VJ와 HS는 NIH R01 GM094246에서 VJ 로의 지원을 인정합니다. HS는 Clemson University 창의적 탐구 프로그램 및 Clemson University의 광학 재료 과학 및 엔지니어링 기술 센터로부터 창업 자금을 인정합니다. 이 프로젝트는 걸프 코스트 컨소시엄의 학제 간 생물 과학 교육 센터 (NIGMS Grant No. 1 T32GM089657-05)의 켁 센터 (Keck Center)와 일반적인 인간 질병의 번역 연구를위한 시스 손 재단 파운데이션 (Schissler Foundation Fellowship)의 연수 프로그램도 지원했다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 나타내는 것은 아닙니다.

모든 저자는이 기사의 내용과 경쟁 관계가 없다고 선언합니다.

이 연구에서는 PIE-MFD 단일 분자 FRET 실험을 사용하여 interdye distance를 고정밀 도로 정렬, 교정 및 측정하는 프로토콜을 제시합니다. 모든 기기 파라미터를 신중하게 교정하여 측정 된 거리의 정확도를 높이고 Angstrom 정확도에 도달 할 수 있습니다. 이를 위해 다양한 다차원 히스토그램을 사용하여 추가 특성 분석을위한 모집단을 분석하고 식별합니다. 측정 된 샘플의 안정성을 확인하기 위해 평균 ?...

구조 생물학 연구의 근본적인 목표는 생체 분자 기계의 구조와 기능 사이의 관계를 밝히는 것입니다. 생체 분자 ( 예 : 단백질 및 핵산)의 첫 번째 시각적 인상은 1950 년대에 X 선 결정학 (X-Ray Crystallography) 1 , 2 를 통해 발생했습니다. X 선 결정학은 결정 포장에 의해 제약 된 고해상도 정적 구조 정보를 제공합니다. 따라서 X- 선 구조 모델의 내재적 부동성은 생체 분자의 동적 인 특성을 회피하며 이는 대부분의 생물학적 기능에 영향을 미칩니다 3 , 4 , 5 . 핵 자기 공명 (NMR) 6 , 7 , 8 은 수용액에서 구조 모델을 분석함으로써이 문제에 대한 대안적인 해결책을 제시했습니다. 큰 이점NMR은 구조, 동역학 및 기능 3 , 4 , 5 사이의 본질적인 관계를 명확히하는 데 도움이되는 생체 분자 및 구조적 앙상블의 본질적인 동적 특성을 회복 할 수있는 능력입니다. 그럼에도 불구하고 시료 크기와 많은 양의 시료에 의해 제한되는 NMR은 대형 시스템에 대한 복잡한 표지 전략을 필요로합니다. 그러므로 구조 생물학에서 대안적인 방법을 개발할 긴급한 필요가있다. 역사적으로 FRET가 낮은 정확도 거리 측정을 제공한다는 오해 때문에 Fösterster 공명 에너지 전달 (FRET) 9 는 구조 생물학에서 중요한 역할을하지 못했습니다. 이 프로토콜의 목적은 FRET가 나노 미터 규모의 거리를 결정하는 능력을 재검토하여 이러한 거리가 생체 분자의 구조 모델을 구축하는 데 사용될 수 있도록하는 것입니다. 첫 번째 실험적 검증FRET 효율에 대한 R - 6 의존성은 1967 년 Stryer가 &quot;분광적 인 통치자&quot;로서 다양한 길이의 폴리 프롤린을 측정함으로써 행해졌 다. 유사한 실험이 2005 년에 단일 분자 수준에서 이루어졌다. Polyproline 분자는 이상적이지 않은 것으로 밝혀졌고, 따라서 이중 가닥의 DNA 분자는 나중에 사용되었다. 이것은 정확한 거리 측정을위한 창을 열었고 FRET을 사용하여 생체 분자의 구조적 특성을 확인했습니다. FRET은 interdye 거리 범위가 ~ 0.6-1.3 R 0 인 경우 최적입니다. 여기서 R 0 은 Förster 거리입니다. 단일 분자 FRET 실험에 사용 된 일반적인 형광체의 경우 R 0 은 ~ 50Å입니다. 일반적으로 FRET은 다른 방법보다 구조 및 역학을 해결하고 차별화 할 수있는 많은 장점을 제공합니다.(i) 형광의 궁극적 인 민감성 때문에, 단일 분자 FRET 실험 13 , 14 , 15 , 16 은 개별 구성원의 구조를 직접 세고 동시에 특성화함으로써 이질적인 앙상블을 해결할 수있다. (ii) 앙상블의 동기화가 필요 없기 때문에 단일 분자 FRET 연구에서 복잡한 반응 경로를 직접 해독 할 수 있습니다. (ⅲ) FRET는 생물학적으로 관련된 다양한 역학 관계를 다루면서 10 년 이상 시간 영역의 넓은 영역에 접근 할 수있다. (iv) FRET 실험은 in vitro 및 in vivo의 모든 용액 조건에서 수행 될 수있다. FRET와 형광 현미경의 조합은 생체 내 세포에서 직접적으로 분자 구조와 상호 작용을 연구 할 수있게합니다 15 , 16 , </<html> 17 , 18 , 19 , 고정밀도 20 . (v) FRET은 거의 모든 크기의 시스템 ( 예 : 폴리 프롤린 올리고머 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , HIV 역전사 효소 26 및 리보솜 27 )에 적용 할 수 있습니다. (vi) 마지막으로, 생체 분자의 모든 차원을 포함하는 거리의 네트워크는 정적 또는 동적 분자 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35의 구조 모델을 도출하는데 사용될 수있다 .ref &quot;&gt; 35 , 36 , 37 . 따라서 단일 분자 FRET 분광기를 사용하여 거리가 구속 된 구조 모델링에 사용하기에 충분히 정확한 거리를 유도 할 수 있습니다 26 . 이것은 8 개 차원의 형광 정보 ( 즉, 여기 스펙트럼, 형광 스펙트럼, 이방성, 형광 수명, 형광 양자 수율, 형광 양자 효율 등)를 이용하는 다중 매개 형광 검출 (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 거시적 인 시간, 형광 강도 및 형광체 사이의 거리)를 정확하고 정확하게 거리 제한을 제공합니다. 또한, 펄스 인터리빙 된 여기 (PIE)는 MFD(PIE-MFD) (42) 를 사용하여 직접 여기 수용체 형광을 모니터하고 1 : 1 공여체 - 수용체 화학 양롞을 포함하는 샘플에서 발생하는 단일 분자 이벤트를 선택합니다. 일반적인 PIE-MFD 설정은 공 초점 현미경 몸체에 연결된 2 개의 펄스 인터리빙 된 여기 레이저를 사용합니다.이 광자 검출은 서로 다른 스펙트럼 창과 편광 특성의 4 가지 채널로 분할됩니다. 자세한 내용은 그림 1을 참조하십시오. FRET 결과와 일치하는 원자 론적 구조 모델을 얻기 위해 FRET가 계산 방법과 결합되어야한다는 점에 유의해야한다. FRET에서 유도 된 거리를 가진 구조 모델을 구축하는 것은 관련된 방법론을 검토하는 것이 현재의 프로토콜의 목표는 아니다. 그러나 이러한 접근법은 다른 기술 ( 예 : 소각 X 선 산란ing 또는 전자 paramagnetic 공명), 통합 구조 생물학 43 , 44 , 45 , 46 의 분야를 낳았다. 현재의 목표는 구조 생물학에서 정량적 도구로서 FRET의 길을 열어주는 것입니다. 예를 들어,이 방법론은 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA) 수용체의 리간드 - 결합 도메인 (LBD)에서 3 개의 구조 상태를 확인하는데 사용되었다. 궁극적 인 목표는 앞서 언급 한 한계점을 극복하고 고정밀 도로 측정 된 거리를 제공함으로써 생체 분자의 구조적 결정에 사용되는 통합 방법 가운데 FRET를 가져 오는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>charcoal</td><td>Merck KGaA</td><td>K42964486 320</td><td></td></tr><tr><td>syringe filter</td><td>Fisherbrand</td><td>09-719C</td><td>size: 0.20 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>chambered coverglass</td><td>Fisher Scientific</td><td>155409</td><td>1.5 borosilicate glass, 8 wells</td></tr><tr><td>microscope cover glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>063014-9</td><td>size: 24 x 60-1.5</td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Fisher Scientific</td><td>148859</td><td>nuclease free</td></tr><tr><td>tween-20</td><td>Thermo Scientific</td><td>28320</td><td>10% solution of Polysorbate 20</td></tr><tr><td>acceptor DNA strand (High FRET)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>178124895</td><td>5&amp;acute;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td></tr><tr><td>acceptor DNA strand (Low FRET)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>177956424</td><td>5&amp;acute;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td></tr><tr><td>donor DNA strand</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>177951437</td><td>5&amp;acute; -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)</td></tr><tr><td>DNA strand (No FRET)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&amp;acute; -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td></tr><tr><td>thermal cycler</td><td>Eppendorf</td><td>E6331000025</td><td>nexus gradient</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 C5&amp;nbsp;Maleimide</td><td>Thermo Scientific</td><td>A10254</td><td>termed cyan-green fluorophore in the manuscript</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2&amp;nbsp;Maleimide</td><td>Thermo Scientific</td><td>A20347</td><td>termed far-red fluorophore in the manuscript</td></tr><tr><td>Rhodamine 110</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83695-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine 101</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83694-500MG</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth, Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426</td><td>For culture of &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>Used at 100 &amp;micro;g/mL final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection</td></tr><tr><td>Tetracyline&amp;nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>58346</td><td>Used at 12.5 &amp;micro;g/mL final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>Used at 15 &amp;micro;g/mL final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation</td></tr><tr><td>Origami B(DE3) Competent Cells</td><td>Millipore</td><td>70837-3</td><td>Competent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; cells for expression of protein with disulfide bridges</td></tr><tr><td>Isopropyl-&amp;beta;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755</td><td>For induction of &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; protein expression</td></tr><tr><td>HiTrap Chelating HP</td><td>GE Life Sciences</td><td>17-0409-01</td><td>For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Desalting Column</td><td>GE Life Sciences</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>AktaPurifier</td><td>GE Life Sciences</td><td>28406264</td><td>FPLC Instrument</td></tr><tr><td>Dialysis tubing</td><td>Spectrum labs</td><td>132562</td><td>15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll</td></tr><tr><td>Dichroics</td><td>Semrock</td><td>FF500/646-Di01-25x36</td><td>500/646 BrightLight</td></tr><tr><td>50/50 Beam splitter polarizer</td><td>Qioptiq Linos&amp;nbsp;</td><td>G33 5743 000</td><td>10 x 10 film polarizer</td></tr><tr><td>Green pass filer</td><td>Chroma</td><td>ET525/50m</td><td>ET525/50m 25 mm diameter mount</td></tr><tr><td>Red pass filter</td><td>Chroma</td><td>ET720/150m</td><td>ET720/150m 25 mm diameter mount</td></tr><tr><td>Power Meter</td><td>ThorLabd</td><td>PM200</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis spectrophotometer</td><td>Varian</td><td>Cary300Bio</td><td></td></tr><tr><td>Fluorolog 3 fluorometer</td><td>Horiba</td><td>FL3-22-R3</td><td></td></tr><tr><td>Fluorohub TCSPC controller</td><td>Horiba</td><td>Fluorohub-B</td><td>TCSPC electronics for ensemble measurements</td></tr><tr><td>NanoLed 485L</td><td>Horiba</td><td>485L</td><td>Blue diode laser</td></tr><tr><td>NanoLed 635L</td><td>Horiba</td><td>635L</td><td>Red diode laser</td></tr><tr><td>Olympus IX73 Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX73P2F</td><td>Microscope frame</td></tr><tr><td>PMA 40 Hybrid Detector</td><td>PicoQuant GmbH</td><td>932200, PMA 40</td><td>Optimized for green detection</td></tr><tr><td>PMA 50 Hybrid Detector</td><td>PicoQuant GmbH</td><td>932201, PMA 50</td><td>Optimized for ed shifter sensitivity</td></tr><tr><td>485 nm laser</td><td>PicoQuant GmbH</td><td>LDH-D-C-485</td><td></td></tr><tr><td>640 nm laser</td><td>PicoQuant GmbH</td><td>LDH-D-C-640</td><td></td></tr><tr><td>Hydraharp 400 and TTTR acqusition software</td><td>PicoQuant</td><td>930021</td><td>Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software</td></tr><tr><td>SEPIA II SLM 828 and SEPIA software</td><td>PicoQuant</td><td>910028</td><td>Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.</td></tr><tr><td>computer</td><td>Dell</td><td>optiplex 7010</td><td>cpu: i7-3770 ram:16GB</td></tr><tr><td>FRET Positioning and Screening (FPS) software</td><td>Heinrich Heine Unviersity</td><td></td><td>It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html</td></tr><tr><td>MFD suite</td><td>Heinrich Heine Unviersity</td><td></td><td>It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html</td></tr></tbody></table>

high precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination

다중 매개 변수 형광 검출 (MFD) 모드에서 단일 분자 수준에서 Förster 공명 에너지 전달 (FRET)을 사용하여 고정밀 interdye 거리 측정을 수행하는 방법에 대한 프로토콜이 여기에 제시됩니다. MFD는 광 물리 및 실험 결과물을 줄이기 위해 형광의 모든 &quot;차원&quot;의 사용을 극대화하고 단단한 생체 분자에서 ~ 1Å까지의 정확도로 interdye 거리를 측정 할 수 있습니다. 이 방법은 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA) 수용체의 리간드 - 결합 도메인의 3 개의 구조 상태를 확인하여 리간드 결합시 수용체의 활성화를 설명하는데 사용되었다. 알려진 결정학 구조를 실험 측정과 비교할 때, 그들은 더 동적 인 생체 분자에 대해 3Å 미만으로 동의했다. 생체 분자의 전체 차원을 커버하는 일련의 거리 구속을 모으면 동적 생체 분자의 구조 모델을 제공 할 수 있습니다es.

MFD 설정 (레이저 라인 : 60 μW에서 485 nm, 23 μW에서 640 nm, 섹션 5.1)을 사용하는 전형적인 smFRET 실험에서 형광 샘플을 낮은 피코 몰 농도 (10 -12 M = 1 pM)로 희석하고 공진 현미경 (sub-nanosecond laser pulse)은 여기 볼륨 (excitation volume)을 통해 자유롭게 확산되는 라벨 분자를 여기시킨다. 일반적인 공 초점 부피는 &lt;4 펨토텔 (fL)입니다. 그러한 저농도에서는 한 번에 하나의 분...

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High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

단일 분자 수준에서 고정밀 FRET 실험을위한 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 또한,이 방법론은 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA) 수용체의 리간드 결합 도메인에서 3 개의 구조 상태를 확인하는데 사용될 수있다. 정확한 거리를 결정하는 것은 FRET 실험에 기반한 구조 모델을 구축하기위한 첫 번째 단계입니다.

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

high-precision-fret-at-single-molecule-level-for-biomolecule

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.6K 조회수.  Clemson University.  단일 분자 수준에서 고정밀 FRET 실험을위한 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 또한,이 방법론은 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA) 수용체의 리간드 결합 도메인에서 3 개의 구조 상태를 확인하는데 사용될 수있다. 정확한 거리를 결정하는 것은 FRET 실험에 기반한 구조 모델을 구축하기위한 첫 번째 단계입니다. 

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Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. Thereby, multiple smFRET measurements are used to localize an unknown dye position inside a protein complex by means of trilateration. In order to obtain quantitative information, the Nano-Positioning System (NPS) uses probabilistic data analysis to combine structural information from X-ray crystallography with single-molecule fluorescence data to calculate not only the most probable position but the complete three-dimensional probability distribution, termed posterior, which indicates the experimental uncertainty. The concept was generalized for the analysis of smFRET networks containing numerous dye molecules. The latest version of NPS, Fast-NPS, features a new algorithm using Bayesian parameter estimation based on Markov Chain Monte Carlo sampling and parallel tempering that allows for the analysis of large smFRET networks in a comparably short time. Moreover, Fast-NPS allows the calculation of the posterior by choosing one of five different models for each dye, that account for the different spatial and orientational behavior exhibited by the dye molecules due to their local environment.
Here we present a detailed protocol for obtaining smFRET data and applying the Fast-NPS. We provide detailed instructions for the acquisition of the three input parameters of Fast-NPS: the smFRET values, as well as the quantum yield and anisotropy of the dye molecules. Recently, the NPS has been used to elucidate the architecture of an archaeal open promotor complex. This data is used to demonstrate the influence of the five different dye models on the posterior distribution.

We present the setup and experimental procedure to obtain smFRET data from large donor-acceptor networks with a TIRF microscope. The step-by-step analysis of these measurements with the Bayesian inference software Fast-NPS yields high-resolved structural information via the application of adapted dye models.

단일 분자의 구조 정보는 고속 나노 측위 시스템을 사용하여 실험을 FRET

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

연구

생화학

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

원자 힘 분광학에 의해 단일 ​​분자 접착 조사

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

공학

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

표면 고정화 Biomolecules의 단일 분자 형광 측정을위한 자동화된 시스템

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

생물학

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes measurements on freely diffusing biomolecules more accessible. This overview includes a step-by-step protocol for using this instrument to make measurements of precise FRET efficiencies in duplex DNA samples, including details of the sample preparation, instrument setup and alignment, data acquisition, and complete analysis routines. The presented approach, which includes how to determine all the correction factors required for accurate FRET-derived distance measurements, builds on a large body of recent collaborative work across the FRET Community, which aims to establish standard protocols and analysis approaches. This protocol, which is easily adaptable to a range of biomolecular systems, adds to the growing efforts in democratising smFRET for the wider scientific community.

This article provides step-by-step instructions for making fully-corrected accurate FRET measurements on individual, freely diffusing biomolecules using the open-source, inexpensive smfBox, from switch on, through alignment and focusing, to data collection and analysis.

오픈 소스 smfBox를 사용하여 정확하고 정확한 단일 분자 FRET 측정

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural dynamics and its contributions to biology. While the FRET-based ruler reports on inter-dye distances in the 3-10 nm range, other spectroscopic techniques, such as protein-induced fluorescence enhancement (PIFE), report on the proximity between a dye and a protein surface in the shorter 0-3 nm range. Regardless of the method of choice, its use in measuring freely-diffusing biomolecules one at a time retrieves histograms of the experimental parameter yielding separate centrally-distributed sub-populations of biomolecules, where each sub-population represents either a single conformation that stayed unchanged within milliseconds, or multiple conformations that interconvert much faster than milliseconds, and hence an averaged-out sub-population. In single-molecule FRET, where the reported parameter in histograms is the inter-dye FRET efficiency, an intrinsically disordered protein, such as the &#945;-Synuclein monomer in buffer, was previously reported as exhibiting a single averaged-out sub-population of multiple conformations interconverting rapidly. While these past findings depend on the 3-10 nm range of the FRET-based ruler, we sought to put this protein to the test using single-molecule PIFE, where we track the fluorescence lifetime of site-specific sCy3-labeled &#945;-Synuclein proteins one at a time. Interestingly, using this shorter range spectroscopic proximity sensor, sCy3-labeled &#945;-Synuclein exhibits several lifetime sub-populations with distinctly different mean lifetimes that interconvert in 10-100 ms. These results show that while &#945;-Synuclein might be disordered globally, it nonetheless attains stable local structures. In summary, in this work we highlight the advantage of using different spectroscopic proximity sensors that track local or global structural changes one biomolecule at a time.

Time-resolved single-molecule protein-induced fluorescence enhancement is a useful fluorescence spectroscopic proximity sensor sensitive to local structural changes in proteins. Here we show it can be used to uncover stable local conformations in &#945;-Synuclein, which is otherwise known as globularly unstructured and unstable when measured using the longer range FRET ruler.

시간 해결 된 단백질 유발 형광 향상을 활용하여 안정적인 지역 적합성을 식별하기 위해 한 번에 한 α 시뉴클레인 단백기를 식별합니다.

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Picometer-Precision Atomic Position Tracking through Electron Microscopy

The modern aberration-corrected scanning transmission electron microscopes (AC-STEM) have successfully achieved direct visualization of atomic columns with sub-angstrom resolution. With this significant progress, advanced image quantification and analysis are still at the early stages. In this work, we present the complete pathway for the metrology of atomic resolution scanning transmission electron microscopy (STEM) images. This includes (1) tips for acquiring high-quality STEM images; (2) denoising and drift-correction for enhancing measurement accuracy; (3) obtaining initial atomic positions; (4) indexing the atoms based on unit cell vectors; (5) quantifying the atom column positions with either 2D-Gaussian single peak fitting or (6) multi-peak fitting routines for slightly overlapping atomic columns; (7) quantification of lattice distortion/strain within the crystal structures or at the defects/interfaces where the lattice periodicity is disrupted; and (8) some common methods to visualize and present the analysis.
Furthermore, a simple self-developed free MATLAB app (EASY-STEM) with a graphical user interface (GUI) will be presented. The GUI can assist in the analysis of STEM images without the need for writing dedicated analysis code or software. The advanced data analysis methods presented here can be applied for the local quantification of defect relaxations, local structural distortions, local phase transformations, and non-centrosymmetry in a wide range of materials.

This work presents a workflow for atomic position tracking in atomic resolution transmission electron microscopy imaging. This workflow is performed using an open-source Matlab app (EASY-STEM).

전자 현미경 검사를 통한 피오피터 정밀 원자 위치 추적

The modern aberration-corrected scanning transmission electron microscopes (AC-STEM) have successfully achieved direct visualization of atomic columns ...

화학

Time-Resolved Fluorescence Anisotropy from Single Molecules for Characterizing Local Flexibility in Biomolecules

We describe a protocol for conducting time-resolved fluorescence anisotropy at the single-molecule level using confocal microscopy to investigate the local flexibility and dynamics of the deoxyribonucleic acid (DNA)-binding forkhead (FKH) domain of the FoxP1 transcription factor. FoxP1 dimerizes through a three-dimensional domain-swapping (3D-DS) mechanism, forming a disordered intermediate with or without DNA. Since 3D-DS involves an intrinsically disordered region, understanding its behavior is crucial for elucidating the structural and functional properties of FoxP1. Using a single-cysteine-labeled FoxP1, we conducted single-molecule fluorescence anisotropy (smFA) experiments, applying dynamic anisotropy Photon Distribution Analysis (daPDA) and time-resolved anisotropy Burst Variance Analysis (traBVA) approaches to probe local flexibility and dynamics. This protocol provides a detailed, step-by-step guide for smFA measurements, emphasizing time-resolved analyses, variance, and probability distribution techniques to capture structural dynamics across different timescales. This approach enabled us to relate dynamics and heterogeneity to FoxP1 dimerization and DNA binding, highlighting the complex action mechanism that characterizes this transcription factor.

Here, we present the protocol to study the local flexibility and dynamics of biomolecules using time-resolved fluorescence anisotropy at the single-molecule level in confocal microscopy mode.

We describe a protocol for conducting time-resolved fluorescence anisotropy at the single-molecule level using confocal microscopy to investigate the ...

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

모바일 단일 분자 FRET 프로브의 자동화된 2차원 스파티오 측량 분석

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

생체공학

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

세균 본부 기계의 슈퍼 해상도 이미징

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

단일 분자의 구조 정보는 고속 나노 측위 시스템을 사용하여 실험을 FRET

원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

원자 힘 분광학에 의해 단일 분자 접착 조사

표면 고정화 Biomolecules의 단일 분자 형광 측정을위한 자동화된 시스템

오픈 소스 smfBox를 사용하여 정확하고 정확한 단일 분자 FRET 측정

시간 해결 된 단백질 유발 형광 향상을 활용하여 안정적인 지역 적합성을 식별하기 위해 한 번에 한 α 시뉴클레인 단백기를 식별합니다.

전자 현미경 검사를 통한 피오피터 정밀 원자 위치 추적

Time-Resolved Fluorescence Anisotropy from Single Molecules for Characterizing Local Flexibility in Biomolecules

모바일 단일 분자 FRET 프로브의 자동화된 2차원 스파티오 측량 분석

세균 본부 기계의 슈퍼 해상도 이미징

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

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원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

원자 힘 분광학에 의해 단일 ​​분자 접착 조사

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원자 힘 분광학에 의해 단일 분자 접착 조사