이 작품은 프리츠 티센 재단 (Az.10.14.2.152)에 의해 지원되었다. 우리는 조직 삽입 시설 및 CMMC의 현미경의 핵심 시설에 감사하고 있습니다. 우리는 중심체와 세포 뼈대 생물학 연구소의 회원들에 의해 제공되는 토론 및 기술 지원에 대한 감사합니다. 우리는 원고를 교정하기위한 이명 Gooi 감사합니다.

뇌 Organoids의 1 세대 (이십삼일) <ol><li> neuroectoderm의 개시 (5 일) 주 : 다음 사항이 분화를 시작하기 전에 고려되어야한다. 인간 iPSCs를 얻기 위해 프로그래밍 방법 (lentiviral- 센다이 바이러스에 episomal-, 또는 마이크로 RNA 기반 등)을 이상적으로 모든 환자에게 동일 및 IPSC 라인을 제어한다. 다양한 프로그래밍 키트 및 출판 프로토콜에 따라 지침은 15, 16, 17, 18 사용할 수 있습니다. 인간의 IPSC 라인의 품질은 최적의 차별화를 달성하는 열쇠입니다. 현미경 콜로니 및 세포 형태를 모니터링하고 Oct3 / 4, Nanog를하거나, TRA-1-60으로 마커의 발현을 검사하여 분화능을 확인. <ol><li> Engelbreth-홀름 - 떼 코팅 접시에 매체 A의 공급이없는 조건에서 배양 인간 iPSCs(EHS) 행렬. 참고 : 인간 iPSCs 성장 피더 무료 무 혈청 정의 된 문화 상태를 유지하는 것이 차별화의 시작하기 전에 마우스 배아 피더 세포 (MEFs에)의 제거를위한 추가 단계를 피하기 위해. 인간 iPSCs위한 최적 경로 번호는 전체에 통로 (70)에 프로그래밍에 통로 (15)로부터 분화 범위를 시작한다. 계대 때 새로운 접시 응집체를 전송할 낮은 기계적 응력 적합한 세포 분리 용액 및 2 ㎖의 혈청 피펫을 사용하여 셀로 골재 hiPSC 콜로니를 분리. 이것은 대부분의 IPSC 라인의 분화와 세포 사멸을 유도 수로, 단일 세포로 분리하지 마십시오. 그것은 장기 단일 세포 계대 인간 iPSCs 19, 20 게놈 변경을 증가시킬 수 있다고보고되었다. 이 iPSCs의 전체 생존 능력을 감소시키기 때문에, 박리 액을 제거하기 위해 원심 분리 단계를 필요로 세포 분리 과정을 피한다. 테스트미생물 오염, 정기적으로, 특히 마이코 플라스마, 모든 문화는이하여 iPSCs의 품질과 분화 능력을 변경할 수 있기 때문이다. <ol><li> 코트 제조업체의 지침에 따라 EHS 매트릭스와 60mm 조직 배양 접시. </li><li> 1 × 106의 인간 iPSCs 분취 량을 해동. EHS 매트릭스에 코팅 매체 A 5 ㎖를 (재료 표 참조)를 함유하는 60-mm 조직 배양 접시에 iPSCs 종자. 세포 ~ 80 % 포화 상태에 도달했을 때 5 ~ 7 일 후 일상 매체와 경로를 변경합니다. 참고 : 통로 분화를 시작하기 전에 적어도 한 번 같은 식민지 (21)의 효소가없는 분리와 같은 표준 방법을 사용하여 80 %의 포화 상태에서 해동 iPSCs를. 제조자의 다음 iPSCs를 영양 혼합물 F12 (DMEM / F12) 및 배양 : 요약하면, 상기 IPSC 매체를 제거 예열 37 ° C 둘 베코 변형 이글 배지로 한번 세척 세포시약 A를 이용하여 설명은 (재료 표 참조). 단일 세포 분리를 방지하기 위해 권장되는 배양 시간을 초과하지 마십시오. 인간 iPSCs은 분리 및 응집과 같은 단일 세포로하지 부동한다. 그들은 다음 새 EHS 매트릭스 코팅 요리로 전송할 수 있습니다; 예를 들어, IPSC 한 60-mm 요리는 4 개의 새로운 60 mm 요리에 배포 할 수에서 집계합니다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 마이코 플라즈마 검출 키트와 함께 마이코 플라스마를 확인합니다. 마이코 플라스마가 iPSCs의 분화 능력을 변경할 수 만 마이코 플라스마없는 iPSCs를 사용합니다. </li></ol></li><li> iPSCs (80 % 융합)를 해리 B. 시약을 사용하여 단일 세포 현탁액을 제조 <ol><li> 예열 (37 ° C) DMEM / F12와 iPSCs 번 씻는다. </li><li> 37 ° C에서 5 분, 5 % CO 2의 iPSCs를 (a 60mm 접시에 예를 들면, 1 mL)을 예열 시약 B를 첨가하고 배양한다. </li><li> 측면과 하단에 손가락으로 톡 20 배요리는 iPSCs를 분리합니다. 현미경으로 세포의 분리를 확인합니다. </li><li> 1 mL를 마이크로 피펫으로 접시에 상하 5 회 세포 현탁액 피펫. </li><li> 시약 B 1 mL로 희석하고 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 수집 매체 A의 3 mL를 넣고. </li><li> 천천히 실온에서 4 분 동안 iPSCs (500 XG)를 스핀 다운. </li><li> B 매질 1 ㎖의 세포 펠렛을 재현 탁하고, 혈구 세포 수를 계산. 참고 : 부유에만 매체 B를 사용하여 알고 있어야합니다. 이 분화를 억제 할 수의 bFGF의 너무 높은 농도를 포함으로, 매체 A를 사용하지 마십시오. </li></ol></li><li> 10 μM (ρ) - 관련 키나제 억제제 (Y-27632)로 보충 된 배지 B의 용액 당 4.5 × 105 세포에 세포 현탁액을 희석. </li><li> 비 부착, V 바닥 96 웰 플레이트에 잘 당 100 μL를 추가합니다. 참고 : 확인 세포를 동등하게 SUS에 분포되어100 μL 부분을 인출하기 전에 튜브 매번 진탕 연금. 각각의 웰은 크기 및 형상 (원형, 정의 된 표면)에 neurosphere를 균일를 얻기 위하여 동등한 세포 수를 포함하는 것이 중요하다. </li><li> 부드럽게 3 분 동안 500 XG하고 실온에서 세포를 플레이트의 회전 속도, 37 ° C, 5 % CO 2에서 배양한다. </li><li> 50 μL를 제거하고 다음 5 일 동안 각 우물에 신선한 매체 B의 50 μL를 추가하여 매일 매체를 변경합니다. </li></ol></li></ol> EHS 매트릭스 2. 임베딩 neurosphere를 (4 일) <ol><li> / W (않고 100 (v / v)로 보충 2 : 200 (v / v)로 보충 1, 1 : 1 : DMEM / F12 매체 C (V / V) 1 1 혼합물은 다음을 혼합하여 neurosphere 매체를 준비 O) 비타민 A, 1 : 100 L 글루타민, 0.05 mM 비 필수 아미노산 (MEM), 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎍ / ㎖의 스트렙토 마이신, 1.6 g / L 인슐린, 0.05 밀리미터 β 머 캅토 에탄올. </li><li> neurosphere를 재치를 수집HA ~ 2mm 팁을 사용하여 200 μL 마이크로 피펫 미리 멸균 가위로 잘랐다. </li><li> 빈 100mm 접시에 약 5mm 떨어진 파라핀 필름 (3 × 3cm 2)에 서로 neurosphere를 놓고 조심 가능한 남은 배지만큼 제거한다. </li><li> 각 단일 neurosphere 상 EHS 행렬의 드롭 (7 μL)을 추가한다. </li><li> EHS 매트릭스 인큐베이터에서 15 분 동안 인큐베이션 neurosphere를 가진 방울. </li><li> neurosphere 매체를 세척하여 파라핀 필름에서 조심스럽게 neurosphere를 씻으십시오. 플러시, 1 mL의 마이크로 피펫과 neurosphere 배지 10 ㎖를 함유하는 새로운 100mm 페트리 접시를 사용한다. </li><li> 다음 4 일 동안 neurosphere를 품어 하루 2 신선한 neurosphere 매체의 2 mL를 넣어. 주 : EHS 매트릭스 내장 neurosphere를가 접시 한쪽에 함께 응집되지 않도록 인큐베이터에있는 선반이 평평한 지 확인합니다. </li></ol> 로타리 정지 3. Organoids문화 (14 일) <ol><li> 200 (v / v)로 보충 1, 1 : 100 (v / v)로 보충 2 / O w 1 : DMEM / F12 매체 C (V / V) 1 1 혼합물은 다음을 혼합하여 뇌 유사 장기 매체를 준비 비타민 A, 1 : 100 L 글루타민, 0.05 mM의 MEM, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎍ / ㎖의 스트렙토 마이신, 1.6 g / L 인슐린, 0.5 μM dorsomorphin 5 μM SB431542, 0.05 밀리미터 β 머 캅토 에탄올. </li><li> 측면 아암을 각각 스피너 플라스크 뇌 유사 장기 배지 100 ㎖를 첨가하고, 적어도 20 분 동안 사전 - 온난화 인큐베이터에 배치. </li><li> 제조업체의 지침에 따라, 25 rpm에서 교반 프로그램을 설정합니다. 참고 : 스피너 플라스크에 EHS 매트릭스 내장 neurosphere를 전송하기 전에, 그들은 모두 분리되어 있는지 확인합니다. 두 개 이상이 EHS 매트릭스를 통해 연결된 경우, 메스 접속 행렬 절단으로 분리. </li><li> 조심 유사 장기 배지 100 ㎖을 함유하는 스피너 플라스크에 EHS 행렬 매립 neurosphere를 전송할 우리2 ㎖의 혈청 피펫을 보내고. 플라스크에 neurosphere를 전송하는 스피너 플라스크의 측면 팔을 사용합니다. </li><li> 37 ℃ 및 5 % CO 2 인큐베이터에서 자기 교반 플랫폼 스피너 플라스크로; 이것은 유사 장기 문화의 날 0입니다. </li><li> (또는 더 자주 색상의 변화가있을 때) 매체의 절반을 제거하고 신선한 매체의 동일한 금액을 추가하여 일주일에 한 번 매체를 변경합니다. 참고 : 인큐베이터에서 스피너 플라스크를 복용하는 경우, organoids는 플라스크의 아래로 가라 앉을 수 있도록 3-5 분을 기다립니다. 액체의 표면 (펌프에 연결된) 유리 피펫 팁을 배치하여 매체를 제거; 신중 일측 개구부 / 플라스크 아암 통해 매체 대기음. 이러한 조작은 층류 후드에서 수행해야합니다. </li></ol> 뇌 Organoids 4. 분석 <ol><li> organoids의 고정 <ol><li> 스피너 플라스크 문화 위스콘신의 14 일에 organoids를 수집절단 한 ML 마이크로 피펫 (컷 ~ 5mm)를 토륨. 60 밀리 접시에 이들 모두를 넣고 3 분 동안 따뜻한 DMEM / F12 5 ㎖로 한번 씻어. </li><li> 따뜻한 4 % 파라 포름 알데하이드 500 μL (PFA)와 함께 1.5 ㎖의 튜브를 준비한다. 주의 : PFA의 정착액을 처리 할 때 안전 후드 아래에 피부와 눈 보호 작업을 착용 할 것. </li><li> 각각 개별적으로 각각의 관을 실온에서 적어도 30 분 동안이를 해결 유사 장기 놓는다. 이상 60 분 동안 organoids를 수정하지 마십시오. organoids를 이동하려면 접종 루프 또는 편리 다른 궁리를 사용합니다. </li><li> PFA를 제거하고 PBS 1 ml로 10 분마다 두 고정 organoids 씻는다. </li><li> 추가로 사용할 때까지, 최대 7 일 동안 4 ℃에서 PBS 1 ㎖에 organoids 보관. </li></ol></li><li> 냉동 절편의 organoids를 포함하기 <ol><li> PBS를 제거하고이를 cryofreezing 전에 organoids을 탈수 튜브 당 증류수 용액에 30 % 수크로오스 1 mL를 넣고; sucro를 추가 한 후SE 용액은 organoids 표면에 부유한다. 4 ℃에서 자당 용액에 하룻밤 보관 organoids; 다음날함으로써 organoids는 튜브의 아래쪽으로 침몰한다. 주 : 필요한 경우 Organoids는 자당 용액에 4 ℃에서 최대 3 ~ 5 일 동안 저장 될 수있다. </li><li> 최적 절단 온도 촬영기 화합물 400 μL와 비닐 시편 금형을 채우고 몰드의 중앙에 배치 유사 장기를 접종 루프를 사용한다. 샘플 이름 몰드 림 라벨. </li><li> 냉동 절편까지 -80 ° C에서 유사 장기 함유 주형 동결. </li><li> 코트 된 유리 실온에서 5 분 동안 PBS에서 0.1 % 폴리 -L- 라이신 용액 (PLL)와 cryoslides하게 슬라이드하고 3 시간 동안 건조. 4 ° C에서 슬라이드를 저장하고 사용하기 전에 실내 온대로 따뜻하게. 참고 : 멀리 떠에서 유사 장기 조각을 차단하므로 PLL - 코팅, 중요한 단계입니다. 수집 최대 3 4 ℃에서 보관 PLL 용액달. 재사용 전에, 0.22 μm의 주사기 필터로 실온까지 따뜻해하자. </li><li> PLL 코팅 유리 20 내지 50 ㎛의 두께로 슬라이스 단면의 cryofrozen organoids는 22 cryoslides. 섹션과 슬라이드는 실온에서 1 시간 동안 건조 시키십시오. 추가 처리 될 때까지 -80 ℃에서 보관 섹션. </li></ol></li></ol> 유사 장기 섹션 5. 면역 형광 염색법 참고 : 네 스틴, 신경 전구 마커 및 TUJ1, 범 신경 세포 마커 염색 organoids의 일반적인 특성, 내용은 좋습니다. 추가 예, 정단 분열 반경 교세포 라벨 포스 멘틴 (p-빔) 및 Arl13b과 면역 염색법으로, 섬모를 들어 설명한다. 세포 사멸을 테스트하려면, 터미널 데 옥시 뉴 클레오 타이 딜 트랜스퍼 (TDT) 된 dUTP 닉 엔드 라벨 (TUNEL) 분석을 사용합니다. 먼지로부터 보호하기 위해 배양시 플라스틱 박스에 슬라이드를 놓고 빛및 건조. <ol><li> 실온에서 30 분간 슬라이드를 해동. </li><li> PFA 유도자가 형광을 켄칭 3 분간 PBS 글리신 200 μL (PBS에서 글리신 0.225 g)로 두 번 슬라이드를 세척한다. </li><li> 0.5 % 트리톤 X100 200 μL / 실온에서 10 분 동안 PBS 용액 중 0.1 % 트윈으로 섹션 Permeabilize 하시려면. </li><li> 3 분 동안 PBS-글리신 액 200 μL로 두 번을 씻으십시오. </li><li> 비특이적 항원 결합을 차단 실온 또는 밤새 4 ℃에서 1 시간 동안 PBS에서 0.5 % 어류 젤라틴 200 μL / 0.1 % 트리톤 (Triton) X100로 부화. 참고 : TUNEL 분석이 필요한 경우, 제조사의 프로토콜에 따라 분석을 수행합니다. 이 이차 항체를 방해하고 나중에 사용할 때 형광을 해소 하듯, 면역 염색을 수행하기 전에 TUNEL 분석을 시작합니다. </li><li> 네 스틴, 1 : 다음의 농도로 용액으로 차단 항체를 희석 (200); P-빔, 1 : 500; TUJ1, 1 : 200;Arl13b 1:20; 및 이차 항체, 1 : 1,000. </li><li> 실온 또는 밤새 4 ℃에서 1-2 시간 동안 제 차 항체 200 μL (예를 들어, 네 스틴)로 인큐베이션. </li><li> 차단 용액 200 μL로 3 × 3 분 동안 세척 하였다. </li><li> 차단 용액 1,000 실온에서 1-2 시간 동안 200 μL의 슬라이드를 배양 : 제 (항 - 마우스 488) 1 차 항체를 희석. 이제부터 항상 빛으로부터 슬라이드를 보호합니다. </li><li> 차단 용액 200 μL로 3 × 3 분 동안 세척 하였다. </li><li> 실온에서 1-2 시간 또는 밤새 39 ° C에 대해 (예 TUJ1) 다음에 일차 항체 200 μL와 인큐베이션. </li><li> 차단 용액 200 μL로 3 × 3 분 동안 세척 하였다. </li><li> 실온에서 1-2 시간 동안 다음 이차 항체 (항 - 토끼 647) 200 μL를 추가합니다. </li><li> 3 × 3 분 동안 세척 하였다. 차단 용액 200 μL와. </li><li> 30nm의 진한 4에 200 μL &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)을 추가핵 염색을 실온에서 15 분 동안 PBS에서 entration. </li><li> 차단 용액 200 μL 2 × 3 분 동안 세척 하였다. </li><li> 증류수 200 μL로 1 × 1 분 동안 세척하고 명백한 물방울이 더 이상 보이지 않을 때까지 섹션, 10-20 분 동안 건조하자. </li><li> 매체를 내장으로 섹션을 탑재합니다. 그 몇 주까지 4 ° C에서 빛으로부터 보호 저장합니다. </li><li> 이미지에 대한 현미경 분석 유사 장기 심실 영역 프리미티브 피질골 플레이트, 및 다른 관심 영역에 대한 개요를 진행. </li><li> 1, 10을 사용하는 형광 색소 표지 된 이차 항체에 따라 선택된 오일 63X 대물 형광 필터와 공 촛점 현미경을 사용한다. </li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+freezing+and+cryosectioning+E12.5+mouse+brain.">Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Yingling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroepithelial+stem+cell+proliferation+requires+LIS1+for+precise+spindle+orientation+and+symmetric+division.">Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division.</a> Cell. 132, 474-486 (2008).</li><li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+step+for+the+cell,+a+giant+leap+for+mankind:+a+hypothesis+of+neocortical+expansion+during+evolution.">A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution.</a> Trends Neurosci. 18, 383-388 (1995).</li><li>Hu, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency.">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).</li><li>Wilson, P. G., Stice, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+differentiation+of+neural+rosettes+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).</li><li>Dhara, S. K., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Neural differentiation of human embryonic stem cells.</a> J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).</li><li>Christie, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+synthetic+retinoid+derivatives+as+inducers+of+stem+cell+differentiation.">Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation.</a> Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+enhancement+of+neural+differentiation+from+human+ES+and+iPS+cells+regardless+of+their+innate+difference+in+differentiation+propensity.">Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity.</a> Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).</li><li>Gabriel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Zika+Virus+Isolates+Induce+Premature+Differentiation+of+Neural+Progenitors+in+Human+Brain+Organoids.">Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids.</a> Cell stem cell. , (2017).</li><li>Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+Characterization+of+a+MYF5+Reporter+Human+iPS+Cell+Line+Using+CRISPR/Cas9+Mediated+Homologous+Recombination.">Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination.</a> Sci. Rep. 6, 18759 (2016).</li><li>Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genomic+correction+methods+in+human+iPS+cells+using+CRISPR-Cas9+system.">Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods. 101, 27-35 (2016).</li><li>Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Isogenic+Human+iPS+Cell+Line+Precisely+Corrected+by+Genome+Editing+Using+the+CRISPR/Cas9+System.">Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System.</a> Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).</li><li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+organoids+recapitulate+gene+expression+programs+of+fetal+neocortex+development.">Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure.">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165, 1238-1254 (2016).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain-like+Organoids+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Contain+Functional+Dopaminergic+and+Neuromelanin-Producing+Neurons.">Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons.</a> Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).</li><li>Mariani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXG1-Dependent+Dysregulation+of+GABA/Glutamate+Neuron+Differentiation+in+Autism+Spectrum+Disorders.">FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders.</a> Cell. 162, 375-390 (2015).</li><li>D'Avanzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+in+3D+culture:+challenges+and+perspectives.">Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives.</a> Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

MCPH는 생체 내에서 또는 단순 인간의 세포 배양 시험관에 접근에서 동물 모델에서 효과적으로 요약 할 수없는 복잡한 인간의 신경 발달 장애이다. MCPH의 임상 양상은 초기 신경이 시작될 때 첫 번째 임신 동안 표시하기 시작합니다. 따라서, 3D 뇌 organoids는 MCPH 개발을 모델링하는 신뢰할 수있는 실험 시스템을 나타냅니다. 또한, 3D 인간 뇌 organoids는 중요한, ⅲ) 다양한 분화 I)들은 다양...

같은 소두증과 같은 인간의 신경 발달 장애는 단지 가난으로 인해 인간의 두뇌가 확장 된 대뇌 피질의 표면, 인간이 아닌 동물과는 다른 독특한 기능을 가지고 있다는 사실을 동물 모델에서 공부하실 수 있습니다. 이 측면은 인간의 두뇌 발달을 충분히 체외 세포 배양 시스템에서, 2 차원에서 연구 할 수없는 복잡한 과정을 수 있습니다. 신흥 3D 배양 기술은 유도 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)에서 조직 형 organoids의 생성을 허용한다. 차원 현탁 배양에서 다 능성 줄기 세포의 체외 분화 조직, 층상 조직의 1, 2, 3를 야기한, 적시 영역 특정 수단으로 각종 종류의 세포를 형성 할 수있다. 3D 문화 기술을 개척하고 줄기 세포에서 시작, 기관 형성의 복잡성을 신화화 실험실 덕분에,우리는 인간의 두뇌 발달의 초기 이벤트를 묘사하고 시험관 1, 2, 3 소두증을 모델링 뇌 organoids를 생성하는 강력한 방법을 개발했다. 우리가 랭카스터 동부 등에 의해 개발 된 일본어 방법을 채택하는 것이 주목된다. 대뇌 organoids 1을 생성한다. 이 방법은 우리의 실험 요구 사항에 따라 수정되었습니다. 가브리엘 등의 알에서 연구의 목적. 두뇌 개발하는 동안 신경 줄기 세포의 유지 보수의 세포 및 분자 메커니즘을 분석했다. 이를 위해, 기계 론적 연구는 소두증 환자 4에서 파생 된 3D 뇌 organoids에서 신경 전구 세포 (NPC들)을 분석하여 수행되었다. 이 환자는 CPAP, 중심체 생합성 5에 필요한 보존 centrosomal 단백질에 돌연변이를 실시했다. 널리 인정 저자논문 소두증는 NPC 풀의 고갈의 결과 인 것으로하고,이 중 세포 사멸 또는 분화 조기 1, 6, 7, 8, 9에 기인 할 수있다. 소두증 뇌 organoids의 심실 영역 (VZs)를 분석함으로써, NPC의 상당수는 건강한 공여체 (4)로부터 유도 뇌 organoids 달리 비대칭 세포 분열을 겪는 것으로 나타났다. 소두의 뇌 organoids의 광범위한 현미경 및 생화학 분석은 적절 섬모의 분해 4 CPAP에 대한 예기치 않은 역할을 한 것으로 밝혀졌습니다. 구체적으로는, 돌연변이가 CPAP NPC의 조기 (4)의 분화를 초래 지연 섬모 분해 지연 세포주기 재진입와 연관된다. 이러한 결과는 소두증과 일에 섬모의 역할을 제안신경과 뇌의 크기 제어 10시 EIR 참여. 이 프로토콜의 첫 번째 부분은 뇌 균질 organoids를 생성하는 세 단계 방법의 설명이다. 앞서 언급 한 바와 같이, 원래 랭커스터 프로토콜은 적응하고 우리의 목적 (1)에 맞게 수정되었습니다. 첫째, 인간 iPSCs는 Engelbreth-Holm이 - 스웜 (EHS) 행렬에 정의 된 장치가없는 상태에서 배양했다. 이 단계는 공급에 의존하는 만능 줄기 세포 배양의 변화를 방지 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 신경 분화 유도 신경 상피 iPSCs로부터 시작 형성한다. 배아 체 (EB)의 형성 공정, 및보다 제어 지시하게 신경 분화의 진행을 스킵함으로써. 이 방법은 중배엽 및 내배엽 다른 생식 세포 층의 자발적 무향 형성을 제한한다. 이 프로토콜을 적용하여, 신경 근엽을 포함 neurosphere를가 EH을 위해 5 일에 수확 할 수있다S 행렬 삽입 및 고정 현탁 배양. 우리 프로토콜의 세 번째 단계에 사용 된 배지는 유사 장기 dorsomorphin 및 SB431542로 보충된다. Dorsomorphin 뼈 형태 형성 단백질 (BMP)의 소분자 억제제 및 SB431542은 TGFβ / 티빈 / 절점 신호 전달 체계를 억제한다. 이러한 요인들의 조합은 신경 분화를 더 효율적으로 단독보다 11, 12, 13, 14, 레티노 산을 촉진 할 수있다. 요컨대, 이러한 수정은 organoids에서 최소한의 변화로, 뇌 organoids의 재현 세대 수 있습니다. 중요한 것은,이 방법은 견고 중심체와 세포주기 역학에 영향을 미치는 유전자 변이를 가지고 환자 iPSCs에서 소두의 뇌 organoids를 생성하기 위해 적용되었다. 이 프로토콜의 두 번째 부분은 BR을 준비하는 지침을 제공합니다아인은 분석 및 소두증의 세포 결함의 해석 organoids. 이것은 고정, 저온 절편, 면역 형광 염색법, 및 공 촛점 현미경 분석을 포함한다. 이 프로토콜은 예상 된 결과에 대한 자세한 설명과 해석에 대한 안내와 함께 독자를 제공 할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Anti-mouse 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Anti-rabbit 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21245</td><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>Arl13b</td><td>proteintech</td><td>17711-1-AP</td><td>ARL13B rabbit polyclonal antibody&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CELLSPIN system</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>183001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>32670</td><td>4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco, US</td><td>31331093</td><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P5499</td><td>Compound C; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Embedding medium</td><td>AppliChem</td><td>A9011, 0100</td><td>Mowiol; embedding medium; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified</td></tr><tr><td>Fish gelatin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>G7765-250ML</td><td>Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>A1067,1000</td><td>Glycine for molecular biology; multiple suppliers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Inoculation loop with needle, disposable (1 &amp;micro;L)</td><td>Sigma Aldrich, US</td><td>BR452201-1000EA</td><td>multiple suppliers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>I3536-100MG</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco, US</td><td>25030081</td><td>L-glutamine (200 mM)</td></tr><tr><td>Medium A</td><td>Stem cell technologies</td><td>#05850</td><td>mTeSR1 (hiPSC medium)</td></tr><tr><td>Medium B</td><td>Stem cell technologies</td><td>#05835</td><td>Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium</td></tr><tr><td>Medium C</td><td>Gibco, US</td><td>21103049</td><td>Neural Basal Medium</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco, US</td><td>11140035</td><td>MEM non-essential amino acids solution (100x)</td></tr><tr><td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td><td>Lonza, Switzerland</td><td>#LT07-218</td><td>Mycoplasma detection kit; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Novus biologicals</td><td>NBP1-92717</td><td>Nestin mouse monoclonal antibody (4D11)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>AppliChem</td><td>A3813, 0500</td><td>4% in PBS, store solution at -20 &amp;deg;C; caution: wear skin and eye protection and work under hood&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS tablets</td><td>Gibco, US</td><td>18912014</td><td>See manufacturer&amp;acute;s instructions; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)</td><td>Gibco, US</td><td>15140122</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine solution (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P8920-100ML</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>pVim</td><td>MBL</td><td>D076-3S</td><td>Phospho-Vimentin (Ser55) mAb</td></tr><tr><td>Reagent A&amp;nbsp;</td><td>Stem cell technologies</td><td># 05872</td><td>Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer&amp;acute;s protocol; alternative products from muliple suppliers available</td></tr><tr><td>Reagent B&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>A6964-100ML</td><td>Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 &quot;enzymatic cell dissociation solution&amp;rdquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Research Cryostat Leica CM3050 S</td><td>Leica biosystems</td><td>CM3050 S</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1067</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Spinner flask 250 mL</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>182026</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>AppliChem</td><td>A4734, 1000</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Superfrost ultra plus microscope slides</td><td>Thermo scientific, US</td><td>J3800AMNZ</td><td>Slides should be labeled with a &quot;+&quot; and positively charged</td></tr><tr><td>Supplement 1</td><td>Gibco, US</td><td>17502048</td><td>N-2 supplement (100x)</td></tr><tr><td>Supplement 2 w/o Vitamin A</td><td>Gibco, US</td><td>12587010</td><td>B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, NL</td><td>4565</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>Sakura, NL</td><td>4583</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A1388,0500</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>T2200</td><td>&amp;beta;-Tubulin III (rabbit polyclonal)</td></tr><tr><td>TUNEL assay</td><td>Promega, US</td><td>G3250</td><td>DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tween 20 for molecular biology</td><td>AppliChem</td><td>A4974,0500</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>waterproof sheet</td><td>BEMIS company, inc.</td><td>PM996</td><td>Parafilm &amp;ldquo;M&amp;rdquo;; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Y-27632&amp;nbsp;</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1049</td><td>ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco, US</td><td>31350010</td><td>2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers</td></tr></tbody></table>

generation of ipsc-derived human brain organoids to model early neurodevelopmental disorders

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue. 
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro. 
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

뇌 organoids의 생성은 연속 배양 (그림 1A)의 적어도 세 주이 필요합니다. 재현 가능한 결과를 달성하기 위해, 우리는 연구자가 모든 단계를 문서화하고, 중요한 매체 구성 요소, 시점, 세포 처리에 관한 변경을 방지하는 것이 좋습니다. 여기서 우리는 중요한 이정표가 실험의 끝에서 충분한 품질의 organoids를 얻기 위해 도달하는 경우 평가하는 방법에 대한 요약?...

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Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

IPSC 파생 된 인간의 두뇌 Organoids의 세대는 초기 신경 발달 장애를 모델링하기

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

19.6K 조회수.  University of Cologne. Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described. 

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Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. Efforts to study human cerebral cortex development have been limited by the availability of model systems. Translating results from rodent studies to the human system is restricted by species differences and studies on human primary tissues are hampered by a lack of tissue availability as well as ethical concerns. Recent development in human pluripotent stem cell (PSC) technology include the generation of three-dimensional (3D) self-organizing organotypic culture systems, which mimic to a certain extent human-specific brain development in vitro. Currently, various protocols are available for the generation of either whole brain or brain-region specific organoids. The method for the generation of homogeneous and reproducible forebrain-type organoids from induced PSC (iPSC), which we previously established and describe here, combines the intrinsic ability of PSC to self-organize with guided differentiation towards the anterior neuroectodermal lineage and matrix embedding to support the formation of a continuous neuroepithelium. More specifically, this protocol involves: (1) the generation of iPSC aggregates, including the conversion of iPSC colonies to a confluent monolayer culture; (2) the induction of anterior neuroectoderm; (3) the embedding of neuroectodermal aggregates in a matrix scaffold; (4) the generation of forebrain-type organoids from neuroectodermal aggregates; and (5) the fixation and validation of forebrain-type organoids. As such, this protocol provides an easily applicable system for the generation of standardized and reproducible iPSC-derived cortical tissue structures in vitro.

Cerebral organoids represent a new model system to investigate early human brain development in vitro. This article provides the detailed methodology to efficiently generate homogeneous dorsal forebrain-type organoids from human induced pluripotent stem cells including critical characterization and validation steps.

인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

연구

발생학

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a three-dimensional system. Here we present a relatively straightforward and inexpensive method that yields brain organoids. In this protocol human pluripotent stem cells are broken into small clusters instead of single cells and grown in basic media without a heterologous basement membrane matrix or exogenous growth factors, allowing the intrinsic developmental cues to shape the organoid&#39;s growth. This simple system produces a diversity of brain cell types including glial and microglial cells, stem cells, and neurons of the forebrain, midbrain, and hindbrain. Organoids generated from this protocol also display hallmarks of appropriate temporal and spatial organization demonstrated by brightfield images, histology, immunofluorescence and real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). Because these organoids contain cell types from various parts of the brain, they can be utilized for studying a multitude of diseases. For example, in a recent paper we demonstrated the use of organoids generated from this protocol for studying the effects of hypoxia on the human brain. This approach can be used to investigate an array of otherwise difficult to study conditions such as neurodevelopmental handicaps, genetic disorders, and neurologic diseases.

This protocol was generated as a means to produce brain organoids in a simplified, low cost manner without exogenous growth factors or basement membrane matrix while still maintaining the diversity of brain cell types and many features of cellular organization.

인간 배아 줄기 세포에서 뇌 오르가노이드를 생성하기위한 정적 자기 지향 방법

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older centriole during the G1/G0 phase of the cell cycle, while they disassemble as the cells re-enter the cell cycle at the G2/M phase boundary. They function as signal hubs, by detecting and transducing extracellular signals crucial for many cell processes. Similar to most cell types, all neocortical neural stem and progenitor cells (NSPCs) have been shown harboring a PC allowing them to sense and transduce specific signals required for the normal cerebral cortical development. Here, we provide detailed protocols to generate and characterize two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cell-based models from human induced pluripotent stem cells (hIPSCs) to further dissect the involvement of PC during neocortical development. In particular, we present protocols to study the PC biogenesis and function in 2D neural rosette-derived NSPCs including the transduction of the Sonic Hedgehog (SHH) pathway. To take advantage of the three-dimensional (3D) organization of cerebral organoids, we describe a simple method for 3D imaging of in toto immunostained cerebral organoids. After optical clearing, rapid acquisition of entire organoids allows detection of both centrosomes and PC on neocortical progenitors and neurons of the whole organoid. Finally, we detail the procedure for immunostaining and clearing of thick free-floating organoid sections preserving a significant degree of 3D spatial information and allowing for the high-resolution acquisition required for the detailed qualitative and quantitative analysis of PC biogenesis and function.

We present detailed protocols for the generation and characterization of 2D and 3D human induced pluripotent stem cell (hIPSC)-based models of neocortical development as well as complementary methodologies enabling qualitative and quantitative analysis of primary cilium (PC) biogenesis and function.

2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older ...

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology has emerged recently. It is still in its infancy and has some limitations unsolved yet. The current protocols do not allow obtaining organoids to be consistent enough for drug discovery and preclinical studies. The maturation of organoids can take up to a year, pushing the researchers to launch multiple differentiation processes simultaneously. It imposes additional costs for the laboratory in terms of space and equipment. In addition, brain organoids often have a necrotic zone in the center, which suffers from nutrient and oxygen deficiency. Hence, most current protocols use a circulating system for culture medium to improve nutrition.
Meanwhile, there are no inexpensive dynamic systems or bioreactors for organoid cultivation. This paper describes a protocol for producing brain organoids in compact and inexpensive home-made mini bioreactors. This protocol allows obtaining high quality organoids in large quantities.

Here we describe a protocol for generating brain organoids from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). To obtain brain organoids in large quantities and of high quality, we use home-made mini bioreactors.

집에서 만든 미니 생물 반응기에서 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 오르간성 생성

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

영장류 대뇌 오가노이드의 유전자 변형

Targeted Microinjection and Electroporation of Primate Cerebral Organoids for Genetic Modification

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of higher-order cognitive abilities in mammals, in particular, primates. Studying gene functions in primate brains is challenging due to technical and ethical reasons, but the establishment of the brain organoid technology has enabled the study of brain development in traditional primate models (e.g., rhesus macaque and common marmoset), as well as in previously experimentally inaccessible primate species (e.g., great apes), in an ethically justifiable and less technically demanding system. Moreover, human brain organoids allow the advanced investigation of neurodevelopmental and neurological disorders.
As brain organoids recapitulate many processes of brain development, they also represent a powerful tool to identify differences in, and to functionally compare, the genetic determinants underlying the brain development of various species in an evolutionary context. A great advantage of using organoids is the possibility to introduce genetic modifications, which permits the testing of gene functions. However, the introduction of such modifications is laborious and expensive. This paper describes a fast and cost-efficient approach to genetically modify cell populations within the ventricle-like structures of primate cerebral organoids, a subtype of brain organoids. This method combines a modified protocol for the reliable generation of cerebral organoids from human-, chimpanzee-, rhesus macaque-, and common marmoset-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) with a microinjection and electroporation approach. This provides an effective tool for the study of neurodevelopmental and evolutionary processes that can also be applied for disease modeling.

저자 스포트라이트: 유전자 변형을 위한 영장류 대뇌 오가노이드의 표적 미세주입 및 전기천공법  

The electroporation of primate cerebral organoids provides a precise and efficient approach to introduce transient genetic modification(s) into different progenitor types and neurons in a model system close to primate (patho)physiological neocortex development. This allows the study of neurodevelopmental and evolutionary processes and can also be applied for disease modeling.

유전자 변형을 위한 영장류 대뇌 오가노이드의 표적 미세주입 및 전기천공

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of ...

Generation of 3D Midbrain Organoids from Human-Induced Pluripotent Stem Cells

The development of midbrain organoids (MOs) from human pluripotent stem cells (hPSCs) represents a significant advancement in understanding brain development, facilitating precise disease modeling, and advancing therapeutic research. This protocol outlines a method for generating midbrain-specific organoids using induced pluripotent stem cells (iPSCs), employing a strategic differentiation approach. Key techniques include dual-SMAD inhibition to suppress SMAD signaling, administration of fibroblast growth factor 8b (FGF-8b), and activation of the Sonic Hedgehog pathway using the agonist purmorphamine, guiding iPSCs towards a midbrain fate.
The organoids produced by this method achieve diameters up to 2 mm and incorporate a diverse array of neuroepithelial cell types, reflecting the midbrain&#39;s inherent cellular diversity. Validation of these organoids as authentic midbrain structures involves the expression of midbrain-specific markers, confirming their identity. A notable outcome of this methodology is the effective differentiation of iPSCs into dopaminergic neurons, which are characteristic of the midbrain.
The significance of this protocol lies in its ability to produce functionally mature, midbrain-specific organoids that closely replicate essential aspects of the midbrain, offering a valuable model for in-depth exploration of midbrain developmental processes and the pathophysiology of related disorders such as Parkinson&#39;s disease. Thus, this protocol serves as a crucial resource for researchers seeking to enhance our understanding of the human brain and develop new treatments for neurodegenerative diseases, making it an indispensable tool in the field of neurological research.

This protocol describes a novel method for creating 3D midbrain organoids from human induced pluripotent stem cells, guiding their formation to mimic native midbrain tissue, thereby aiding in the study of development and disorders.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 3D 중뇌 오가노이드 생성

The development of midbrain organoids (MOs) from human pluripotent stem cells (hPSCs) represents a significant advancement in understanding brain ...

<meta charset="utf8"></head><body>iPSC 유래 HPC를 사용하여 상주 미세아교세포를 이용한 인간 뇌 오가노이드 생성

Derivation of a Human Brain Organoid with Microglia Development

Three-dimensional (3D) brain organoid cultures derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) provide an important alternative in vitro tool&#160;for studying human brain development and pathogenesis of neurological diseases. However, the lack of incorporation of microglia in the human brain organoids is still a major hurdle for 3D models of neuroinflammation. Current approaches include either the incorporation of fully differentiated microglia into mature brain organoids or the induction of microglial differentiation from the early stage of iPSC-derived embryoid bodies (EBs). The first approach misses the stage when microglial differentiation interacts with the adjacent neural environment, and the later approach is technically challenging, resulting in inconsistency among the final organoids in terms of the quantity and quality of microglia. To model brain organoids with microglia to study the early interactions between microglial and neuronal development, highly pure hematopoietic progenitor cells (HPC) differentiated from human iPSCs were incorporated&#160;into iPSC-derived EBs to make brain organoids. Using immunostaining and single-cell RNA sequencing (sc-RNA-seq) analysis, we confirmed that HPCs were incorporated into the 3D organoids, which eventually developed into brain organoids with both microglia and neurons. Compared to brain organoids without HPCs, this approach produces significant microglial incorporation in the brain organoids. This novel 3D organoid model, which consists of both microglial and neural development properties, can be used to study the early interactions between innate immune and nervous system development and potentially as a model for neuroinflammation and neuroinfectious disorders.

<meta charset="utf8"></head><body>Microglia 발달을 통한 인간 뇌 오가노이드의 유도

We present a protocol to generate a human brain organoid with resident microglia by incorporating Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived hematopoietic progenitor cells (HPCs) into organoid development.

Microglia 발달을 통한 인간 뇌 오가노이드의 유도

Three-dimensional (3D) brain organoid cultures derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) provide an important alternative in vitro tool&#160;for ...

IPSC 파생 된 인간의 두뇌 Organoids의 세대는 초기 신경 발달 장애를 모델링하기

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인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

인간 배아 줄기 세포에서 뇌 오르가노이드를 생성하기위한 정적 자기 지향 방법

2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

집에서 만든 미니 생물 반응기에서 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 오르간성 생성

유전자 변형을 위한 영장류 대뇌 오가노이드의 표적 미세주입 및 전기천공

유전자 변형을 위한 영장류 대뇌 오가노이드의 표적 미세주입 및 전기천공

유전자 변형을 위한 영장류 대뇌 오가노이드의 표적 미세주입 및 전기천공

인간 유도 만능 줄기 세포에서 3D 중뇌 오가노이드 생성

Microglia 발달을 통한 인간 뇌 오가노이드의 유도

Microglia 발달을 통한 인간 뇌 오가노이드의 유도