Siamo grati a Chun-lan Hsu e Yu-Chi Yang per la preparazione del cibo mosca e il mantenimento delle scorte mosca, e Su-Ping Lee e l&#39;IMB Imaging Nucleo per il loro aiuto con la microscopia confocale. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni a YHS (NSC 101-2321-B-001 -004, NSC 100-2321-B-001 -012, NSC 102-2321-B-001 -002, PIÙ 103-2311-B-001 -035 -MY3) dal Consiglio nazionale della Scienza e il Ministero della Scienza e della Tecnologia della Repubblica Popolare cinese.

Impostazione 1. Pre-sperimentale <ol><li> Raccogliere un uovo mosca che esprime nucleare proteina fluorescente verde (GFP) sotto mδ0.5-GAL4 e la cultura a 25 ° C per 5 giorni. </li><li> Microonde 0,7 g di agarosio bassofondente in 10 mL di 1x salina tamponata con fosfato (PBS) finché l&#39;agarosio è completamente sciolto. Mantenere il gel bassofondente 0,7% in un incubatore a 37 ° fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Sterilizzare tutti gli utensili, tra cui pinze, forbici, 42 mm x 0,17 mm coprioggetto, di una piastra di vetro 9-well, e una camera di coltura magnetico, con il 70% di etanolo per più di 12 ore. </li><li> Preparare il terreno di coltura 3: media Drosophila Schneider integrato con 2% di siero fetale bovino (FBS), 0,5% di penicillina-streptomicina, e 1,25 mg / ml di insulina. Per evitare la contaminazione, preparare il mezzo in una cappa di coltura cellulare. Conservare il terreno di coltura preparato a 4 ° C ed utilizzato entro un mese. </li><li> Pulire la piattaforma dissezione e lo sperimentatore&#39;s mani con il 70% di etanolo prima di iniziare la dissezione. </li></ol> Dissection 2. Disco <ol><li> Far asciugare tutta l&#39;attrezzatura dal 70% di etanolo. </li><li> Seleziona una larva terzo instar da una fiala mosca. Per evitare la contaminazione dalla fiala mosca, lavare la larva in 1x PBS 3x per rimuovere i rifiuti. </li><li> Sezionare la larva pulito in 1 ml di terreno di coltura (a RT) nel posto piatto di vetro 9-bene sotto un microscopio di dissezione. </li><li> Afferrare la larva con un paio di pinze a circa un terzo della distanza tra l&#39;estremità posteriore e un altro pinza del gancio bocca. Tirare le due pinze in direzioni opposte per rilasciare i tessuti interni. <ol><li> Rimuovere le ghiandole salivari, il grasso corporeo, e cuticola dal complesso occhio-cervello attaccato al gancio bocca. Se il cordone nervoso ventrale è ancora attaccato, tagliare con le forbici. </li></ol></li><li> Utilizzare un paio di pinze per afferrare il gancio bocca e una coppia di pinze per rimuovere un pezzo di tessuto che connects il cervello e dischi degli occhi nella parte dorsale. NOTA: Se questo tessuto non viene rimosso, i due dischi eye-antenne saranno vicini l&#39;uno all&#39;altro e il cervello. I dischi oculari verranno quindi non piatte sul vetrino perché questo tessuto, il cervello, e il disco eye-antennale formeranno un triangolo. </li><li> Ruotare l&#39;intero complesso ad una posizione ventrale-alto. Rimuovere il filamento che collega il gancio o disco al cervello. NOTA: Se il filamento non viene rimosso, il disco occhio-antennale si dividerà in due pezzi quando il gancio bocca viene rimosso. <ol><li> Rimuovere il gancio bocca. Fare attenzione a non danneggiare il disco occhio durante il processo. NOTA: Il disco occhio è ora gratuito nel medio e solo collegata al cervello attraverso il gambo ottica. </li></ol></li></ol> 3. Montaggio <ol><li> Aria secca e assemblare i componenti della camera con un 42 copri oggetto x 0,17 millimetri. Collegare un doppio strato di O-ring al centro del vetrino per tenere the agarosio. </li><li> Montare la camera con coprioggetto. Mettere i 42 mm x 0,17 millimetri vetrino sul palco accettore. Posizionare l&#39;anello O-silicio sul vetrino. Posizionare la base. Bloccare l&#39;armadietto di tenuta e posizionare il coperchio (Figura 1). </li><li> Trasferire accuratamente il complesso occhio-cervello sezionato al centro di O-ring con una micropipetta 20 l con una punta di 10-200 microlitri. </li><li> Rimuovere la maggior parte del mezzo e aggiungere 12 ml di 0,7% agarosio bassofondente (a 37 ° C) al campione. NOTA: La posizione del disco occhio può essere modificata con una pinza prima della solidificazione del agarosio. L&#39;agarosio si solidifica entro 5 minuti. <ol><li> Aggiungere 1 ml di terreno di coltura a temperatura ambiente al centro di O-ring; ciascun O-ring può caricare fino a 4 campioni. Assicurarsi che l&#39;agarosio è incollato alla O-ring per evitare la deriva del campione. NOTA: Non aerazione o di circolazione del mezzo è necessaria. </li></ol></li></ol>4. Microscopia confocale <ol><li> Posizionare la camera sulla scena di un microscopio confocale invertito per 30 minuti per equilibrare la temperatura. Questo può evitare la dispersione asse Z durante l&#39;imaging. </li><li> Prima di immagini dal vivo a lungo termine, controllare se il tessuto è intatto dal microscopio a contrasto di interferenza differenziale. </li><li> Per evitare la fototossicità, utilizzare un laser di potenza inferiore al 2 mW. Utilizzare un obiettivo 40X per l&#39;imaging. </li><li> Acquisire 62 um immagini Z-stack di 12 min con un intervallo ottico di 1 um. Acquisire 40 cicli di scansione per un totale di 10 h. Assicurarsi che ogni ciclo contiene 12 min di imaging e 3 min di riposo. </li></ol>

<ol>
	<li>Cohen, S. M., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaginal+disc+development.">Imaginal disc development.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 2, 747-842 (1993).</li><li>Auerbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+legs,+wings+and+halteres+in+wild+type+and+some+mutant+strains+of+Drosophila+melanogaster.">The development of the legs, wings and halteres in wild type and some mutant strains of Drosophila melanogaster.</a> Proc. R. Soc. Edinb. B. 58, 787-815 (1936).</li><li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Ex+Vivo+Culture+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Imaginal+Discs.">Long-term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs.</a> PLoS One. 11 (9), e0163744 (2016).</li><li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+retina,+a+neurocrystalline+lattice.">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye:+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave.">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113 (3), 841-850 (1991).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+in+Drosophila+ommatidium.">Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium.</a> Dev Biol. 120 (2), 366-376 (1987).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila Melanogaster. , 1277-1316 (1993).</li><li>Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+signaling+and+morphogenesis+in+Drosophila.">Planar signaling and morphogenesis in Drosophila.</a> Dev Cell. 2 (5), 525-535 (2002).</li><li>Choi, K. W., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+glia+along+photoreceptor+axons+in+the+developing+Drosophila+eye.">Migration of glia along photoreceptor axons in the developing Drosophila eye.</a> Neuron. 12 (2), 423-431 (1994).</li><li>Strutt, D. I., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ommatidial+polarity+in+the+Drosophila+eye+is+determined+by+the+direction+of+furrow+progression+and+local+interactions.">Ommatidial polarity in the Drosophila eye is determined by the direction of furrow progression and local interactions.</a> Development. 121 (12), 4247-4256 (1995).</li><li>Gaengel, K., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egfr+signaling+regulates+ommatidial+rotation+and+cell+motility+in+the+Drosophila+eye+via+MAPK/Pnt+signaling+and+the+Ras+effector+Canoe/AF6.">Egfr signaling regulates ommatidial rotation and cell motility in the Drosophila eye via MAPK/Pnt signaling and the Ras effector Canoe/AF6.</a> Development. 130 (22), 5413-5423 (2003).</li><li>Li, C., Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditions+for+the+primary+culture+of+eye+imaginal+discs+from+Drosophila+melanogaster.">Conditions for the primary culture of eye imaginal discs from Drosophila melanogaster.</a> J Neurobiol. 28 (3), 363-380 (1995).</li><li>Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye.">Pattern formation in the Drosophila eye.</a> Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).</li><li>Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+differentiation+in+Drosophila.">Retinal differentiation in Drosophila.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, ., Wittbrodt, F., J, E. H., Stelzer, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+imaging+of+entire+embryos+with+Digital+Scanned+Laser+Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy.">Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).</li><li>Winter, P. W., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faster+fluorescence+microscopy:+advances+in+high+speed+biological+imaging.">Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging.</a> Curr Opin Chem Biol. 20, 46-53 (2014).</li><li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Control+of+Morphogenesis+by+Fat/Dachsous/Four-Jointed+Planar+Cell+Polarity+Pathway.">Mechanical Control of Morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-Jointed Planar Cell Polarity Pathway.</a> Science. 336 (6082), 724-727 (2012).</li><li>Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Chips+for+In+Vivo+Imaging+of+Cellular+Responses+to+Neural+Injury+in+Drosophila+Larvae.">Microfluidic Chips for In Vivo Imaging of Cellular Responses to Neural Injury in Drosophila Larvae.</a> Plos One. 7 (1), (2012).</li><li>Heemskerk, I., Lecuit, T., LeGoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+clonal+analysis+based+on+chronic+in+vivo+imaging+allows+multiscale+quantification+of+growth+in+the+Drosophila+wing+disc.">Dynamic clonal analysis based on chronic in vivo imaging allows multiscale quantification of growth in the Drosophila wing disc.</a> Development. 141 (11), 2339-2348 (2014).</li><li>Taylor, J., Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rearrangement+and+cell+division+during+the+tissue+level+morphogenesis+of+evaginating+Drosophila+imaginal+discs.">Cell rearrangement and cell division during the tissue level morphogenesis of evaginating Drosophila imaginal discs.</a> Dev Biol. 313 (2), 739-751 (2008).</li><li>Ward, R. E., Reid, P., Bashirullah, A., D'Avino, P. P., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+in+living+animals+reveals+dynamic+developmental+responses+to+ecdysone+during+drosophila+metamorphosis.">GFP in living animals reveals dynamic developmental responses to ecdysone during drosophila metamorphosis.</a> Dev Biol. 256 (2), 389-402 (2003).</li><li>Gibbs, S. M., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+cyclic+GMP+regulate+retinal+patterning+in+the+optic+lobe+of+Drosophila.">Nitric oxide and cyclic GMP regulate retinal patterning in the optic lobe of Drosophila.</a> Neuron. 20 (1), 83-93 (1998).</li><li>Fristrom, J. W., Logan, W. R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+and+Minimal+Culture+Requirements+for+Evagination+of+Imaginal+of+Drosophila-Melanogaster+in-Vitro.">Synthetic and Minimal Culture Requirements for Evagination of Imaginal of Drosophila-Melanogaster in-Vitro.</a> Dev Biol. 33 (2), 441-456 (1973).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

In questo studio, mettiamo a disposizione un protocollo dettagliato per un esperimento di imaging dal vivo a lungo termine su dischi immaginali Drosophila. Abbiamo passato un sacco di tempo praticando la dissezione attenta per evitare danni disco e per consentire il fissaggio del disco vicino alle lamelle. Abbiamo provato Poli-L-lisina (PLL) e basso punto di fusione agarosio per tenere il tessuto; Alla fine, l&#39;agarosio a bassa fusione ha mostrato una migliore capacità di trattenere il tessuto. Anche se solo il disco occhio è stato utilizzato in questo documento per dimostrare la normale verificarsi di differenziazione dei fotorecettori e rotazione ommatidial durante il periodo in vivo imaging 10 h, questo metodo può essere applicato ad almeno un altro disco, il disco ala, come dimostrato in un studio precedente 3. Inoltre, la preparazione del mezzo di coltura e la configurazione di imaging in tempo reale sono semplici e non richiedono l&#39;aerazione o medio circolazione. Continuo immagini dal vivo in grado di fornire una chiara sequenza temporale di vigilia biologicanti. Nella nostra precedente relazione di differenziazione glia e la migrazione nel disco occhio, abbiamo fornito la prova diretta che glia avvolgenti differenziano dalla glia esistente dopo la migrazione a anteriore del disco occhio 3. A lungo termine ex vivo della cultura consente la specifica di etichettatura laser-attivata di cellule, come la foto-conversione della proteina fluorescente KAEDE, a seguire i loro comportamenti 3. Può ospitare anche la sperimentazione di sostanze chimiche che vengono aggiunti direttamente al mezzo di coltura; Quindi, può essere utilizzato come piattaforma di screening farmaco. Da qualche processo dinamico verifica entro minuti o secondi, è richiesta un&#39;elevata risoluzione temporale. Per migliorare la risoluzione temporale, foglio microscopia ottica 15, 16 o filatura disco microscopia 17 può essere una buona opzione. La condizione cultura attuale non è perfetta. Non supporta la crescita del disco. cellulare proliferation è supportata solo fino a 12 h 3. Dopo 12 ore in coltura ex vivo, il tasso di differenziazione dei fotorecettori inizia a diminuire 3. Ciò può essere dovuto alla mancanza di determinate sostanze nutritive o ormoni. Poiché la differenza principale in questo terreno di coltura è l&#39;alta concentrazione di insulina, l&#39;insulina mammiferi può essere parzialmente mimando la funzione di peptidi insulino-simile endogeni. L&#39;aggiunta di estratto di volare, l&#39;insetto trealosio di zucchero nel sangue, e varie concentrazioni dell&#39;ormone muta 20-hydroxyecdysone, non erano favorevoli 3. Tuttavia, il periodo di coltura 12-18 h è sufficiente per studiare molti processi di sviluppo. Metodi di coltura alternativi per la coltura dischi immaginali larvali sono stati confrontati 3, e la nostra coltura e di imaging condizioni fornisce la finestra di tempo più lungo e più chiarezza per l&#39;imaging dal vivo. Sebbene i dischi all&#39;interno di larve vive e pupe possono essere esposte direttamente18, 19, 20, 21, 22, la finestra risoluzione e il tempo per le osservazioni sono limitate. Tardi larvale e dischi pupa possono essere coltivate per lungo tempo 23, 24, ma i dischi subiscono significativa morfogenesi. Per sfruttare le piane, dischi larvali 2D, il nostro metodo di coltura e di imaging è la soluzione migliore finora.

I Drosophila larvali dischi imaginali sono stati un sistema sperimentale favorita per lo studio di una grande varietà di meccanismi biologici. Questi dischi invaginate dall&#39;epitelio embrionale e diventano strutture sac-come costruito da due strati epiteliali, Peripodial Epitelio (PE) e Disc Proper (DP) 1, 2. Le cellule disco imaginal proliferano e progressivamente differenziano durante gli stadi larvali e pupe ed eventualmente sviluppare nelle strutture corporee degli adulti. A causa della struttura a due strati piatta e semplice dei dischi imaginali, sono facili da osservare quando sezionato da larve. Tuttavia, nonostante molti sforzi da molti gruppi, i metodi attuali per la cultura a lungo termine dei dischi immaginali non sono stati soddisfacenti. Abbiamo recentemente messo a punto un metodo di coltura che può sostenere il normale sviluppo di molteplici dischi immaginali per un massimo di 18 ore e che permette l&#39;imaging dal vivo 3 </sup&gt;. Il metodo di coltura può supportare la differenziazione e migrazione cellulare, ma può sostenere la proliferazione cellulare solo per 7-12 ore e non può sostenere la crescita disco. La differenza principale nel mezzo di coltura è l&#39;alta concentrazione di insulina 3. Il metodo è semplice, e non richiede alcun particolare aerazione o medio circolazione. Uno dei dischi immaginali più studiato è il disco di eye-antenne. L&#39;occhio di Drosophila è costruita di circa 800 ommatidi. Ogni ommatidium comprende otto fotorecettori (R1-R8). Nel disco occhio larvale, le cellule visive differenziare dopo il passaggio del Morfogenetica Solco (MF), che spazia attraverso il disco occhio da posteriore ad anteriore 4, 5. I fotorecettori in un ommatidium differenziano in sequenza, cominciando con R8, seguita da R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6, R7 e 6. L&#39;ommatidi nella dorsale e vemetà ntral del disco dell&#39;occhio subiscono una rotazione di 90 ° in senso opposto, con conseguente chiralità opposta 7, 8. Il processo di rotazione avviene in due fasi: in primo luogo, una rotazione di 45 ° inizia a ed è completato alla sesta fila ommatidi dietro la MF; la seconda rotazione di 45 ° si completa in circa 16 fila 9, 10. Questo studio ha utilizzato rotazione ommatidial, contrassegnata dalla R3 / 4-specifici mδ0.5-GA4 11, per dimostrare la differenziazione cellulare normale e dinamiche che possono essere osservati attraverso questo metodo di coltura e vivere immagine disco occhio.

<table><tbody><tr><td>Low-melting agarose</td><td>AMRESCO&amp;nbsp;</td><td>0815-25G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>AMRESCO</td><td>0780-2PK</td><td></td></tr><tr><td>42 mm x 0.17 mm cover slips&amp;nbsp;</td><td>PST</td><td>G401-42</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; medium&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>759</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Culture chamber&amp;nbsp;</td><td>PECON</td><td></td><td>POC-R2 Cell Cultivation System</td></tr><tr><td>40X objective</td><td></td><td></td><td>C-Apochromat 40X/1.2W Korr objective&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fly strain:nls.GFP</td><td>Bloominggton</td><td>4775</td><td></td></tr></tbody></table>

long-term live imaging of drosophila eye disc

Immagini dal vivo offre la possibilità di monitorare continuamente i processi cellulari e dello sviluppo dinamico in tempo reale. Drosophila dischi imaginal larvali sono stati utilizzati per studiare molti processi biologici, quali la proliferazione cellulare, la differenziazione, la crescita, migrazione, apoptosi, concorrenza, segnalazione cellula-cellula, e la formazione confine compartimentale. Tuttavia, i metodi per il lungo termine ex vivo della cultura e immagini dal vivo dei dischi immaginali non sono stati soddisfacenti, nonostante i molti sforzi. Recentemente, abbiamo sviluppato un metodo per il lungo termine ex vivo la cultura e l&#39;imaging dal vivo di dischi immaginali per un massimo di 18 ore. Oltre a utilizzare una concentrazione elevata di insulina nel mezzo di coltura, un agarosio bassofondente è stato utilizzato anche per incorporare il disco per evitare che deriva durante il periodo di imaging. Questo rapporto utilizza i dischi eye-antennomero come esempio. / 4-specifico espressione fotorecettore R3 mδ0.5-GA4 stata seguita per dimostrare che fotorecettore differenziazione e rotazione ommatidial possono essere osservati durante un periodo imaging dal vivo 10 h. Questo è un protocollo dettagliato descrive questo metodo semplice.

<html> In questo esempio, i fotorecettori R3 / R4 sono stati marcati con mδ0.5-GA4 per monitorare differenziazione dei fotorecettori. mδ0.5-GA4 spinge forte espressione in R4 ed espressione debole in R3 11, rendendolo un eccellente indicatore di R3 e R4, nonché per il processo di rotazione ommatidial. Nel film 1, R3 e R4 sono stati etichettati con GFP. All&#39;inizio del 10 h sessione live-imaging, c&#39;erano 8 file di cluster ommatidial (Figura 2A e film 1) e 14 righe di cluster ommatidial alla fine (Figura 2B). Il tasso di differenziazione ommatidial era 1,67 h per riga, che è vicino al tasso di 1,5-2 h / riga dischi in vivo 7, 8, 9, 10, 11,s = &quot;xref&quot;&gt; 12, 13, 14. Sulla base delle posizioni relative di R3 e R4, rotazione ommatidial verificato nel disco coltivate ex vivo durante l&#39;imaging in tempo reale (Figura 2A &#39;A &#39;&#39;, B&#39;, e B &#39;&#39;). Un singolo gruppo R3 / R4 è stato marcato con una sfera bianca nel primo fotogramma del film 2. In principio, l&#39;asse R3 / R4 sembra essere perpendicolare all&#39;equatore (Figura 2C e film 2). Quindi sembra ruotare di 15 °, 30 °, e 45 ° a 3 (Figura 2C &#39;), 6 (Figura 2C &#39;&#39;) e 9 (figura 2C &#39;&#39;&#39;) h, rispettivamente. Questi dati suggeriscono che questo metodo può sostenere la differenziazione dei fotorecettori durante la 10 ore di immagini in diretta. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig1.jpg" /> Figure 1: Schema dell&#39;Assemblea Camera. Schema di montaggio della camera: (1) Inserire il coprioggetto doppio strato O-ring-attaccato sulla accettore palco. (2) Inserire l&#39;O-ring silicio sul vetrino. (3) Posizionare la base. (4) Bloccare l&#39;armadietto di tenuta. (5) Caricare il campione al centro della O-ring e posizionare il coperchio. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig2.jpg" /> Figura 2: Imaging vivo di R3 / R4 Differenziazione e rotazione. R3 / R4 etichettato con mδ0.5-GAL4 espressione forma nucleare GFP per 10 h di imaging dal vivo. Tutte le figure sono state catturate dal film 1. (A) Immagine catturata all&#39;inizio. ( <strong<html> &gt; A&#39;-A&quot;) Immagine ingrandita dalla zona in scatola a sinistra (A&#39;) e destra (A&quot;). (B) immagine presa al termine del periodo di 10 h. (B&#39;-B&quot;) Immagine ingrandita dalla zona in scatola a sinistra (B&#39;) e destra (B&quot;). (CC &#39;&#39; &#39;) Una singola coppia R3 / R4 (contrassegnata da una freccia in A&#39;) è seguita nel tempo per mostrare la rotazione della coppia R3 / R4. Barre di scala = 15 micron, 10 micron e 5 micron in A, B, e C, rispettivamente. Tutte le figure sono di massima intensità z-proiezioni. La scala temporale è mostrata in h: min. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="film 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov1.jpg" /> Film 1:rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; Clicca qui per scaricare questo film. <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov2.jpg" /> Film 1: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_2.avi" target="_blank">Si prega di cliccare qui per scaricare questo film.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc at JoVE.com

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per il lungo termine coltura ex vivo e in vivo imaging di un disco immaginale Drosophila. Dimostra la differenziazione dei fotorecettori e la rotazione ommatidial entro il periodo di 10 h di immagini dal vivo del disco occhio. Il protocollo è semplice e non richiede l&#39;installazione costosa.

A lungo termine Imaging in diretta di<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

long-term-live-imaging-of-drosophila-eye-disc

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

8.4K Views.  National Yang-Ming University.  Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per il lungo termine coltura ex vivo e in vivo imaging di un disco immaginale Drosophila. Dimostra la differenziazione dei fotorecettori e la rotazione ommatidial entro il periodo di 10 h di immagini dal vivo del disco occhio. Il protocollo è semplice e non richiede l'installazione costosa. 

Video: Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-imaging del<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Vivere Imaging della migrazione cellule gliali nella Eye Disco Drosophila immaginale

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Biologia

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries made using this system have taken advantage of the spatiotemporal nature of photoreceptor differentiation in the developing eye imaginal disc. To use this system it is first necessary for the researcher to learn to identify and dissect the eye disc. We describe a novel RFP reporter to aid in the identification of the eye disc and the visualization of specific cell types in the developing eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc from third instar larvae and describe how the eye-RFP reporter can aid in this dissection. This eye-RFP reporter is only expressed in the eye and can be visualized using fluorescence microscopy either in live tissue or after fixation without the need for signal amplification. We also show how this reporter can be used to identify specific cells types within the eye disc. This protocol and the use of the eye-RFP reporter will aid researchers using the Drosophila eye to address fundamentally important biological questions.

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

We describe a novel red fluorescent protein (RFP) reporter that is expressed specifically in the Drosophila eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc and how this reporter can be used to aid in the dissection and identification of specific cell types in the developing eye.

Un Reporter Novel RFP per aiutare nella visualizzazione del Disco Eye immaginale in Drosophila</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparazione di Sviluppo e degli adulti Drosophila Brains e retina per l&#39;imaging dal vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

<meta charset="utf8"></head><body>Imaging dal vivo esteso della morfogenesi della zampa pupale di Drosophila senza pupario

Long-Term Live Imaging of Drosophila Pupal Leg Development After Puparium Removal

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which fate-determined cells form three-dimensional organismal shapes remains unclear. Recent advances in confocal microscopy have facilitated efforts to observe cell dynamics during development through live imaging. The Drosophila melanogaster pupa is ideal for live imaging due to its immobility, transparent pupal cuticle, and the availability of fluorescent reporter lines. A primary challenge for imaging is the puparium, the cuticle surrounding the pupa, which obstructs optical imaging. While previous methods involved either partial or complete removal of the puparium, maintaining pupal viability for extended periods after this procedure has remained challenging. Here, a simple method is presented for days-long live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete puparium removal. The method includes removing the puparium from a pupa adhered to double-sided tape, followed by assembling a small chamber on a glass-bottom dish to enclose the pupa and a drop of water. This setup is straightforward, reliable, and supports extended pupal survival by preventing desiccation. Long-term live imaging of the Drosophila pupa has significantly contributed to capturing how the adult leg undergoes dramatic three-dimensional structural changes over 2-3 days. These changes include the transient formation of an intriguing structure (the Parthenon-like structure) by epithelial cells, rapid tissue narrowing, joint formation, and bristle elongation. This method is applicable to the observation of various tissues and can potentially be combined with other techniques, such as optical gene induction, to advance the understanding of cell dynamics during the final shape formation of tissues in the pupal stage.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Scoprire le strutture epiteliali dinamiche durante lo sviluppo della Drosophila

Here, a protocol is presented for long-term live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete removal of the puparium. This protocol can also be applied to other tissues.

Imaging dal vivo a lungo termine dello sviluppo della zampa pupale di Drosophila dopo la rimozione del pupario

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Vivo Imaging delle proteine ​​GFP-etichettati in<em&gt; Drosophila</em&gt; Gli oociti

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

Il pomodoro / GFP-FLP / FRT Metodo per Live Imaging del Mosaico adulti<em&gt; Drosophila</em&gt; cellule fotorecettrici

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

A lungo termine Imaging in diretta di

Riepilogo

Esplora Altri Video

Live-imaging del

Vivere Imaging della migrazione cellule gliali nella Eye Disco Drosophila immaginale

Un Reporter Novel RFP per aiutare nella visualizzazione del Disco Eye immaginale in Drosophila

Preparazione di Sviluppo e degli adulti Drosophila Brains e retina per l'imaging dal vivo

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Imaging dal vivo a lungo termine dello sviluppo della zampa pupale di Drosophila dopo la rimozione del pupario

Imaging dal vivo a lungo termine dello sviluppo della zampa pupale di Drosophila dopo la rimozione del pupario

Imaging dal vivo a lungo termine dello sviluppo della zampa pupale di Drosophila dopo la rimozione del pupario

Vivo Imaging delle proteine GFP-etichettati in

Il pomodoro / GFP-FLP / FRT Metodo per Live Imaging del Mosaico adulti

A lungo termine Imaging in diretta di

Riepilogo

Esplora Altri Video

Live-imaging del

Vivere Imaging della migrazione cellule gliali nella Eye Disco Drosophila immaginale

Un Reporter Novel RFP per aiutare nella visualizzazione del Disco Eye immaginale in Drosophila

Preparazione di Sviluppo e degli adulti Drosophila Brains e retina per l'imaging dal vivo

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Imaging dal vivo a lungo termine dello sviluppo della zampa pupale di Drosophila dopo la rimozione del pupario

Imaging dal vivo a lungo termine dello sviluppo della zampa pupale di Drosophila dopo la rimozione del pupario

Imaging dal vivo a lungo termine dello sviluppo della zampa pupale di Drosophila dopo la rimozione del pupario

Vivo Imaging delle proteine ​​GFP-etichettati in

Il pomodoro / GFP-FLP / FRT Metodo per Live Imaging del Mosaico adulti

Vivo Imaging delle proteine GFP-etichettati in