이 연구는 Brigham &amp; Women &#39;s Hospital과 March of Dimes에서 지원되었습니다. 저자는 Whited Lab의 모든 구성원의 지원과 조언에 감사드립니다.

모든 axolotl 실험은 Brigham and Women &#39;s Hospital (BWH) 기관 동물 관리 및 사용위원회에 따라 수행되었습니다. 1. 관류 실험 설정 <ol><li> 0.1 % 트리 카인 용액 (MS222)으로 채워진 플라스틱 용기에 성인 axolotl을 15-20 분 동안 또는 완전히 마취 될 때까지 놓습니다. axolotl이 완전히 잠기도록 용기에 충분한 트리 카인 용액이 채워 졌는지 확인하십시오. 주 : 모든 절차는 기관 동물 관리 지침에 따라 수행되어야합니다. BWH에서 axolotl은 foot-pinch test에 실패 할 때 완전히 마비 된 것으로 간주됩니다. 즉, 발이 부드럽게 눌려 질 때 반사 운동이 없음을 의미합니다. 주의 : 트리 세인은 수생 생물에 특별히 사용되는 마취제이지만 트리 카인 용액과 직접 피부 접촉을 피하십시오. </li><li> axolotl 관류 스테이션을 설정하십시오. <ol><li> 장소흡수성 패드를 평평하고 평평한 표면에 놓고 흡수성면을 위로 향하게합니다. </li><li> anesthetized axolotl가 앙와위 위치에 누워 적절한 크기와 모양입니다 폴리스티렌 폼 프레임에 구멍을 자르십시오. 프레임을 흡수 패드 위에 놓습니다. 참고 : 여분의 종이 타월은 흡수력을 높이기 위해 프레임 바로 아래에 배치 할 수 있습니다. </li><li> 연동 튜브에 연동 펌프를로드하십시오. 펌프를 0.7 ml / min의 유속으로 설정하고 시계 방향으로 흐르게하십시오. </li><li> 1 : 4 혼합물로 0.7x PBS와 5 % 포도당으로 희석액을 만듭니다. </li><li> 희석액 10 mL와 DiI 원액 200 μL를 50 mL 원뿔 튜브에 섞는다. 모자를 씌우고 뒤집습니다. 이 튜브를 알루미늄 호일로 덮어 작업 용액이 빛에 노출되지 않도록하십시오. 참고 : 볼륨은 axolotl의 크기에 비례하여 변경해야합니다. 이 값은 약 15cm axolotl (주둥이 - 꼬리 길이)에 대한 것입니다. 에이이 크기의 nalals는 완전한 성적인 성숙에 도달하지 않았을 수 있으므로 동물성은 현재 결정되지 않을 수 있습니다. </li><li> 0.7x PBS와 50 ML 원뿔 튜브를 채 웁니다. 참고 : PBS는 루프 및 axolotl exsanguination을 준비하는 데 사용됩니다. </li><li> 27 게이지 버터 플라이 바늘을 관류 튜빙의 출구 끝 부분에 부착하십시오. 나비 날개를 서로 접어 클램프 스탠드에 놓습니다. </li><li> 전체 튜빙이 솔루션으로 가득 때까지 0.7x PBS로 채워진 50 ML 원뿔 튜브에 재관류 튜빙의 자유 엔드를 배치하고 재관류 펌프를 실행합니다. 전체 튜빙이 PBS로 채워지면 펌프를 멈추십시오. 참고 : 튜빙에 항상 공기 방울이 없어야합니다. 튜브가 공기 방울이 없으므로 축삭 안에 공기 색전이 생기고 완전 관류가되지 않게됩니다. </li><li> 폴리스티렌 폼 프레임의 axolotl 모양 금형에 종이 타월을 둡니다. 전송 피펫을 사용하여 수건에 트리 세인 용액을 담급니다. 참고 : 종이 묶음의 중간에 작은 사각형을 자릅니다.el을 사용하여 재관류 과정 중에 유체의 배액을 허용합니다. </li><li> 마취 된 axolotl을 폴리스티렌 폼 프레임 안의 종이 타월에 올려 놓습니다. </li></ol></li></ol> 2. Axolotl 가슴 열기 <ol><li> 외과 용 집게를 사용하여 어깨 라인 바로 아래 axolotl 가슴의 중심 축을 따라 피부를 집어 넣습니다. 당겨. </li><li> 메스를 사용하여 피부를 뽑은 작은 절개를하십시오. </li><li> 두 개의 연골 판을 드러내려면 가슴 위에 피부의 정사각형 패치를 제거하십시오. <ol><li> 심장을 명확하게 볼 수있을만큼 충분히 큰 흉강과 심장에서 약 5 mm 떨어진 대동맥을 덮는 창을 열려면 피부를 제거하십시오. </li></ol></li><li> 주요 혈관을 자르지 않으려면 포셉 또는 닫힌 가위를 사용하여 조심스럽게 결합 조직을 찢습니다. </li><li> 겸자를 사용하여 각 연골 플레이트를 개별적으로 들어 올리고수술 용 가위. </li><li> 조심스럽게 포 셉으로 심낭을 집어 올려서 위로 들어 올려 외과 용 가위로 구멍을 뚫습니다. 이 절개는 매우 얇은 심낭을 뚫기에 충분할 정도로 깊어 야하고 심낭을 제거 할만큼 충분히 커야합니다. 심장을 자르지 않도록주의하십시오. </li><li> 심장과 대동맥을 노출시키기 위해 섬세하게 심낭을 제거하십시오. 참고 : 전송 피펫을 사용하여 주기적으로 흉강과 아가미를 트리 카인 용액으로 세척하여 영역을 깨끗하게 유지하고 axolotl을 마취 상태로 유지하십시오. </li></ol> 3. Axolotl의 관류 <ol><li> 클램프의 팔이 axolotl 대동맥에 바늘을 삽입하기 위해 쉽게 조작 할 수 있도록로드 된 나비 바늘과 폴리스티렌 폼 프레임 옆에 클램프 스탠드를 놓습니다. 삽입하는 동안 동물의 주동기 측면을 향해 바늘의 끝 부분을 가리키고 대동맥과 평행을 유지하여 수술을 통해 구멍을 뚫지 않도록하십시오긍정적 측면. </li><li> 연동 펌프를 켭니다. 0.7x PBS는 튜브를 통해 계속 흐릅니다. </li><li> 대동맥에 바늘을 삽입합니다. <ol><li> 대동맥 아치 아래에 집게를 슬라이드하고 쉽게 접근 할 수 있도록 약간 당겨. </li><li> 바늘이 대동맥의 길이를 따라 움직 이도록 머리를 향해 위로 향하게하는 바늘 조이기 조합을 조종하십시오. 대동맥 뒤에 지원을위한 포 셉를 사용하는 동안 바늘을 삽입합니다. 참고 : 바늘은 관류 중에 미끄러지지 않도록 충분히 깊게 대동맥에 삽입해야합니다. 이것은 15cm axolotl에 대해 약 5mm 일 수 있습니다. 혈관의 완전한 천공을 피하기 위해 바늘이 대동맥과 완벽하게 일치하는지 확인하십시오. through-and-through 구멍은 거대한 출혈을 일으키고 관류 성공률을 감소시킬 수 있습니다. 성공적인 삽입은 심장의 심방이 눈에 띄게 확대되어 확인할 수 있습니다. </li></ol></li><li> sci로 하나의 아트리움을 빠르게 찢어 내십시오.혈액을 배출하도록 허용합니다. <ol><li> 흉강 내 혈액 축적 및 응고 형성을 방지하기 위해 트리 세인 용액으로 세척하십시오. </li></ol></li><li> 약 20-30 ML PBS로 axolotl을 Perfuse. 동물은 성공적인 재관류에서 밝은 핑크색에서 흰색으로 바뀌어야합니다. </li><li> 연동 펌프를 멈추고 튜브의 자유 단을 DiI 용액 15 mL 튜브에 넣으십시오. 펌프를 다시 시작하고 튜빙에 공기 방울이 생기지 않도록주의하십시오. </li><li> DiI의 전체 작업 재고로 axolotl을 퍼 퓨즈하십시오. 참고 : 성공적으로 재관류, Diol의 밝은 분홍색으로 변경 색상 axolotl. 이것은 아가미에서 가장 두드러 질 것입니다. </li><li> DiI로 관류 한 후 펌프를 멈추고 튜브의 자유 단을 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액에 넣고 조직을 고정시킵니다. 펌프를 다시 시작하고 PFA 10 mL 이상을 관류하십시오. 주의 : PFA는 독성 물질이므로 취급 및 폐기해야합니다.적절하게 sed. 장갑과 보안경을 착용하고 용액을 흄 후드 안에서 만들어야합니다. 조직을 고정시키기 위해 PFA로 axolotl을 관류 시키면 동물이 사망하게됩니다. </li></ol> 4. 관류 및 시각화 준비 종료 <ol><li> 연동 펌프를 멈추고 axolotl 대동맥에서 바늘을 제거하십시오. </li><li> 플라스틱 접시에 axolotl을 놓으십시오. 참고 : 대형 페트리 접시의 절반을 사용하면 잘 작동하고 피부를 젖게하고 시각화 품질을 향상시키기 위해 axricotl에 소량의 Tricaine 또는 PBS를 부어 넣을 수 있습니다. </li><li> 사용 된 모든 재료는 적절한 쓰레기통에 버리십시오. 수술 도구를 70 % 에탄올로 청소하고, 동물 사이에 유리 비드 멸균기를 사용하여 소독하고, 절차에 따라 고압 증기 멸균으로 멸균하십시오. PBS 용액으로 튜브를 세척 한 다음 배액하고 완전히 말린 다음 나중에 사용할 수 있도록 보관하십시오. </li></ol> 5. Perfused Axolotl의 시각화 <ol&gt; <li> Axolotl을 형광 공 촛점 현미경 아래에 놓습니다. </li><li> DiI로 염색 된 혈관의 시각화가 빛에 의해 방해되면 빛을 끕니다. </li><li> Axolotl의 vasculature을 시각화하기 위해 공 촛점 현미경과 녹색 형광 방출 필터 큐브 ( 예 : ET - CY3)를 사용하십시오. 파장 545 nm의 여기 광을 사용하십시오. 참고 : 고화질 이미지를 얻으려면 1.1 초 노출, 1 배 게인, 1.0 채도, 2 배 배율의 매개 변수를 사용할 수 있습니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Giuvarasteanu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+vascular+corrosion+casts+-+standard+method+for+studying+microvessels.">Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels.</a> Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).</li><li>Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+perfusion+of+carbon+black+ink+allows+reliable+visualization+of+cerebral+vessels.">Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels.</a> J Vis Exp. (71), e4374 (2013).</li><li> Minnich, B., Lametschwandtner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Scanning+electron+microscopy+and+vascular+corrosion+casting+for+the+characterization+of+microvascular+networks+in+human+and+animal+tissues."> Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues.</a> Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).</li><li> Honig, M., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+DiI+and+DiO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing."> DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures.">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).</li><li>Schwartz, M., Agranoff, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outgrowth+and+maintenance+of+neurites+from+cultured+goldfish+retinal+ganglion+cells.">Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells.</a> Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).</li><li>Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li><li>Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+TALEN-mediated+gene+editing+of+an+endogenous+locus+in+axolotl.">Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl.</a> Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).</li><li>Brockes, J. P., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendage+Regeneration+in+Adult+Vertebrates+and+Implications+for+Regenerative+Medicine.">Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine.</a> Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).</li><li>Smith, A. R., Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerves+and+angiogenesis+in+amphibian+limb+regeneration.">Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration.</a> Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).</li></ol>

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axolotl의 vasculature의 시각화는 lipophilic 카보시 아닌 염료, DiI와 재관류를 통해 성공적으로 수행 할 수 있습니다. 이 연구에서는 연축 펌프를 사용하여 DiI로 axolotl을 재관류하기위한 새로운 프로토콜을 설명합니다. 우리는 또한 형광 공 촛점 현미경을 사용 axolotl vasculature의 후속 시각화를 보여줍니다. 이 프로토콜은 Li et al. 에서 볼 수있는 설치류 DiI 재관류 프로토콜의 적응 이다. <sup c...

vasculature의 시각화는 많은 종의 생물체의 구조와 기능을 이해하는 데 중요한 역할을합니다. 레오나르도 다빈치 (Leonardo da Vinci)와 함께 16 세기를 시작으로 순환의 모델과 그래픽 표현이 연구되었습니다 1 . 왁스와 고무 몰드를 사용하여 조직을 관류하여 혈관 구조의 3 차원 모델을 만들어 기관 발생과 병인에 대한 연구를 허용했다. 수지 및 왁스는 인도 잉크 또는 카민 레드와 같은 염료로 착색되어 쉽게 시각화 할 수있었습니다 1 , 2 . 그러나,이 기술은 높은 점도가 관심있는 조직의 완전한 재관류를 방해했기 때문에 많은 문제를 야기했습니다. 분야가 더욱 정교 해짐에 따라 공 초점 및 전자 현미경을 사용하여 관류 기술을 이동 시켰습니다<html> 주형에서 떨어져서 혈관계의 액체 관류로 이동하며, 그 중 일부는 초기 조직을 파괴하지 않고 혈관의 관류 및 영상화를 허용한다. 형광 색소 인 DiI는 혈관 조직에 손상을주지 않고 동물의 재관류를 허용하는 얼룩 중 하나입니다. Carbocyanine 염료는 접촉시 세포막에 통합되는 친 유성 염료입니다. 이 염료는 혈관 내피 세포를 쉽고 즉각적으로 염색 할 수있게하여 형광 공 촛점 현미경으로 관찰 할 수 있습니다. DiI는 세포의 지질막에서 측면 확산을 통해 이동하며, 뉴런의 표지 및 추적에 나와 있습니다 4 . 화학적으로 DiI의 두 알킬 사슬은 염료에 세포막에 대한 높은 친 화성을 부여하는 반면 녹색 형광등 필터로 여기 될 때 적색 파장을 방출하는 형광 염료의 두 개의 공액 고리&gt; 4. DiI는 뉴런 5 , 6 에서 원형질막의 성공적인 표지 및 전장 및 역행 라벨링을 포함한 많은 역량에 활용되어 왔습니다. DiI는 이전에 관류 프로토콜에서 마우스 7 의 혈관을 시각화하는 동안 사용되었습니다. Axolotls ( Ambystoma mexicanum )는 멕시코 시티 인근의 소금기가 많은 호수에서 독점적으로 사는 도롱뇽입니다. 이 동물들은 전체 사지, 꼬리 (신경 코드 포함), 심장 및 기타 내장 기관의 일부 및 성인의 눈 부분을 재생할 수 있으므로 재생 과정을 이해하는 데 중요한 모델이되었습니다. 또한 Axolotls에 유전 도구를 최근에 적용함으로써 분자와 세포에 대한 전례없는 통찰력이 이제 가능 해졌다. 성공적인 재생산전체 사지 배합에는 광범위한 혈관 재개 화 과정이 필요하며 이는 단순히 산소와 영양소를 제공하는 혈관의 전통적인 기능 이상으로 중생에 중요한 역할을 할 수 있습니다. 조직 재생의 맥락에서 재 시술을 이해하는 것이 필수적입니다. Axolotl 혈관은 이전에 India Ink를 사용하여 시각화되었으며 그 결과가 흥미 롭지 만이 과정은 이후 10 년 동안 재검토되지 않았습니다. 우리는 axolotl vasculature 7 의 완벽한 재관류 및 시각화를 허용하기 위해 포유류에서 사용하기 위해 개발 된 DiI 관류 프로토콜을 채택하려고했습니다. 이 프로토콜은 DiI 얼룩 기법으로 axolotl 순환을 성공적으로 관류하고 시각화하는 단계를 설명합니다. 이 절차는 조직을 재생하는 것뿐만 아니라 항상성 조직에서 특허 혈관을 정확하게 시각화 할 수있게하며, 시각화를위한 새로운 방법을 제공합니다n 및 axolotl에서 revascularization 과정의 분석.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1583">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:405px;">Peristaltic Pump&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Marshall Scientific&#160;</td>
			<td style="width:152px;">RD-RP1</td>
			<td style="width:831px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">Perfusion tubing</td>
			<td style="width:195px;">Excelon Lab &#38; Vacuum Tubing</td>
			<td>436901705</td>
			<td>size S1A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">27g butterfly needle</td>
			<td style="width:195px;">EXELint Medical Products</td>
			<td>26709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">NaCl</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">KCl</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7747-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Distilled water</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td style="width:195px;">ThermoFischer</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>468495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Ethanol (100% vol/vol)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Surgical foreceps&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Medline</td>
			<td>MDG0748741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Polystyrene foam frame</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>any polystyrene foam square with an axolotl-shaped&#160; cut out</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:195px;">Medline</td>
			<td>DYND04025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Scalpel&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Medline</td>
			<td>MDS15210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Absorbent underpad</td>
			<td style="width:195px;">Avacare Medical</td>
			<td>PKUFSx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Paper towels</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Standard disposable transfer pipette</td>
			<td style="width:195px;">Fisherbrand</td>
			<td>50216954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Clamp stand</td>
			<td style="width:195px;">Adafruit</td>
			<td style="width:152px;">291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Tricaine powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Adult axolotl</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">MgSO4</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">CaCl2</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Plastic tanks</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Varying size appropriate for the axolotl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Axolotl</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Leica Microscope</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:152px;">M165 FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">ET-CY3 Fluorescent Filter</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td>M205FA/M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dii perfusion as a method for vascular visualization in ambystoma mexicanum

관류 기술은 조직 순환을 시각화하기 위해 수세기 동안 사용되어 왔습니다. Axolotl (Ambystoma mexicanum)은 재생 연구에 필수적인 모델로 부상 한 도롱뇽 종입니다. 이러한 동물에서 재생의 맥락에서 혈관 재개 골이 어떻게 발생하는지에 대해서는 거의 알려지지 않았다. 여기에 우리는 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)의 관류를 통한 axolotl에서 vasculature의 시각화를위한 간단한 방법을보고합니다. DiI는 내피 세포의 원형질막에 순간적으로 삽입되는 친 유성 카보시 아닌 염료이다. 관류는 DiI가 대동맥을 통해 혈액 순환을 시작하도록 연동 펌프를 사용하여 이루어집니다. 관류 중에 염료는 axolotl의 혈관을 통해 흐르고 접촉시 혈관 내피 세포의 지질 이중층으로 통합됩니다. 관류 절차는 8 인치 axolotl에 대해 약 1 시간이 걸립니다. 관류 직후Axiotl은 공 촛점 형광 현미경으로 시각화 할 수 있습니다. DiI는 녹색 형광 필터로 여기 될 때 적색 주황색 범위에서 빛을 방출합니다. 이 DiI 관류 절차는 axolotls의 혈관 구조를 시각화하거나 재생 조직에서 revascularization의 패턴을 보여주는 데 사용할 수 있습니다.

<html> DiI 염색으로 Axolotl의 혈관계를 쉽게 시각화 할 수 있습니다. 친 유성 염료로 관류 된 동물의 혈관은 형광 공 촛점 현미경으로 즉시 볼 수 있습니다. 그림 1 .1-1.5 는 재관류 프로토콜의 개략도입니다. 밝은 핑크색 염료로 관류 한 후, 성공적으로 관류 된 축색 돌기가 분홍색으로 보일 것입니다. 공 촛점 현미경에 녹색 형광 필터를 사용...

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DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

친 유성 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) 염색 기술을 사용하여 Ambystoma mexicanum 은 혈관 관류를 쉽게 시각화 할 수 있도록 혈관 재관류를받을 수 있습니다.

혈관 시각화를위한 DiI 관류<em&gt; 암 브리 스 토마 멕 시카 눔</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

dii-perfusion-as-method-for-vascular-visualization-ambystoma

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

9.9K 조회수.  Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital.  친 유성 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) 염색 기술을 사용하여 Ambystoma mexicanum 은 혈관 관류를 쉽게 시각화 할 수 있도록 혈관 재관류를받을 수 있습니다. 

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Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing : 정확한 Genotyping을위한 간단한 방법

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

연구

생물학

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

쥐에서 도보의 질적 분석 방법으로 Rotorod의 사용

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

의 시각화 Caenorhabditis Elegans</emLipophilic 바이탈 염료, DiI를 사용하기> 표피 구조

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

이미징을위한 간단한 방법 Arabidopsis는 Infiltrative 영상 매체로 Perfluorodecalin를 사용하여 잎

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

혈관 CA의 시각화 2 + Paracrine 유래 ROS에 의해 트리거된 신호

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Ribosome 바운드 Polypeptides을 파악하는 도구로 SecM 체포 시퀀스를 사용하여

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

사용<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

3 차원 히드로 겔의 이미지를 FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular pericytes are central to ophthalmological research. It is vital to choose an appropriate method of visualizing the microvascular pericytes. We describe retinal microvascular pericyte immunohistochemical staining in cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature using antibodies for platelet-derived growth factor receptor &#946; (PDGFR&#946;) and nerve/glial antigen 2 (NG2). This allows us to highlight advantages and shortcomings of each of the three tissue preparations for the visualization of the retinal microvascular pericytes. Cryo-sections provide transsectional visualization of all retinal layers but contain only a few occasional transverse cuts of the microvasculature. Whole-mount provides an overview of the entire retinal vasculature, but visualization of the microvasculature can be troublesome. Hypotonic isolation provides a method to visualize the entire retinal vasculature by the removal of neuronal cells, but this makes the tissue very fragile.

We demonstrate three different tissue preparation techniques for immunohistochemical visualization of rat retinal microvascular pericytes, i.e., cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolation of the vascular network.

혈관 시각화를위한 DiI 관류

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Pyrosequencing : 정확한 Genotyping을위한 간단한 방법

쥐에서 도보의 질적 분석 방법으로 Rotorod의 사용

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

의 시각화 Caenorhabditis Elegans 표피 구조

이미징을위한 간단한 방법 Arabidopsis는 Infiltrative 영상 매체로 Perfluorodecalin를 사용하여 잎

혈관 CA의 시각화^{2 +} Paracrine 유래 ROS에 의해 트리거된 신호

Ribosome 바운드 Polypeptides을 파악하는 도구로 SecM 체포 시퀀스를 사용하여

사용

3 차원 히드로 겔의 이미지를 FRET

망막 Cryo-섹션, Microvascular Pericytes의 Immunohistochemical 시각화에 대 한 전체-마운트 및 소형 고립 된 맥 관 구조