Guikema 연구소의 연구는 네덜란드 연구기구 (VIDI grant 016126355)와 Stichting Kinderen Kankervrij KiKA (프로젝트 252)의 Innovational Research Incentives Scheme에 의해 지원됩니다.

1. 세포 및 DNA 손상 유도 처리 <ol><li> 20 % FCS, 50 μM β- 메르 캅토 에탄올, 2 mM L- 글루타민, 100 U / mL 페니실린 및 100 μg / mL 스트렙토 마이신이 보충 된 IMDM에서 인간 BCR-ABL + B 세포 급성 림프 아교 성 세포주 BV173 또는 SUP-B15를 5 % CO2의 분위기에서 37 ℃. 5 ML / 잘 6 잘 접시에 2 X 10 6 세포 / ML에서 세포와 접시를 세고. 참고 : 선택적으로, 다양한 원산지의 서스펜션 세포주를 사용할 수 있습니다. </li><li> 세포주기의 G1 단계에서 BCR - ABL + B - ALL 세포를 체포하기 위해 5 μM의 imatinib methanesulfonate (STI571)를 첨가하고 하룻밤 동안 배양하십시오. <ol><li> 선택적으로, 세포주기 또는 BCR-ABL 음성 세포 유형에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구 할 때이 단계를 생략하십시오. </li></ol></li><li> 50 ng / ML neocarzinostatin (NCS)를 배양 물에 첨가하여 DNA 손상을 유도하고, 2 시간 동안 배양한다. <ol><li> 또는,0.5Gy / 분의 방사능 원을 사용하여 5Gy의 선량으로 세포를 조사함으로써 DNA 손상을 유도한다. 조사 후 5 % CO2의 분위기에서 37 ° C에서 2 시간 동안 세포를 회복 시키십시오. </li></ol></li><li> 선택적으로 DNA 손상에 대한 ATM 키나아제 활성의 관련성을 평가하려면 NCS 또는 방사선 치료를 추가하기 전에 5 μM의 ATM 키나아제 억제제 KU55933을 첨가하십시오. </li><li> 비이커 또는 삼각 플라스크에 1x PBS 50 mL에 분획 -V BSA 5 g을 겹쳐서 1 x PBS + 10 % BSA를 준비하고 BSA가 용해 될 때까지 RT에 놓습니다. 흔들 리거나 휘 저지 마십시오. 거품이 심하게 발생합니다. 0.22 μm 필터를 통해 천천히 여과하고 얼음 위에서 계속하십시오. </li><li> 세포를 수확하고 얼음처럼 차가운 1x PBS로 두 번 씻으십시오. 1x PBS + 10 % BSA에서 2 x 10 6 / mL로 세포를 카운트하고 resuspend. 세포를 얼음에 보관하십시오. </li></ol> 2. 세포 원심 분리, 고정 및 침투 <ol><li> 준비하기1x PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 용액. 용액이 깨끗해질 때까지 1x PBS 50 mL에 PFA 2 g을 넣고 55 ° C의 물을 가라 앉힌다. 0.22 μm 필터를 통해 용액을 여과하고 사용할 때까지 실온에서 보관하십시오. 참고 : 선택적으로 4 % PFA 고정액을 -20 ° C에서 냉동 보관할 수 있습니다. 냉동 후 사용하기 위해 한 번만 해동하십시오. 그렇지 않으면 PBS의 4 % PFA 용액을 직접 구입할 수 있습니다. </li><li> 보풀이없는 조직으로 76 mm x 26 mm 현미경 슬라이드를 조심스럽게 연마하고 5 분 동안 Coplin 병에 96 % 에탄올에 넣음으로써 탈지하십시오. 현미경 검사가 10 분 동안 공기 건조 슬라이드하자. </li><li> 6mm의 영역과 cytospin / cytology 퍼널에 현미경 슬라이드를 조립. 500 RPM에서 1 분 동안 각 깔때기와 원심 분리기에 1x PBS + 10 % BSA 50 μL를 pipetting하여 슬라이드를 pre-coat하십시오. </li><li> 500 rpm에서 5 분 동안 각 깔때기와 원심 분리기에 세포 현탁액 (0.2 x 10 6 세포와 동일) 100 μL를 추가합니다. 각 항체 조합의 경우,ast 4 준비가 필요합니다 (이중 항체 실험, 2 개의 단일 항체 대조군, 항체 대조군 없음). </li><li> 조심스럽게 깔때기를 분해하고 그 부분을 만지지 않도록주의하십시오. 샘플 고정 즉시 진행하십시오. <ol><li> 선택적으로 슬라이드를 30 분 이상 공기 건조시킵니다. 공기 건조 후 알루미늄 호일로 슬라이드를 개별적으로 감싸고 사용하기 전까지 -20 ° C에 보관하십시오. 냉동 제제를 사용할 때는 슬라이드에 과도한 응결이 생기지 않도록 종이 타월에 싸서 슬라이드를 녹여야합니다. </li></ol></li><li> PAP 펜 액 차단기 (팁 5 mm)를 사용하여 스폿 주위에 원 (대략 직경 15-20 mm)을 그립니다. </li><li> 각 지점에 4 % PFA 고정 솔루션의 50 μL를 추가하고 RT에서 30 분 동안 품어. </li><li> 온화한 교반과 RT에서 Coplin 항아리에 1x PBS와 5 분 동안 세포를 3 번 ​​씻으십시오. </li><li> 보풀이없는 티슈로 얼룩 주위의 슬라이드를 건조시키고 파이를 사용하여 가능한 한 많은 양의 액체를 제거하십시오애완 동물을 그 자리에 닿지 않거나 슬라이드를 기울여서 닦으십시오. 각 지점에 1x PBS에 0.25 % 트리톤 X 50 μL를 추가하고 교반없이 RT에서 10 분 동안 품어 둡니다. </li><li> 부드럽게 교반하면서 실온에서 Coplin jar의 TBS (TBS-T) 중 0.05 % Tween-20 ~ 50-60 mL로 5 분 동안 3 번 슬라이드를 씻는다. 이 방식으로 10 개의 슬라이드를 동시에 처리 할 수 ​​있습니다. </li></ol> 3. 차단 및 일차 항체 인큐베이션 <ol><li> 보푸라기가없는 티슈로 TBS-T를 두드려 주변의 슬라이드를 말립니다. 스팟을 만지거나 슬라이드를 기울이지 않고 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 액을 스폿에서 제거하십시오. 잠깐 블로킹 용액을 보텍스하고 한 방울 (~ 40 μL)을 각 지점에 첨가하십시오. 사전 예열 된 가습 챔버에서 37 ° C에서 1 시간 동안 품어 둡니다. </li><li> 사용하기 전에 상업용 항체 희석제, 와류 항체 희석제에 1 : 1,000의 염소 - 항 -ATM과 1 : 100의 토끼 항 - 포스 포 -Ser15-p53을 혼합하여 항체 칵테일을 준비한다. 대조군 실험자염소 - 항 -ATM 및 토끼 - 항 - 포스 포 - Ser15-p53 항체 (단일 항체 대조군)만을 함유하는 항체 희석액을 제조한다. </li><li> 차단 용액을 두 드리되 항체 희석액을 첨가하기 전에 세포가 건조하지 않도록주의하십시오. 각 항체 칵테일 희석액 30 μL를 첨가하고 밤새 가습 한 챔버에서 4 시간 동안 항온 배양하십시오. </li><li> 완충액 A와 완충액 B의 한 봉지의 내용물을 최종 용적이 각각 1,000mL 인 물에 용해시켜 원심 분리 완충액 A와 완충액 B를 준비한다. <ol><li> 또는 8.8 g의 NaCl, 1.2 g의 Tris-base 및 0.5 mL의 Tween-20을 800 mL의 물에 녹여서 완충액 A를 준비하십시오. HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조정하고 최종 부피 1,000 mL에 넣는다. </li><li> 또는 5.84 g의 NaCl, 4.24의 Tris-base 및 26.0 g의 Tris-HCl을 500 mL의 물에 녹여 세척 완충제 B를 준비한다. HCl을 사용하여 pH를 7.5로 조정한다. 1,000 mL의 최종 부피에 물을 넣으십시오. </li><li> 필터두 용액은 0.22 μm 필터를 통과했다. </li></ol></li><li> 온화한 교반과 RT에서 Coplin 항아리에 1x 현장 세척 버퍼 A와 함께 5 분 동안 슬라이드를 2 번 씻으십시오. </li></ol> 4. PLA 프로브, 연결 및 증폭 <ol><li> 안티 - 염소 플러스와 안티 - 토끼 마이너스를 상업용 항체 희석액에서 1 : 5로 희석하여 PLA 프로브를 준비하십시오. 슬라이드에서 1x 현장 세척 버퍼 A를 떼어 내고 PLA 프로브 혼합물 30 μL를 각 지점에 첨가하십시오. 예열 된 가습 챔버에서 37 ° C로 1 시간 동안 품어주십시오. 참고 : 적용된 기본 항체가 다른 종에서 자라는 한, 보조 항체 PLUS 및 MINUS PLA 프로브 (항 마우스, 항 토끼, 항 염소)의 모든 조합을 사용할 수 있으며 PLA 프로브의 조합은 항상 사용해야합니다 PLUS 프로브와 MINUS 프로브가 있습니다. </li><li> 부드럽게 교반하면서 RT에서 Coplin jar에서 ~ 50-60 mL 1x in situ 세척 완충액으로 5 분 동안 슬라이드를 2 번 씻으시오. &lt;/ li&gt; <li> 라이 게이션 용액 39 μL에 리가 제 1 μL를 첨가하여 얼음 위에서 라이 게이션 - 리가 제 용액을 준비하고 각 리간드 - 라이 게이션 용액 40 μL를 첨가한다. 미리 데워진 가습 챔버에서 37 ° C로 30 분 동안 품어 낸다. </li><li> 온화한 교반과 RT에서 코 플린 항아리에 ~ 50-60 ML 1x 현장 세척 버퍼 A와 함께 5 분 동안 슬라이드를 2 번 씻으십시오. </li><li> Amplification 원액을 물에 1 : 5로 희석하여 얼음 위에서 증폭 - 중합 효소 혼합물을 준비한다. 그런 다음 각 지점마다 1x Amplification solution 39.5 μL에 0.5 μL의 polymerase를 첨가합니다. 참고 : 증폭 시약은 빛에 민감하므로 빛에 직접 노출되지 않도록 보호해야합니다. 증폭 시약은 4 가지 다른 색상 (RED : 여기 594 nm, 방출 624 nm, FarRED : 여기 644 nm, 방출 669 nm, ORANGE : 여기 554 nm, 방출 576 nm, 녹색 : 여기 501 nm, 방출 523 nm) 사용할 수있는 현미경 설정이uitable 여기 속성 및 이러한 색상을 이미지 필터. </li><li> 1x in situ 세척 완충액 A를 가볍게 두드려서 증폭 증폭 효소 중합 효소 혼합물 40 μL를 첨가하십시오. 사전 예열 된 가습 챔버에서 37 ° C로 100 분 동안 품어 둡니다. </li></ol> 5. 장착 및 이미징 <ol><li> 물 99mL 에 1X 세척 버퍼 B 1mL를 추가하여 현장 세척 버퍼 B를 0.01x 준비합니다. </li><li> Amplification - Polymerase 혼합물을 꺼내 부드럽게 교반하면서 RT에서 Coplin jar에서 1x in situ 세척 완충액으로 10 분 동안 2 번 슬라이드를 씻는다. </li><li> 0.01x 세척 버퍼 B에서 1 ​​분 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 0.01x 초과 세척 버퍼 B를 두드리고 보풀이없는 조직으로 스폿 주변의 슬라이드를 건조시킵니다. 스팟을 만지거나 슬라이드를 기울이지 않고 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 액을 스폿에서 제거하십시오. </li><li> DAPI가 포함 된 장착 매체를 DAPI가없는 장착 매체에 1 : 5로 희석하여 핵의 과도한 염색을 피하십시오. </li><li> 25 - 30 μL의 1 : 5 DAPI 함유 장착 매체를 24 mm x 24 mm coverslip에 추가하고 슬라이드와 함께 커버 슬립을 집어 올리십시오. 약간의 압력을 가해 공기 방울이 없음을 확인하십시오. 매니큐어로 coverslip을 봉쇄하고 이미징하기 전에 적어도 15 분을 기다립니다. </li><li> (공 촛점) 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 분석합니다. <ol><li> 적어도 4 개의 취득 이미지 필드 (20x 객관적, 조건 또는 항체 조합 당 20 세포를 계산, 처리 세포에서 7 ± 5 신호의 예상 평균을 사용하여 전력 계산을 기반으로 세포 당 punctate PLA 신호의 수를 세고, 이전에보고 된 바와 같이, 유형 I 오차가 0.05, 확률이 80 % 인 확률로 치료되지 않은 세포에서 2 ± 2 개의 신호가 발생했다. 참고 : 최상의 해결 방법은 소프트웨어 패키지 ( 예 : ImageJ, Leica Acquisition Suite (LAS))를 사용하여 Z- 스택 및 디콘 볼 루션을 얻는 것입니다. 신호DAPI 염색에 의해 정의 된대로 핵 경계 내에서 쉽게 식별 할 수 있어야한다. </li><li> 핵 외부에 명확하게 나타나는 신호는 세지 마십시오. 전형적으로, NCS 처리 또는 γ- 조사는 세포 당 약 5-10 개의 phosho-p53 / ATM PLA 신호를 초래한다. &#39;단일 항체&#39;컨트롤은 배경 시그널을 제공 할 수 있지만, 이것은 매 20 개의 세포 중 1 개당 1-2 개의 PLA 신호를 초과해서는 안됩니다. </li><li> 출판 및 프리젠 테이션 목적으로 40X 또는 63X 침지 오일 대물 렌즈를 사용하여 이미지를 캡처하십시오. 슬라이드는 4 ° C에서 보관할 수 있으며 빛에 노출되지 않도록 보호해야합니다. </li></ol></li></ol>

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이 보고서에서 PLA는 현탁 세포 배양에서 단백질 간의 특이 적 상호 작용을 결정하고 시각화하는 데 사용될 수 있음이 입증되었습니다. 참고로 여기에 설명 된 프로토콜은 DNA 복구 복합체의 연구에만 국한되지 않고 정지 세포 배양에서 다른 단백질 - 단백질 상호 작용을 시각화하고 정량화하는 데에도 적용됩니다. ATM 키나아제가 DNA 손상 유도제에 노출되었을 때 G1- 구속 된 BCR-ABL + B-ALL 세포에서 ?...

DNA 손상은 단백질 - 단백질 상호 작용 및 DNA의 효율적이고 신속한 수리를 보장하는 번역 후 변형을 포함하는 고도로 규제 된 일련의 사건을 유발하여 게놈 무결성을 보호합니다 1 . 전형적으로, DNA 수리는 (공 초점) 형광 현미경에 의해 소위 이온화 방사선 유발 성 초점 (IRIF)의 형성을 모니터링함으로써 이온화 방사선에 노출 된 세포에서 연구된다. 많은 DNA 복구 및 DNA 손상 감지 단백질이 IRIF를 형성하는데, 이는 DNA 손상을지지하는 염색질 부위에서 핵 생성하는 단백질 복합체를 나타냅니다 2 , 3 . 시간 경과에 따른 IRIF의 위치와 해상도는 DNA 복구의 시공간적 조직에 대한 중요한 통찰력을 제공하며, 다양한 DNA 복구 경로의 참여를 나타낼 수 있습니다. DNA 손상의 특성과 손상이 이루어진 세포주기 단계에 따라 어떤 DNA 복구 경로가 활성화되는지가 결정됩니다. 포<html> 예를 들어, DNA 복제 (S 상)에 적극적으로 관여하는 세포에서 상 동성 재조합 (homologous recombination, HR)이 세포 복제의 G1 또는 G2 / M 상 세포에서 우세한 DNA 복구 경로 인 반면, homologous end-joining (NHEJ) repair pathway가 우세하다. DNA 손상 후 가장 초기의 사건 중 하나는 DNA 손상 감지 키나제 인 Ataxia Telangiectasia-Mutated protein (ATM)의 활성화로 세포주기의 G1- 및 G2 / M- 상에 주로 활성화되고 NHEJ를 조절하며, 및 Ataxia Telangiectasia 및 Rad3 관련 단백질 (ATR) (HR 활성화에 의해 S 상으로 작용 함). ATM과 ATR은 모두 DNA 복구, 세포 사멸 및 생존과 관련된 많은 단백질을 인산화시키는 매우 pleiotropic kinases입니다. 두 키나아제 모두 유전 독성 스트레스에 노출 된 후 종양 억제 단백질 p53을 인산화시키고 활성화시키는 것으로 나타 났는데, 이는 이들 키나아제가 중추적 인 종양 억제 시그널링 축의 상류 중재자임을 나타낸다&quot;xref&quot;&gt; 5 , 6 . IRIF의 형성과 구성은 전형적으로 이중 색 면역 형광 염색법과 현미경 검사법을 사용하여 여러 단백질의 공존을 결정함으로써 평가되지만 수리 단백질 복합체의 일부인 모든 단백질이 IRIF를 형성하는 것은 아니며이 접근법의 적용 가능성을 제한합니다. 또한, (공 초점) 면역 형광 현미경 검사는 빛의 회절 특성에 의해 제한되어 약 200-300 nm의 공간 분해능을 나타내며, 대부분의 세포 하부 구조의 크기를 초과하며, 단백질 - 단백질 상호 작용의 직접적인 조사를 기본적으로 금지합니다 분자 수준. 이와 같이, (공 초점) 형광 현미경에 의해 검출 된 면역 형광 염색 패턴의 공동 위치 화는 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 나타내는 것은 아닙니다. 최근에, 3 차원 구조와 같은 새로운 초 - 해상도 기술이 개발되었다공 초점 레이저 스캐닝 현미경으로 검출 할 수 없었던 이들 단백질의 공간 분포 특성을 밝혀내는, 나노 스케일의 53BP1 및 BRCA1 IRIF 형성을 성공적으로 연구하는데 사용 된 tured illumination microscopy (3D-SIM) 7 . 공동 면역 침전법, 풀다운 방법 및 효모 2 하이브리드 스크리닝 방법과 같은 생체 내에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 데 몇 가지 다른 방법을 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 기술은 다소 번거롭고 다량의 세포 또는 단백질을 필요로하거나 단백질의 과발현을 포함하여 실험적 인공물을 유발합니다. 보다 최근에는 Proximity Ligation Assay (PLA) 9 , 10 이라고 불리는 인 - 시튜 ( 즉 , 세포와 조직에서)의 단백질 - 단백질 상호 작용의 시각화 및 정량화를 가능하게하는 새로운 기술이 개발되었습니다. Pr관심있는 두 단백질을인지하는 imary 항체는 올리고 뉴클레오티드 (이른바 PLA 프로브)에 접합 된 2 차 항체에 의해 검출된다. 2 개의 상이한 2 차 항체가 1 차 항체에 의해 인식되는 단백질 사이의 상호 작용으로 인해 충분히 가깝다면, 접합 된 올리고 뉴클레오티드는 하이브리드 화되고 폐쇄 된 원형 DNA 기질을 형성하도록 연결될 수있다. 이 순환 기질은 롤링 서클 증폭에 의해 증폭되고, 형광색 - 결합 된 상보적인 올리고 뉴클레오타이드로 가시화된다. PLA를 사용하면, 단백질 - 단백질 상호 작용의 세포 내 위치는 형광 라벨 된 롤링 서클 증폭 - 제품이 PLA 프로브에 부착 된 상태로 보존된다. 이 분석법의 분해능은 항체의 직경이 약 7-10 nm 인 것으로 밝혀지면 &lt;50 nm입니다. 롤링 서클 증폭은 두 쌍의 항체 (primary + secondary)는 크기 (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm)로 정의 된 경계 내에서 물리적으로 상호 작용합니다. 신호 증폭 단계는 PLA 분석의 감도를 증가시키고 거의 발현되지 않은 단백질의 상호 작용을 검출 할 수있게합니다. PLA는 세포 간 기초 (per cell basis)로 정량화 할 수있는 뾰족한, 초점과 같은 신호 패턴을 생성함으로써 단백질 - 단백질 상호 작용의 세포 내 및 세포 간 변이를 평가할 수있다. DNA 복구 복합체 및 IRIF의 형성 및 조성은 인간 골육종 육종 상피 세포주 U2OS, 인간 배아 신장 세포주 HEK293 및 망막 색소 상피 세포주 RPE-1과 같은 접착 성 세포주에서 주로 연구된다. 성장하고 transfect하기 쉽습니다. 서스펜션 세포 배양은 림프 성 및 골수성 세포주와 같이 덜 사용되는데, 이들은 트랜스 팩션에 덜 민감하고 일반적으로 커버 슬립을 준수하지 않으므로 추가 / 대체 스트레스가 필요하다.이미징을위한 eps. 그러나 DNA 손상 반응은이 종양의 게놈 (운전자) 수차에 의해 자주 영향을 받기 때문에 림프계 및 골수 악성 종양의 맥락에서 매우 관련이 있으며 정상 림프구 및 골수이의 악성 형질 전환에 중추적 인 역할을한다 ( 전구 세포 (12 , 13 , 14) . 이 프로토콜은 정지 세포 배양에서 DNA 손상 유도 후 단백질 - 단백질 상호 작용을 평가하고 정량화하기 위해 PLA를 사용할 수있는 방법을 설명합니다. 여기에서, PLA는 G1 상 세포주기 정지를 겪도록 유도 된 인간 B 세포 백혈병 세포에서 DNA 손상시 ATM과 p53 간의 상호 작용을 결정하고 시각화하기 위해 수행된다. 참고로 여기에 제시된 프로토콜은 G1 구속 백혈병 세포에서 ATM 및 p53 상호 작용을 연구하는 것에 국한되지 않고 다른 단백질 - 단백질 상호 작용을 시각화하는 데 사용할 수도 있습니다다양한 세포 유형 및 현탁 세포 배양 물에 사용된다.

<table><tbody><tr><td>BV173 cell line</td><td>DSMZ</td><td>AC-20</td><td>BCR-ABL+ B-ALL cell line</td></tr><tr><td>SUP-B15 cell line</td><td>DSMZ</td><td>ACC-389</td><td>BCR-ABL+ B-ALL cell line</td></tr><tr><td>Iscove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s Medium (IMDM)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td>lot #: 064M3396</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>imatinib methanesulfonate</td><td>LC Laboratories</td><td>I-5508</td><td>Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution</td></tr><tr><td>neocarzinostatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N9162</td><td>Mutagenic/teratogenic, handle with care</td></tr><tr><td>KU55933</td><td>Selleckchem</td><td>S1092</td><td>Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution</td></tr><tr><td>Starfrost Microscopy Slides</td><td>Waldemar Knittel</td><td>VA11200 003FKB</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen liquid blocker</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin funnel</td><td>Q Path Labonord SAS</td><td>003411324</td><td></td></tr><tr><td>Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DUO92105</td><td>Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green</td></tr><tr><td>goat-anti-ATM</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A300-136A</td><td>PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies</td></tr><tr><td>rabbit-anti-phospho-Ser15-p53</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9284</td><td>We succesfully used lot #9284-4 in our studies</td></tr><tr><td>Vectashield antifading mounting medium with DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield antifading mounting medium</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde in PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>Also available from various other vendors</td></tr></tbody></table>

detection and visualization of dna damage-induced protein complexes in suspension cell cultures using the proximity ligation assay

DNA 손상 반응은 자발적으로 발생하거나, 유전 독성 스트레스에 의해 유발되거나, 또는 림프구에서 프로그램 된 DNA 붕괴의 문맥에서 나타나는 DNA 병변의 수리를 조율합니다. Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM 및 Rad3 관련 키나아제 (ATR) 및 DNA 의존성 단백질 키나제 (DNA-PKcs)의 촉매 서브 유닛은 DNA 손상의 유도시 활성화되는 첫 번째 물질이며, DNA 복구, 세포 사멸 및 세포 생존을 조절하는 네트워크의 중앙 조절 자. 종양 억제 경로의 일환으로 ATM과 ATR은 인산화를 통해 p53을 활성화시킴으로써 p53의 전사 활성을 조절합니다. DNA 손상은 또한 형광 현미경에 의해 시각화 된 DNA 손상 부위에 축적되는 DNA 손상 센서 및 수리 단백질의 복합체를 나타내는 소위 이온화 방사선 유도 초점 (IRIF)의 형성을 초래한다. 그러나 IRIFs에서 단백질의 공동 위치 화는 반드시 d직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용은 형광 현미경 검사의 해상도가 제한되어 있기 때문에 가능합니다. In situ Proximity Ligation Assay (PLA)는 전례가없는 특이성과 민감성으로 세포와 조직에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 직접 시각화 할 수있는 새로운 기술입니다. 이 기술은 관심있는 단백질에 결합하는 특정 항체의 공간적 근접성을 기반으로합니다. 질문 단백질이 ~ 40 nm 내에 있으면 증폭 반응은 항체에 접합 된 올리고 뉴클레오타이드에 의해 촉발되고 증폭 생성물은 형광 표지에 의해 시각화되어 상호 작용하는 단백질의 세포 내 위치에 해당하는 신호를 생성합니다. 예를 들어 ATM과 p53 사이에 확립 된 기능적 상호 작용을 사용하여 PLA가 DNA 손상 반응의 핵심 부분 인 단백질 간의 직접적인 상호 작용을 연구하기 위해 서스펜션 세포 배양에서 어떻게 사용될 수 있는지를 보여줍니다.

잔류 Ser15에서의 p53의 인산화는 ATM 키나제 활성에 의존하는 것으로 나타났다. 부유 세포 배양 물의 cytospin 조제에 대한 PLA 기술의 특이성을 증명하고 확인하기 위해, 세포주기의 G1- 단계에서 정지 된 BCR-ABL + B-ALL 세포의 2 시간 NCS 처리에 의한 DNA 손상 유도가 나타났다 예상대로 ATM과 phospho-Ser15-p53 사이의 특이 적 상호 작용을 일으켰다. Punctate PLA 신호는 NCS ( ...

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Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

여기에서는 유전 독성 스트레스에 노출 된 현탁 세포 배양 물에서 ATM과 p53 사이의 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하고 시각화하기 위해 현장에서의 근접 연결 분석 (PLA)이 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다.

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

detection-visualization-dna-damage-induced-protein-complexes

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.9K 조회수.  Academic Medical Center, University of Amsterdam, Lymphoma and Myeloma Center Amsterdam (LYMMCARE).  여기에서는 유전 독성 스트레스에 노출 된 현탁 세포 배양 물에서 ATM과 p53 사이의 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하고 시각화하기 위해 현장에서의 근접 연결 분석 (PLA)이 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 

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In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular machines centers on devices capable of directional motion, i.e. molecular motors, and on their scaled-down mechanical parts (wheels, axels, pendants etc) 7-9. This imitates the macro-machines, even though the physical properties essential for these devices, such as inertia and momentum conservation, are not usable in the nanoworld environments 10. Alternative designs, which do not follow the mechanical macromachines schemes and use mechanisms developed in the evolution of biological molecules, can take advantage of the specific conditions of the nanoworld. Besides, adapting actual biological molecules for the purposes of nano-design reduces potential dangers the nanotechnology products may pose. Here we demonstrate the assembly and application of one such bio-enabled construct, a semi-artificial molecular device which combines a naturally-occurring molecular machine with artificial components. From the enzymology point of view, our construct is a designer fluorescent enzyme-substrate complex put together to perform a specific useful function. This assembly is by definition a molecular machine, as it contains one 12. Yet, its integration with the engineered part - fluorescent dual hairpin - re-directs it to a new task of labeling DNA damage12.
Our construct assembles out of a 32-mer DNA and an enzyme vaccinia topoisomerase I (VACC TOPO). The machine then uses its own material to fabricate two fluorescently labeled detector units (Figure 1). One of the units (green fluorescence) carries VACC TOPO covalently attached to its 3'end and another unit (red fluorescence) is a free hairpin with a terminal 3'OH. The units are short-lived and quickly reassemble back into the original construct, which subsequently recleaves. In the absence of DNA breaks these two units continuously separate and religate in a cyclic manner. In tissue sections with DNA damage, the topoisomerase-carrying detector unit selectively attaches to blunt-ended DNA breaks with 5'OH (DNase II-type breaks)11,12, fluorescently labeling them. The second, enzyme-free hairpin formed after oligonucleotide cleavage, will ligate to a 5'PO4 blunt-ended break (DNase I-type breaks)11,12, if T4 DNA ligase is present in the solution 13,14 . When T4 DNA ligase is added to a tissue section or a solution containing DNA with 5'PO4 blunt-ended breaks, the ligase reacts with 5'PO4 DNA ends, forming semi-stable enzyme-DNA complexes. The blunt ended hairpins will interact with these complexes releasing ligase and covalently linking hairpins to DNA, thus labeling 5'PO4 blunt-ended DNA breaks.
This development exemplifies a new practical approach to the design of molecular machines and provides a useful sensor for detection of apoptosis and DNA damage in fixed cells and tissues.

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

We demonstrate the assembly and application of a molecular-scale device powered by a topoisomerase protein. The construct is a bio-molecular sensor which labels two major types of DNA breaks in tissue sections by attaching two different fluorophores to their ends.

DNA 손상 감지를위한 세미 인공 분자 기계 및 이용 체외 조립에

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

연구

생체공학

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in mammalian cell lines. Rather than globally assaying removal of xenobiotic-induced or spontaneous chromosomal DPC removal, this assay examines the repair of a homogeneous, chemically defined lesion specifically introduced at one site within a plasmid DNA substrate. Importantly, this approach avoids the use of radioactive materials and is not dependent on expensive or highly-specialized technology. Instead, it relies on standard recombinant DNA procedures and widely available real-time, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) instrumentation. Given the inherent flexibility of the strategy utilized, the size of the crosslinked protein, as well as the nature of the chemical linkage and the precise DNA sequence context of the attachment site can be varied to address the respective contributions of these parameters to the overall efficiency of DPC repair. Using this method, plasmids containing a site-specific DPC were transfected into cells and low molecular weight DNA recovered at various times post-transfection. Recovered DNA is then subjected to strand-specific primer extension (SSPE) using a primer complementary to the damaged strand of the plasmid. Since the DPC lesion blocks Taq DNA polymerase, the ratio of repaired to un-repaired DNA can be quantitatively assessed using qPCR. Cycle threshold (CT) values are used to calculate percent repair at various time points in the respective cell lines. This SSPE-qPCR method can also be used to quantitatively assess the repair kinetics of any DNA adduct that blocks Taq polymerase.

The goal of this protocol is to quantify the repair of defined DNA-protein crosslinks on plasmid DNA. Lesioned plasmids are transfected into recipient mammalian cell lines and low-molecular weight harvested at multiple time points post-transfection. DNA repair kinetics are quantified using strand-specific primer extension followed by qPCR.

간단 하 고 빠른, 양적 분석 결과에 플라스 미드 DNA-단백질 Crosslinks의 측정 수리에 포유류 세포로 페

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

유전학

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in understanding how such pathways are organized and how they function. There are many methods to detect protein-protein interactions in cells, but relatively few can be used to detect interactions between endogenous proteins. One such method, the proximity ligation assay (PLA), has several advantages to recommend its use. Compared to other common methods of protein-protein interaction analysis, PLA has relatively high sensitivity and specificity, can be performed with minimal cell manipulation, and, in the protocol described herein, requires only two target-specific antibodies derived from different species (e.g., from mouse and rabbit) and one specialized reagent: a set of secondary antibodies that are covalently linked to specific oligonucleotides that, when brought in close proximity of one another, create an amplifiable platform for in situ PCR or rolling circle amplification. In this presentation, we show how to apply the PLA technique to visualize changes in MST1 and MST2 proximity in fixed cells. The technique described in this manuscript is particularly applicable for the analysis of cell signaling studies.

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Here, we show how to use a Proximity Ligation Assay (PLA) to visualize MST1/MST2 heterodimerization in fixed cells with high sensitivity.

제자리에 근접 결 찰 분석 결과 사용 하 여 단백질 Isoforms의 Heterodimerization의 검출

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

생화학

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

DNA damage, including DNA double-stranded breaks and inter-strand cross-links, incurred during the S and G2 phases of the cell cycle can be repaired by homologous recombination (HR). In addition, HR represents an important mechanism of replication fork rescue following stalling or collapse. The regulation of the many reversible and irreversible steps of this complex pathway promotes its fidelity. The physical analysis of the recombination intermediates formed during HR enables the characterization of these controls by various nucleoprotein factors and their interactors. Though there are well-established methods to assay specific events and intermediates in the recombination pathway, the detection of D-loop formation and extension, two critical steps in this pathway, has proved challenging until recently. Here, efficient methods for detecting key events in the HR pathway, namely DNA double-stranded break formation, D-loop formation, D-loop extension, and the formation of products via break-induced replication (BIR) in Saccharomyces cerevisiae are described. These assays detect their relevant recombination intermediates and products with high sensitivity and are independent of cellular viability. The detection of D-loops, D-loop extension, and the BIR product is based on proximity ligation. Together, these assays allow for the study of the kinetics of HR at the population level to finely address the functions of HR proteins and regulators at significant steps in the pathway.

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

The D-loop capture (DLC) and D-loop extension (DLE) assays utilize the principle of proximity ligation together with quantitative PCR to quantify D-loop formation, D-loop extension, and product formation at the site of an inducible double-stranded break in Saccharomyces cerevisiae.

사카로마이세스 세레비시아에서 근접 결찰 및 정량적 PCR을 통한 상동 재조합 중간체의 검출

DNA damage, including DNA double-stranded breaks and inter-strand cross-links, incurred during the S and G2 phases of the cell cycle can be repaired by ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

검출<em&gt; 현장에서</em상기&gt; 단백질 - 단백질 복합체<em&gt; 초파리</em근접 내고 분석을 사용하기&gt; 애벌레 신경 근육 접합부

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

신경과학

Proximity Ligation Assay to Study Oncogene-Derived Transcription-Replication Conflicts

Both DNA replication and RNA transcription utilize genomic DNA as their template, necessitating spatial and temporal separation of these processes. Conflicts between the replication and transcription machinery, termed transcription-replication conflicts (TRCs), pose a considerable risk to genome stability, a critical factor in cancer development. While several factors regulating these collisions have been identified, pinpointing primary causes remains difficult due to limited tools for direct visualization and clear interpretation. In this study, we directly visualize TRCs using a proximity ligation assay (PLA), leveraging antibodies specific to PCNA and phosphorylated CTD of RNA polymerase II. This approach allows precise measurement of TRCs between replication and transcription processes mediated by RNA polymerase II. The method is further enhanced through DNA primers conjugated covalently to these antibodies, coupled with PCR amplification using fluorescent probes, providing a highly sensitive and specific means of detecting endogenous TRCs. Fluorescence microscopy enables the visualization of these conflicts, offering a powerful tool to study genome instability mechanisms associated with cancer. This technique addresses the gap in direct TRC visualization, allowing for a more comprehensive analysis and understanding of the underlying processes driving genome instability in cells.

Here, we present a sensitive and specific method to detect oncogene-induced transcription-replication conflicts (TRCs) using the proximity ligation assay (PLA). This approach leverages specific antibodies targeting PCNA and phospho-CTD RNAPII, enabling the assessment of TRC prevalence between RNA polymerase II transcription and DNA replication machinery.

종양유전자 유래 전사-복제 충돌을 연구하기 위한 근접 결찰 분석

Both DNA replication and RNA transcription utilize genomic DNA as their template, necessitating spatial and temporal separation of these processes. ...

암 연구학

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the JDP family could form transient heterocomplexes in eukaryotes to fine-tune substrate selection for the 70 kDa heat shock protein (Hsp70) chaperone-based protein disaggregases. The JDP complexes target acute/chronic stress induced aggregated proteins and presumably help assemble the disaggregases by recruiting multiple Hsp70s to the surface of protein aggregates. The extent of the protein quality control (PQC) network formed by these physically interacting JDPs remains largely uncharacterized in vivo. Here, we describe a microscopy-based in situ protein interaction assay named the proximity ligation assay (PLA), which is able to robustly capture&#160;these transiently formed chaperone complexes in distinct cellular compartments of eukaryotic cells. Our work expands the employment of PLA from human cells to yeast (Saccharomyces cerevisiae) and bacteria (Escherichia coli), thus rendering an important tool to monitor the dynamics of transiently formed protein assemblies in both prokaryotic and eukaryotic cells.

Cognate J-domain proteins cooperate with the Hsp70 chaperone to assist in a myriad of biological processes ranging from protein folding to degradation. Here, we describe an in situ proximity ligation assay, which allows the monitoring of these transiently formed chaperone machineries in bacterial, yeast and human cells.

박테리아, 효모 및 인간 세포에서 일시적으로 형성된 분자 샤페론 어셈블리의 시투 모니터링

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

생물학

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

면역형광에 의한 DNA 수리 단백질 상호작용의 시각화

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

<meta charset="utf8"></head><body>DNA 손상에서 단백질 상호 작용 및 국소화 평가

Proximity Ligand Assay to Localize Proteins in DNA Damage Sites

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that cooperate in this process allows the identification of alternative targets for therapeutic intervention in several diseases, such as cancer, aging-related diseases, and chronic inflammation. The Proximity Ligand Assay (PLA) emerged as a tool for estimating interaction between proteins as well as spatial proximity among organelles or cellular structures and allows the temporal localization and co-localization analysis under stress conditions, for instance. The method is simple because it is similar to conventional immunofluorescence and allows the staining of an organelle, cellular structure, or a specific marker such as mitochondria, endoplasmic reticulum, PML bodies, or DNA double-strand marker, yH2AX simultaneously. The phosphorylation of the S139 at Histone 2A variant, H2AX, then referred to as yH2AX, is widely used as a very sensitive and specific marker of DNA double-strand breaks. Each focus of yH2AX staining corresponds to one break in DNA that occurs a few minutes after the damage. The analysis of changes in yH2AX foci is the most common assay for studying if the protein of interest is implicated in DNA damage response (DDR). Whether a direct role in the DNA damage site is expected, fluorescence microscopy is used to verify the colocalization of the protein of interest with yH2AX foci. However, except for the new super-resolution fluorescence methods, to conclude, the local interaction with DNA damage sites can be a little subjective. Here, we show an assay to evaluate the localization of proteins in the DDR pathway using yH2AX as a marker of the damage site. This assay can be used to characterize the temporal localization under different insults that cause DNA damage.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: DNA 손상 반응에서 단백질 상호 작용을 특성화하기 위해 근접 리간드 분석과 Gamma-H2AX 염색의 결합

Here, we present a simple and rapid protocol for the detection of protein interaction at DNA damage sites.

DNA 손상 부위의 단백질을 국소화하기 위한 Proximity Ligand Assay

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Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

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