מצולע&#39; כלי, או &#39;בחירת שורה מקוטע&#39;ולאחר מכן לצייר על התמונה כדי לתאר את ההחזר על ההשקעה כולה או קטע של אזור זה. ראה איור 1 A עבור דוגמה לבחירת מצולע (מתאר מקווקו פנימי). הערה: ניתן להשתמש גם בכלי בחירה אחרים, הזמינים בתוכנה (בחירה מלבנית, סגלגלה וקו חופשי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;Plugins | שעון סריקה&quot; מהתפריט כדי לפתוח את חלון שעון רגיל סריקה חלון קופץ חלון אפשרות. שים לב כי פקודה זו תפתח גם את החלון ROI מנהל עם המתאר הוסיף באופן אוטומטי אליו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בחלון אפשרות התוסף כדי לבצע את הפעולות הבאות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סקור ושנה את קואורדינטות X ו- Y של מרכז ההחזר על ההשקעה (מחושב אוטומטית כקואורדינטות של מרכז המסה הפיזית) באמצעות פסי גלילה או שינוי הערכים בתיבות הקלט המתאימות. ראה איור 1 ב . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תלוי כמה אזור הרקע מחוץ אובייקט שוUld להיות מכוסה על ידי סריקה, להתאים את גבולות הסריקה באמצעות סרגל הגלילה &quot;מגבלת סריקה&quot;. ראה איור 1 א . הערה: מגבלת הסריקה היא המספר החלקי המייצג עד כמה הסריקה צריכה להתקדם מעבר לגבולות האובייקטים בכל כיוון נתון; ערך ברירת המחדל הוא 1.20, המציין כי אורך הסריקה יהיה 20% יותר מאשר רדיוס האובייקט בכיוון של סריקה; ראה איור 1 A , קו מקווקו החיצוני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את הפלט של תוסף באמצעות &quot;רדיוס אמיתי&quot;, &quot;לחסר רקע&quot;, &quot;הקוטב המרה&quot; ו / או &quot;העלילה עם סטיית תקן&quot; תיבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;אישור&quot; כדי להפעיל את הפלאגין. ראה איור 1 C-H . הערה: דוגמאות לפלט של הפרוטוקול עם &quot;חלקת עם סטיית תקן&quot; ו &quot;פולאר המרה&quot; או &quot;רדיוס אמיתי&quot; ו &quot;פולאר transfאו &quot;אופציות שנבחרו בתרשים 1 C ו - 1D ותרשים 1 E - ו 1F , בהתאמה, שים לב כי סטיית תקן החישוב (SD) מייצגת את השונות בין סריקות אינטנסיביות של פיקסלים רדיאליים בודדים של האובייקט. אורך &quot;בחלון התוסף, המציג את המידע על אורך החזר ROI שנמדד בפיקסלים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב שנוצר &quot;שעון סריקה פרופיל מגרש&quot;, השתמש בפקודה &quot;רשימה&quot; כדי לשרטט ערכים המוצגים בשני, X ו- Y עמודות של נתונים עבור תמונות בקנה מידה אפור ב X ו 4 עמודות Y של נתונים עבור תמונות RGB, אשר Y0, עמודות Y1, Y2 ו- Y3 יהיו מלאות בעוצמת פיקסל הערוץ בעוצמת צבע אינטגרלית ואישית (אדום, ירוק וכחול). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר ROI השעון סריקה תוסף - עבודה עם ROI מרובים ( <strongClass = &quot;xfig&quot;&gt; איור 2 ): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח תמונה המכילה החזר ROI מרובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את מנהל החזר ROI על ידי לחיצה על &quot;Analyse | Tools - ROI Manager&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברצף מתאר (ראה שלב 2.1.2) ולהוסיף כל החזר ה- ROI למנהל ROI על ידי לחיצה על &quot;הוסף&quot; בחלון מנהל החזר ROI; לעשות זאת עבור כל ההחזר על ההשקעה בתוך התמונה. השתמש בפקודה &quot;ניתוח | מדידה&quot; אם ערכי החזר ה- ROI הם בעלי עניין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראה איור 2 A עבור דוגמה לבחירות מרובות של קוים מפוצלים ואיור 2 E עבור דוגמה לבחירות מצולמות מרובות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;Multi Clock Scan&quot; בתפריט &quot;תוספים&quot; כדי לפתוח את חלון האפשרויות המוקפצות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בחלון אפשרות הפרוטוקול כדי לבצע את הפעולות הבאות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, אפס את מגבלת הסריקה בהתאם לשלב 2.1.4.2; ערך ברירת המחדל הוא 1.20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך, בחר את optיון לשרטט את ממוצע השעון לסרוק פרופיל עם סורגים SD על ידי סימון &quot;מגרש עם סטיית תקן&quot; התיבה. ראה איור 2 C ו- D. הערה: ערכי ה- SD המחושבים מייצגים וריאציה בין פרופילי סריקה לשעון אינטגרלי של אובייקטים שונים. כמו כן, שים לב לקו בחלון התוסף המציג מידע על &quot;מספר החזרים ROI שנבחרו&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;אישור&quot; כדי להפעיל את הפרוטוקול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב שנוצר &quot;שעון סריקה פרופיל מגרש&quot;, השתמש בפקודה &quot;רשימה&quot; כדי לשרטט את הערכים המוצגים בחלון &quot;ערכי מגרש&quot;. עיין בחלון חלון &quot;Multi Clock Scan Scan&quot; (חלונית מרובת סריקה של שעון) עבור הגדרת עמודה לפי ערוץ צבעוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב כי החזרים ROIs הם ממוספרים ואת השעון שלהם סריקה פרופילים עבור כל ערוץ צבע נתון הם זממו באותו רצף שבו ROIs תוארו והוסיף &quot;מנהל ROI&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מולTiple ROI שעון סריקה תוסף - עבודה עם מחסנית תמונה ( איור 3 ): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח תמונה מחסנית של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את מנהל החזר ROI על ידי לחיצה על &quot;Analyse | Tools - ROI Manager&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתאר את החזר ה- ROI של התמונות בתוך הערימה והוסף אותו למנהל החזר ROI כמתואר בשלבים 2.1.2 ו -2.2.3. השתמש בפקודה &quot;ניתוח | מדידה&quot; אם ערכי החזר ה- ROI הם בעלי עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;Multi Clock Scan&quot; בתפריט &quot;תוספים&quot; כדי לפתוח את חלון האפשרויות המוקפצות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בחלון אפשרות הפרוטוקול כדי לבצע את הפעולות הבאות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפס את מגבלת הסריקה כמתואר בשלב 2.1.4.2; ערך ברירת המחדל הוא 1.20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את האפשרות לשרטט את פרופיל הסריקה הממוצעת של השעון באמצעות סרגלי SD על ידי סימון התיבה &#39;חריץ סטנדרטי&#39;. הערה: ערכי ה- SD המחושבים יציגו וריאציה בין מופעים שונים של האובייקט שנבחר בתמונה של התמונהCk. כמו כן, שים לב לקו בחלון התוסף המציג מידע על &quot;מספר התמונות בערימה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;אישור&quot; כדי להפעיל את הפרוטוקול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון &quot;שעון סריקה של פרופיל שעון&quot;, לחץ על &quot;רשימה&quot; כדי לשרטט את הערכים המוצגים בחלון &quot;ערכי שטח&quot;, כאשר מספר העמודה Y מייצג את מיקום התמונה בתוך הערימה - 1. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Dobretsov, M., Romanovsky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Clock-scan"+protocol+for+image+analysis.">"Clock-scan" protocol for image analysis.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 291, 869-879 (2006).</li><li>Feutlinske, F., Browarski, M., Ku, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stonin1+mediates+endocytosis+of+the+proteoglycan+NG2+and+regulates+focal+adhesion+dynamics+and+cell+motility.">Stonin1 mediates endocytosis of the proteoglycan NG2 and regulates focal adhesion dynamics and cell motility.</a> Nat Commun. 6, 8535 (2015).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Dobretsov, M., Hastings, S. L., Stimers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-uniform+expression+of+alpha+subunit+isoforms+of+the+Na+/K++pump+in+rat+dorsal+root+ganglia+neurons.">Non-uniform expression of alpha subunit isoforms of the Na+/K+ pump in rat dorsal root ganglia neurons.</a> Brain Res. 821, 212-217 (1999).</li><li>Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+patch+clamp+recording+and+calcium+imaging+of+neurons+in+the+intact+dorsal+root+ganglion+in+rats.">An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats.</a> J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).</li><li>Dobretsov, M., Pierce, D., Light, K. E., Kockara, N. T., Kozhemyakin, M., Wight, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mouse+model+to+selectively+identify+alpha3+Na,K-ATPase+expressing+cells+in+the+nervous+system.">Transgenic mouse model to selectively identify alpha3 Na,K-ATPase expressing cells in the nervous system.</a> Society for Neuroscience. , 1 (2015).</li><li>Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., Ao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445, 168-176 (2007).</li><li>Romanovsky, D., Mrak, R. E., Dobretsov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+decline+in+density+of+human+nerve+and+spinal+ganglia+neurons+expressing+the+alpha3+isoform+of+Na/K-ATPase.">Age-dependent decline in density of human nerve and spinal ganglia neurons expressing the alpha3 isoform of Na/K-ATPase.</a> Neuroscience. 310, 342-353 (2015).</li><li>Campbell, J., Singh, D., Hollett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+selective+photoconductive+stimulation+of+live+neurons.">Spatially selective photoconductive stimulation of live neurons.</a> Front Cell Neurosci. 8, 142 (2014).</li><li>Yuryev, M., Pellegrino, C., Jokinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Calcium+Imaging+of+Evoked+Calcium+Waves+in+the+Embryonic+Cortex.">In vivo Calcium Imaging of Evoked Calcium Waves in the Embryonic Cortex.</a> Front Cell Neurosci. 9, 500 (2015).</li><li>Qiao, M., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Method+for+Labeling+Electrically+Coupled+Cells:+Application+to+Retina.">Genetic Method for Labeling Electrically Coupled Cells: Application to Retina.</a> Front Mol Neurosci. 8, 81 (2015).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.

שעון סריקה פרוטוקול: פרוטוקול סריקה השעון הוא כלי מהיר ופשוט של ניתוח התמונה. היתרונות של פרוטוקול זה, לעומת הקיים גישות משותפות של ניתוח תמונה (כגון ליניארי עוצמת פיקסלים סריקה או חישוב של עוצמת פיקסל הממוצע של ההחזר על ההשקעה), תוארו פרטים בפרסומים קודמים <...

מטרת עבודה זו היא להציג פרוטוקול סרוק השעון כי הוא ללא פלטפורמה חופשית זמין לכל חוקר מעוניין בסוג זה של ניתוח התמונה. פרוטוקול סריקה השעון פותחה במקור בשנת 2006 1 , במטרה לשפר את השיטות הקיימות של כימות פיקסל עוצמת בתוך קמור בצורת אזורים של ריבית (ROI), שיטה שבה יש יכולת אינטגרטיבית טובה יותר ברזולוציה מרחבית משופרת. במהלך הרכישה, פרוטוקול ברצף אוספת מספר רב של פרופילים אינטנסיביות פיקסל רדיאלי, סרוקים ממרכז ROI לגבול שלה, או למרחק קבוע מראש מחוץ ההחזר על ההשקעה לצורך מדידה של עוצמת &quot;פיקסל&quot; הרקע. הפרוטוקול מסמן את הפרופילים לפי רדיוס התא, הנמדד בכיוון הסריקה. לכן, המרחק מהמרכז לגבול ROI של כל סריקה רדיאלית בודדת הוא תמיד 100% של סולם X. לבסוף, התוכנית ממוצעת אלה אינדיבידואליםאל פרופילים לתוך אינטגרל אחד אינטגרלי פרופיל פיקסל אינטנסיביות. בגלל קנה המידה, פרופיל פיקסל בעוצמה מתכוון, המיוצר על ידי פרוטוקול &quot;שעון סריקה&quot;, תלוי לא בגודל ROI ולא, בתוך גבולות סבירים, על הצורה ROI. שיטה זו מאפשרת השוואה ישירה, או במידת הצורך, ממוצעים או חיסור של פרופילים של החזרים ROI שונים. הפרוטוקול מאפשר גם תיקון של אינטגרל פיקסל אינטנסיביות פרופילים, של כל אובייקט עבור רעש רקע, על ידי חיסור פשוט של עוצמת הממוצעת של פיקסלים הממוקמים מחוץ לאובייקט. למרות שזה נבדק רק דגימות ביולוגיות, פרוטוקול שלנו מספק תוספת ערך אחרים הקיימים כלי ניתוח התמונה המשמשים מחקרים של תמונות של תהליכים פיסיקליים או כימיים מסודרים סביב נקודת המוצא (כגון דיפוזיה של חומרים ממקור נקודה ) 1 . עם זאת, המגבלה העיקרית של השיטה המקורית ניתוח התמונה היה כי הפרוטוקול היה dev(VB6) (קוד, ולכן, זה היה תלוי בפלטפורמה וקשה להפיץ (המחייב VB6). כדי להתמודד עם בעיה זו להצטרף למאמצים דומים לאחרונה על ידי חוקרים אחרים 2 , אנו המרה VB6 שעון סריקה תוכנית קוד לתוך שני התוספים מבוססי ג &#39;אווה, תואם NIH בחסות ו בחופשיות זמין קוד פתוח ו פלטפורמה עצמאית ניתוח תמונות תוכניות, ImageJ 3 ו פיג&#39; י ImageJ 4. יתר על כן, תוספים אלה יש עכשיו כמה פונקציות חדשות להרחיב את היכולת של פרוטוקול המקורי כדי לעבד ROIs מרובים ערימות תמונה.יישומים רבים ניתוח התמונה אינם ידידותיים למשתמש, לגבי ביצוע ניתוח סטטיסטי של אובייקטים מרובים, ולכן, לעתים קרובות רק נתונים נציג מוצגים.עם תוסף רב סריקה Clock ImageJ, ניתן להקל על ניתוח של אובייקטים מרובים בו זמנית.הערכה סטטיסטית חזקה של נתוני מיקרוסקופ,לגבי הפצה עוצמת האות בתאים בודדים / אובייקטים, כעת אפשרי עם תוסף זה plugin. כאן, אנו מתארים את התוספים סריקה השעון ולהראות דוגמאות של היישומים שלהם בניתוח התמונה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="896">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Computer</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:289px;"></td>
			<td style="width:320px;">compatible with software listed below</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ or Fiji ImageJ</td>
			<td style="width:71px;">NIH</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/</td>
			<td>bundled with Java 1.8 or higher</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Clock-scan plugins</td>
			<td style="width:71px;">freeware</td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/clockscan/</td>
			<td>Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Origin 9.0</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td style="width:289px;">Northampton, MA, USA</td>
			<td style="width:320px;">This program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

clock scan protocol for image analysis: imagej plugins

פרוטוקול סריקה השעון לניתוח התמונה הוא כלי יעיל לכמת את עוצמת פיקסל הממוצע בתוך, בגבול, ומחוץ (רקע) סגור או מקוטע באזור בצורת קמור של עניין, מה שמוביל את הדור של אינטגרלי אינטגרלי פיקסל אינטגרלי, פרופיל אינטנסיביות. פרוטוקול זה פותח במקור בשנת 2006, כמו תסריט ויזואלי בסיסי 6, אבל ככזה, זה היה הפצה מוגבלת. כדי לטפל בבעיה זו ולהצטרף לאחרונה המאמצים האחרונים על ידי אחרים, אנו המרה את השעון המקורי לסרוק קוד פרוטוקול לתוך שני מבוססי Java plugins תואם NIH בחסות ו בחופשיות זמין ניתוח תמונות תוכניות כמו ImageJ או פיג &#39;י ImageJ. יתר על כן, תוספים אלה יש כמה פונקציות חדשות, להרחיב עוד יותר את טווח היכולות של הפרוטוקול המקורי, כגון ניתוח של אזורים מרובים של עניין ערימות התמונה. תכונה זו של התוכנית הוא שימושי במיוחד ביישומים בהם חשוב לקבוע שינויים הקשוריםלזמן ולמיקום. לכן, ניתוח סריקה של השעון של ערימות של תמונות ביולוגיות עשוי להיות מיושם על הפצת Na + או Ca ++ בתוך תא בודד, כמו גם ניתוח של פעילות הפצה ( למשל , גלי ++ Ca) באוכלוסיות של סינפטי מחובר או פער צומת-מצמידים תאים. כאן, אנו מתארים את השעון החדש plugins לסרוק ולהראות כמה דוגמאות של היישומים שלהם בניתוח התמונה.

התמונות המשמשות כאן לצורך האיור, נלקחות מתוך מסדי נתונים שנוצרו במהלך התא הקודם שלנו ביולוגיה רקמות ביולוגיות 5 , 6 , 7 ו מן המוח אלן המוח אטלס 8 . שני plugins נבדקו בהצלחה באמצעות ImageJ 1.50i / Java 1....

Watch this Scientific Journal Video about Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins at JoVE.com

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

מאמר זה מתאר שני תוספים ImageJ חדשניים לניתוח &#39;שעון סריקה&#39; תמונה. תוספים אלה להרחיב את הפונקציונליות של התוכנית הבסיסית Visual 6 הבסיסית, והכי חשוב, להפוך את התוכנית זמינה לקהילת מחקר גדול על ידי bundling אותו עם ImageJ חינם תמונה ניתוח תוכנה החבילה.

שעון סריקה פרוטוקול ניתוח תמונה: Plugins ImageJ

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a ...

clock-scan-protocol-for-image-analysis-imagej-plugins

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

17.3K Views.  University of Arkansas for Medical Sciences.  מאמר זה מתאר שני תוספים ImageJ חדשניים לניתוח 'שעון סריקה' תמונה. תוספים אלה להרחיב את הפונקציונליות של התוכנית הבסיסית Visual 6 הבסיסית, והכי חשוב, להפוך את התוכנית זמינה לקהילת מחקר גדול על ידי bundling אותו עם ImageJ חינם תמונה ניתוח תוכנה החבילה. ...

Video: Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

פרוטוקול לגידול יתושים (א gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

נויטרופילים בידוד פרוטוקול

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

רובוטיקה ניתוח תמונה דינאמית ללימודים של ביטוי גנים ברקמות הצמח

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells. While fluorescent 
proteins such as green fluorescence protein (GFP) have been extensively used as fusion partners to proteins to track the properties of a protein of interest1, recent 
developments with smaller tags enable new functionalities of proteins to be examined in cells such as conformational change and protein-association 2, 3. One small 
tag system involves a tetracysteine motif (CCXXCC) genetically inserted into a target protein, which binds to biarsenical dyes, ReAsH (red fluorescent) and FlAsH 
(green fluorescent), with high specificity even in live cells 2. The TC/biarsenical dye system offers far less steric constraints to the host protein than 
fluorescent proteins which has enabled several new approaches to measure conformational change and protein-protein interactions 4-7. We recently developed 
a novel application of TC tags as sensors of oligomerization in cells expressing mutant huntingtin, which when mutated aggregates in neurons in Huntington 
disease 7. Huntingtin was tagged with two fluorescent dyes, one a fluorescent protein to track protein location, and the second a TC tag which only 
binds biarsenical dyes in monomers. Hence, changes in colocalization between protein and biarsenical dye reactivity enabled submicroscopic oligomer 
content to be spatially mapped within cells. Here, we describe how to label TC-tagged proteins fused to a fluorescent protein (Cherry, GFP or CFP) 
with FlAsH or ReAsH in live mammalian cells and how to quantify the two color fluorescence (Cherry/FlAsH, CFP/FlAsH or GFP/ReAsH combinations).

The biarsenical dyes FlAsH and ReAsH bind specifically to tetracysteine motifs in proteins and can selectively label proteins in live cells. Recently this labeling strategy has been used to develop sensors for different protein conformations or oligomeric states. We describe the labeling approach and methods to quantitatively analyze binding.

ReAsH / פלאש סימון ניתוח מקדימה של חלבונים בתאים חיישן Tetracysteine

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ: תוסף ImageJ למדידת צורת עלה חצי אוטומטית

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

ניתוח האוטומטי של דינמי Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות ברצפי תמונות

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to large-scale screening formats in every step of a drug screen, including large-scale image analysis. Currently there is no ready-to-use and free image analysis software to meet this large-scale format. Most existing methods involve manually drawing the length and width of the imaged 3D spheroids, which is a tedious and time-consuming process. This study presents a high-throughput image analysis software application &#8211; SpheroidSizer, which measures the major and minor axial length of the imaged 3D tumor spheroids automatically and accurately; calculates the volume of each individual 3D tumor spheroid; then outputs the results in two different forms in spreadsheets for easy manipulations in the subsequent data analysis. The main advantage of this software is its powerful image analysis application that is adapted for large numbers of images. It provides high-throughput computation and quality-control workflow. The estimated time to process 1,000 images is about 15 min&#160;on a minimally configured laptop, or around 1 min&#160;on a multi-core performance workstation. The graphical user interface (GUI) is also designed for easy quality control, and users can manually override the computer results. The key method used in this software is adapted from the active contour algorithm, also known as Snakes, which is especially suitable for images with uneven illumination and noisy background that often plagues automated imaging processing in high-throughput screens. The complimentary &#8220;Manual Initialize&#8221; and &#8220;Hand Draw&#8221; tools provide the flexibility to SpheroidSizer in dealing with various types of spheroids and diverse quality images. This high-throughput image analysis software remarkably reduces labor and speeds up the analysis process. Implementing this software is beneficial for 3D tumor spheroids to become a routine in vitro model for drug screens in industry and academia.

We present a high-throughput image analysis software application to measure the size of three-dimensional tumor spheroids imaged with bright-field microscopy. This application provides a fast and effective way to examine the effects of therapeutic drugs on spheroids, which is beneficial for researchers who wish to use spheroids in drug screens.

ניתוח תפוקה גבוהה תמונה של spheroids גידול: יישום תוכנה ידידותי למשתמש כדי למדוד את גודל של spheroids באופן אוטומטי ומדויק

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

פרוטוקול לlentiviral התמרה וניתוח במורד הזרם של המעיים Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

ניתוח מהיר של פנוטיפים היממה ארבידופסיס פרוטופלאסט טרנספקציה עם כתבת שעון פלורסנט

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...