우리는 플라이 주식을 플라이 음식을 준비하고 유지하기위한 천-란 수와 유 치 양에게 감사하며, 스와 핑 리와 공 초점 현미경과의 도움을 IMB 이미징 코어에. 본 연구는 101-2321-B-001 -004, NSC-100-2321 -012 B-001, B-102-2321 NSC-001 -002, MOST 103-2311-B-001 YHS (NSC에 보조금 지원 국립 과학위원회와 중국의 공화국 과학 기술부에서 -035 -MY3).

1. 사전 실험 설정 <ol><li> 5 일간 25 ° C에서 비행 mδ0.5-GAL4에서 핵 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현 계란과 문화를 수집합니다. </li><li> 마이크로파 아가 1X 인산 완충 생리 식염수 10 mL를 아가로 오스가 완전히 용해 될 때까지 (PBS)에 저 융점의 0.7 g. 37 ° C의 배양기에서 사용할 때까지 0.7 % 저 융점 겔 유지. </li><li> 12 시간 이상 동안 70 % 에탄올 핀셋, 가위 42 mm X 0.17 mm의 커버 슬립, 9 웰 유리 스폿 판 및 자기 배양 챔버를 포함한 모든 장비, 소독. </li><li> 2 % 태아 소 혈청 (FBS), 0.5 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 및 1.25 ㎎ / ㎖의 인슐린 보충 슈나이더의 초파리 배지 : 배양액 (3)을 준비한다. 오염을 방지하기 위해, 세포 배양 후드 매체를 준비합니다. 4 ° C에서 준비된 배지를 저장하고 한 달 내에 사용. </li><li> 해부 플랫폼과 실험을 &#39;청소해부를 시작하기 전에의 70 % 에탄올 손을. </li></ol> 2. 디스크 해부 <ol><li> 공기는 70 % 에탄올에서 모든 장비를 건조. </li><li> 비행 병에서 세 번째 령 유충을 선택합니다. 플라이 병의 오염을 방지하기 위해, 폐기물을 제거하는 1X PBS 배의 유충을 씻는다. </li><li> 해부 현미경 9 웰 유리 스폿 접시 (RT시) 배지 1 ㎖에서 세정 유충 해부. </li><li> 약 후방 단부로부터 제 3 방법 입 후크 또 다른 겸자 집게에 한 쌍의 유충을 잡고. 내부 조직을 분리 반대 방향으로 두 개의 집게를 당긴다. <ol><li> 입 후크에 부착 된 눈 - 뇌 단지에서 침샘, 지방 본문 및 표피를 제거합니다. 복부 신경 코드가 여전히 연결되어있는 경우, 가위를 버려야. </li></ol></li><li> 공동 조직의 조각을 제거하기 위해 입 후크와 포셉 한 쌍을 파악 포셉 한 쌍을 사용하여지느러미 부분의 머리와 눈 디스크 nnects. 참고 :이 조직이 제거되지 않으면, 두 눈 더듬이 디스크는 서로 뇌에 가까운 것입니다. 이 조직, 뇌 및 눈 더듬이 디스크가 삼각형을 형성하기 때문에 눈 디스크는 다음의 coverslip에 평평하게 거짓말을하지 않습니다. </li><li> 복부 - 상승 위치로 완전히 착물을 돌린다. 뇌에 후크 또는 디스크를 연결하는 필라멘트를 제거합니다. 참고 : 필라멘트가 제거되지 않으면 입 후크가 제거 될 때, 눈-더듬이 디스크가 두 조각으로 분할됩니다. <ol><li> 입 후크를 제거합니다. 과정에서 눈 디스크를 손상되지 않도록주의하십시오. 참고 : 아이 디스크가 현재 매체에서 무료 만 광학 줄기에 의해 뇌에 연결되어 있습니다. </li></ol></li></ol> 3. 장착 <ol><li> 공기 건조와 42 mm X 0.17 mm의 커버 슬립으로 챔버의 부품을 조립한다. 제를 유지하는 커버 슬립의 중심 O 링의 이중층을 연결전자 아가로 오스. </li><li> coverslip에와 챔버를 조립합니다. 무대 수용체에 42 mm X 0.17 mm coverslip에 넣습니다. 커버 슬립에 실리콘 O 링을 배치. 베이스를 놓습니다. 밀봉 잠금 로커 커버 (도 1)를 배치했다. </li><li> 조심스럽게 10-200 μL 팁에 20 μL의 마이크로 피펫을 이용하여 O 링의 중심에 눈 해부 뇌 복잡한 옮긴다. </li><li> 매체의 대부분을 제거하고, 샘플 (37 ° C에서) 0.7 % 저 융점 아가로 오스 12 μL를 추가한다. 참고 : 눈 디스크의 위치는 아가로 오스의 응고되기 전에 집게로 변경 될 수 있습니다. 아가는 5 분 내에 응고된다. <ol><li> O 링의 중심을 실온에서 1 ㎖의 배지에 추가; 각 O 링 (4 개)의 샘플까지 넣을 수있다. 아가로 오스는 샘플의 표류를 방지하기 위해 O 링에 접착되어 있는지 확인합니다. 주 : 매체의 어떠한 포기 또는 순환이 필요하지 않습니다. </li></ol></li></ol>4. 공 초점 현미경 <ol><li> 온도 평형을 30 분 동안 반전 공 초점 현미경의 스테이지에 배치 챔버. 이 이미징 동안 Z 축 드리프트를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 장기 라이브 영상 전에 조직 미분 간섭 대비 현미경에 의한 손상 여부를 확인. </li><li> 광독성을 방지하기 위해, 2 mW의 아래에 레이저 파워를 사용합니다. 영상에 대한 40X 목표를 사용합니다. </li><li> 1 ㎛의 광학 간격으로 12 분에서 62 μm의 Z 스택 이미지를 획득. 10 시간 동안 총 40 회 스캔 획득. 각 사이클은 12 분의 영상 및 3 분의 휴식을 포함하는지 확인. </li></ol>

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저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

이 연구에서는 Drosophila imaginal disc에 대한 장기 생체 영상 실험을위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 디스크 손상을 피하고 커버 슬립에 디스크를 부착 할 수 있도록 많은 시간을 보냈습니다. 조직을 유지하기 위해 Poly-L-Lysine (PLL)과 저 융점 아가로 오스를 시도했습니다. 결국, 저 융점 아가로 오스는 조직을 유지하는 능력이 더 좋았다. 이 방법은 10 시간의 생체 영상주기 동안 광 수용체의 분화 및 구강 내 회전이 정상적으로 발생 함을 보여주기 위해 눈 디스크 만 사용되었지만이 방법은 다른 하나의 디스크 인 날개 디스크에도 적용 할 수 있습니다. 이전 연구 3 . 또한, 배양 배지 준비 및 라이브 이미징 설정은 간단하며 폭기 또는 매질 순환을 필요로하지 않습니다. 지속적인 라이브 이미징은 생물학적 전날의 명확한 시간 순서를 제공 할 수 있습니다국세청. 눈 디스크에 아교 세포의 분화 및 마이그레이션의 우리의 이전 보고서에서, 우리는 포장 아교이 눈 디스크 3의 전방으로 마이그레이션 한 후 기존의 아교 세포에서 분화 것을 직접 증거를 제공했다. 장기 생체 문화는 자신의 행동을 삼을 따르지 같은 카에데 형광 단백질의 광 변환과 같은 세포의 특정 레이저 활성화 라벨 수 있습니다. 또한, 배양 배지에 직접 첨가되는 화학 물질의 테스트를 수용 할 수있다; 따라서,이 약물 스크리닝 플랫폼으로 사용될 수있다. 일부 동적 프로세스 분 또는 초에서 발생하기 때문에, 높은 시간 분해능이 요구된다. 시간적 해상도 광 시트 현미경 (15, 16) 또는 회전 디스크 현미경 (17)을 강화하기 좋은 선택 일 수있다. 현재 문화 상태가 완벽하지 않습니다. 그것은 디스크 성장을 지원하지 않습니다. 셀 Proliferation은 최대 12 시간 3 지원됩니다. 생체 외 배양 12 시간 후, 감광체의 분화의 비율을 3 감소하기 시작한다. 이것은 특정 영양소 나 호르몬의 부족으로 인해 수 있습니다. 이 배지에서 큰 차이가 인슐린의 높은 농도 때문에, 포유 동물 인슐린 내인성 인슐린 유사 펩타이드의 기능을 모방 한 부분 일 수있다. 플라이 추출물, 곤충 혈당 트레할로스 및 탈피 호르몬 20 hydroxyecdysone 다양한 농도의 첨가, 3 유용하지 않았다. 그러나, 12 ~ 18 시간 배양 기간은 많은 발달 과정을 연구하기에 충분하다. 애벌레 성충 디스크를 배양 대체 배양 방법 3을 비교되었고, 우리의 배양 및 이미징 조건은 라이브 영상에 대한 가장 긴 시간 창 및 대부분의 선명도를 제공합니다. 라이브 유충 및 번데기에서 디스크를 직접 영상화 할 수 있지만18, 19, 20, 21, 22, 관측 분해능과 시간 창 제한된다. 늦은 애벌레와 번데기 디스크는 오랜 시간이 23, 24에 대한 배양 있지만 디스크는 중요한 형태 형성을받을 수 있습니다. 평면, 2D 애벌레 디스크를 활용하기 위해, 우리의 배양 및 이미징 방법은 지금까지 최고의 솔루션입니다.

초파리 애벌레 성충 디스크는 생물학적 메커니즘의 다양한 연구에 대한 선호 실험 시스템이었다. 이러한 디스크는 두 상피 층에 의해 구축 SAC 형상 구조 배아 상피에서와 invaginate되고, Peripodial 상피 (PE)과 적절한 디스크 (DP) (1, 2). 성충 디스크 세포가 증식하고 점진적으로 애벌레와 번데기 단계에서 차별화하고 결국 성인 신체 구조로 개발한다. 성충 인해 디스크의 평탄 단순한 2 층 구조로, 그들은 유충 해부시 관찰하기 쉽다. 그러나, 많은 단체의 여러 노력에도 불구하고, 성충 디스크의 장기적인 문화에 대한 현재의 방법은 만족되지 않았습니다. 우리는 최근에 최대 18 시간 동안 여러 성충 디스크의 정상적인 발전을 지속 할 수있는 배양 방법을 개발하고 라이브 영상 3 수 </s&gt;까지. 배양 방법은 세포 분화 및 이동을 지원할 수 있지만, 단지 7-12 시간 동안 세포 증식을 지원할 수 있고, 디스크의 성장을 지원할 수 없다. 배지의 주요 차이점은 인슐린 (3)의 높은 농도이다. 방법은 간단하고, 특별한 포기 또는 매체 순환이 필요하지 않습니다. 가장 잘 연구 된 성충 디스크 중 하나는 눈 더듬이 디스크입니다. 초파리의 눈은 약 800 ommatidia, 개안을 구축한다. 각 개안 8 개의 시각 세포 (R1-R8)로 구성된다. 애벌레 눈 디스크에서, 광 수용체 세포 (4, 5)을 전방에서 후방에 눈 디스크를 가로 질러 밭고랑 형태 발생 (MF)의 통과에 따라 차별화. 개안의 감광체 R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6, R7 및 R8 (6) 다음에, 시작하여 순차적으로 구별. 등쪽의 ommatidia, 개안 및했습니다눈 디스크 ntral 반쪽 반대 키랄성 7, 8의 결과로, 반대 방향으로 90 ° 회전을 겪는다. 회전 공정은 두 단계로 발생한다 : 먼저, 45 ° 회전에서 시작하고 MF 뒤에 여섯째 ommatidia, 개안 행에서 완성된다; 제 45 ° 회전을 행 16 9, 10에 대해 완료된다. R3 리 / 4 특정 mδ0.5 GA4-11로 표시 ommatidial 회전 사용이 연구는, 배양이 방법을 통해 관찰 될 수있는 정상 세포 분화 및 역학을 설명하며 눈 디스크 이미지를 살.

<table><tbody><tr><td>Low-melting agarose</td><td>AMRESCO&amp;nbsp;</td><td>0815-25G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>AMRESCO</td><td>0780-2PK</td><td></td></tr><tr><td>42 mm x 0.17 mm cover slips&amp;nbsp;</td><td>PST</td><td>G401-42</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; medium&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>759</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Culture chamber&amp;nbsp;</td><td>PECON</td><td></td><td>POC-R2 Cell Cultivation System</td></tr><tr><td>40X objective</td><td></td><td></td><td>C-Apochromat 40X/1.2W Korr objective&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fly strain:nls.GFP</td><td>Bloominggton</td><td>4775</td><td></td></tr></tbody></table>

long-term live imaging of drosophila eye disc

라이브 영상은 지속적으로 실시간으로 동적 인 세포 및 발달 과정을 추적 할 수있는 기능을 제공합니다. 초파리 애벌레 성충 디스크는 같은 세포 증식, 분화, 성장, 이동, 세포 사멸, 경쟁, 세포 - 세포 신호 및 구획되지 경계 형성에 많은 생물학적 과정을 연구하는 데 사용되었다. 그러나, 장기적으로 체외 문화와 성충 디스크의 라이브 이미징을위한 방법은 많은 노력에도 불구하고, 만족되지 않았습니다. 최근에, 우리는 장기 체외 문화와 최대 18 시간 동안 성충 디스크의 라이브 영상을위한 방법을 개발했다. 배지에서 높은 인슐린 농도를 사용하는 것 외에도, 저 융점 아가로 오스는 촬상 기간 표류 것을 방지하기 위해 디스크를 삽입 하였다. 이 보고서는 예제로 눈 더듬이 디스크를 사용합니다. 감광체 R3 / 4 특정 mδ0.5-GA4 발현 differen 그 감광체를 입증 하였다tiation 및 ommatidial 회전은 10 시간 라이브 영상 기간 동안 관찰 할 수있다. 이것은 간단한 방법을 기술하는 상세한 프로토콜이다.

<html> 이 예에서, R3 / R4의 감광체는 감광체의 분화를 모니터링 mδ0.5-GA4로 표지 하였다. mδ0.5-GA4뿐만 아니라 ommatidial 회전 처리를 들면, R3 및 R4에 대한 우수한 마커하게 R3 R4 11에서 강한 발현 약한 발현을 구동한다. 영화 1에서, R3 및 R4는 GFP로 표지 하였다. 10 시간 실시간 이미징 세션이 시작될 때, ommatidial 클러스터 (도 2a 및 영화 1)와 단부 (도 2B)에서 ommatidial 클러스터의 14 행 8 열의 있었다. ommatidial 분화의 비율은, 생체 디스크 7, 8, 9, 10, 11 1.5 H / 행의 비율에 가까운 행당 1.67 시간이었다s = &quot;xref&quot;&gt; 12 , 13 , 14 . R3과 R4의 상대적 위치에 기초하여 생체 영상화 ( 그림 2A &#39;, A&#39; &#39;, B&#39;및 B &#39;&#39; ) 동안 생체 외 배양 된 원판에서 육체 회전이 일어났다. 단일 R3 / R4 클러스터는 영화 2 의 첫 번째 프레임에 흰색 구형으로 표시되었습니다. 처음에는 R3 / R4 축이 적도에 직각 인 것처럼 보입니다 ( 그림 2C 및 동영상 2 ). 그런 다음 3 ( 그림 2C &#39; ), 6 ( 그림 2C&#39; &#39; ) 및 9 ( 그림 2C&#39; &#39;&#39; ) h에서 각각 15 °, 30 ° 및 45 ° 회전합니다. 이 데이터는이 방법이 10 시간 생체 영상 도중 광 수용체 분화를 유지할 수 있음을 시사합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig1.jpg" /> 피구1 재 : 상공 회의소 총회의 회로도. 실 조립체의 개략도이다 : (1) 단계에서 수용체 이중층 O 링 부착 된 커버 슬립을 넣어. (2) 커버 슬립에 실리콘 O 링을 배치. (3) 상기베이스를 놓는다. (4) 밀봉 로커 잠금. (5)가 O 링의 중심에 시료를 넣고 덮개를 배치했다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig2.jpg" /> 그림 2 : R3 / R4 차별화 및 회전의 라이브 영상. R3 / R4 라이브 영상의 10 시간 동안의 핵 형태의 GFP를 표현 mδ0.5-GAL4으로 표시. 모든 수치는 영화 1에서 붙 잡았다. 처음에 촬영 (A) 이미지. ( <strong<html> &gt; A&#39;-A &quot;)를 왼쪽으로 (A &#39;) 및 오른쪽 (A의 박스 영역에서 확대 된 이미지&quot;). (B) 화상은 10 시간주기의 끝에서 찍은. &quot;((B&#39;-B) 왼쪽 (B &#39;) 및 우측 B)의 박스형 영역에서 확대 된 이미지&quot;. (CC &#39;&#39; &#39;) (A에서 화살표로 표시된 단일 R3 / R4 쌍&#39;)에 R3 / R4 쌍의 회전을 표시하는 시간으로 이어진다. 스케일 바 = 15㎛가 각각 ~ 10㎛, 그리고 A, B 및 C의 5 μm의. 모든 수치는 최대 강도 Z-돌기이다. 시간 스케일은 H에 도시된다 : 분. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="영화 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov1.jpg" /> 영화 1 :rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt; 검색이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="영화 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov2.jpg" /> 영화 1 : <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_2.avi" target="_blank">이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

이 프로토콜은 장기적인 ex vivo 배양과 Drosophila imaginal disc의 라이브 영상에 대한 상세한 방법을 설명합니다. 눈 디스크의 10 시간의 라이브 영상에서 광 수용체의 분화 및 구강 내 회전을 보여줍니다. 이 프로토콜은 간단하며 값 비싼 설정이 필요하지 않습니다.

장기의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 아이 디스크

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

long-term-live-imaging-of-drosophila-eye-disc

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

8.4K 조회수.  National Yang-Ming University.  이 프로토콜은 장기적인 ex vivo 배양과 Drosophila imaginal disc의 라이브 영상에 대한 상세한 방법을 설명합니다. 눈 디스크의 10 시간의 라이브 영상에서 광 수용체의 분화 및 구강 내 회전을 보여줍니다. 이 프로토콜은 간단하며 값 비싼 설정이 필요하지 않습니다. 

비디오: Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 번데기 눈

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

연구

발생학

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Drosophila 아이 Imaginal 디스크에 Glial 세포 이미징 마이 그 레이션 라이브

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

생물학

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries made using this system have taken advantage of the spatiotemporal nature of photoreceptor differentiation in the developing eye imaginal disc. To use this system it is first necessary for the researcher to learn to identify and dissect the eye disc. We describe a novel RFP reporter to aid in the identification of the eye disc and the visualization of specific cell types in the developing eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc from third instar larvae and describe how the eye-RFP reporter can aid in this dissection. This eye-RFP reporter is only expressed in the eye and can be visualized using fluorescence microscopy either in live tissue or after fixation without the need for signal amplification. We also show how this reporter can be used to identify specific cells types within the eye disc. This protocol and the use of the eye-RFP reporter will aid researchers using the Drosophila eye to address fundamentally important biological questions.

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

We describe a novel red fluorescent protein (RFP) reporter that is expressed specifically in the Drosophila eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc and how this reporter can be used to aid in the dissection and identification of specific cell types in the developing eye.

에있는 아이 Imaginal 디스크의 시각화에 도움을 소설 RFP 리포터 Drosophila</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

개발 및 성인의 준비 Drosophila 두뇌와 라이브 영상을위한 Retinae

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

<meta charset="utf8"></head><body>번데기가 없는 Drosophila Pupal Leg Morphogenesis의 확장된 라이브 이미징

Long-Term Live Imaging of Drosophila Pupal Leg Development After Puparium Removal

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which fate-determined cells form three-dimensional organismal shapes remains unclear. Recent advances in confocal microscopy have facilitated efforts to observe cell dynamics during development through live imaging. The Drosophila melanogaster pupa is ideal for live imaging due to its immobility, transparent pupal cuticle, and the availability of fluorescent reporter lines. A primary challenge for imaging is the puparium, the cuticle surrounding the pupa, which obstructs optical imaging. While previous methods involved either partial or complete removal of the puparium, maintaining pupal viability for extended periods after this procedure has remained challenging. Here, a simple method is presented for days-long live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete puparium removal. The method includes removing the puparium from a pupa adhered to double-sided tape, followed by assembling a small chamber on a glass-bottom dish to enclose the pupa and a drop of water. This setup is straightforward, reliable, and supports extended pupal survival by preventing desiccation. Long-term live imaging of the Drosophila pupa has significantly contributed to capturing how the adult leg undergoes dramatic three-dimensional structural changes over 2-3 days. These changes include the transient formation of an intriguing structure (the Parthenon-like structure) by epithelial cells, rapid tissue narrowing, joint formation, and bristle elongation. This method is applicable to the observation of various tissues and can potentially be combined with other techniques, such as optical gene induction, to advance the understanding of cell dynamics during the final shape formation of tissues in the pupal stage.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 초파리 발달 중 동적 상피 구조 발견

Here, a protocol is presented for long-term live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete removal of the puparium. This protocol can also be applied to other tissues.

번데기 제거 후 Drosophila Pupal 다리 발달의 장기 라이브 이미징

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

에 GFP-라벨 단백질의 영상을 라​​이브<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocytes

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

모자이크 성인의 라이브 이미징 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 광 수용체 (photoreceptor)

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

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번데기 제거 후 Drosophila Pupal 다리 발달의 장기 라이브 이미징

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