Name: generation of ipsc-derived human brain organoids to model early neurodevelopmental disorders
Uploaded: 2017-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
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この作品は、フリッツ・ティッセン財団（Az.10.14.2.152）によってサポートされていました。私たちは、組織の埋め込み施設とCMMCの顕微鏡中核施設に感謝しています。私たちは、中心体および細胞骨格生物学研究所のメンバーが提供する議論と技術サポートのために感謝しています。私たちは、原稿を校正するために李明グーイに感謝します。

脳オルガノイドの1世代（23日） <ol><li> 神経外胚葉の開始（5日） 注：以下の点は、分化の開始前に検討すべきです。ヒトiPS細胞を得るための再プログラミング方法（lentiviral-、仙台ウィルス、エピソーム、またはマイクロRNAベースなど ） は 、理想的には、全ての患者に対して同じであるとのiPSCラインを制御しなければなりません。公開されたプロトコルに基づいて様々な再プログラミングキットおよび命令は15、16、17、18入手可能です。人間のiPSCラインの品質は、最適な分化を達成するための鍵です。顕微鏡でコロニー及び細胞形態をモニタし、そのようなのOct3 / 4、Nanogの、またはTRA-1-60のようなマーカーの発現を試験することによって多能性を検証します。 <ol><li>エンゲル・ホルム - スウォームで被覆された皿上の培地Aで無フィーダー条件下で培養ヒトiPS細胞（EHS）マトリックス。 注：定義された培養条件を維持し、分化の開始前に、マウス胚性フィーダー細胞（MEFの）を除去するための追加的なステップを避けるために、ヒトiPS細胞のフィーダーフリー、無血清を成長させます。ヒトiPS細胞のための最適な通過回数は、合計で通路70に再プログラミング時に通路15から分化範囲を開始します。継代する場合、新しい皿に凝集物を転写する低い機械的応力を有する適切な細胞剥離溶液と2-mLの血清学的ピペットを使用して集計細胞としてhiPSCコロニーを取り外します。これは、ほとんどのiPSCラインでの分化とアポトーシスを誘導する可能性があるとして、単一の細胞に解離を避けてください。これは、長期的な、単一細胞継代は、ヒトのiPS細胞19、20におけるゲノム変化を増加させることができることが報告されました。これはiPS細胞の全体的な生存率を低下させるように、剥離液を除去するための遠心分離工程を必要とする細胞剥離手順を避けます。テスト定期的に微生物汚染のためのすべての文化、特にマイコプラズマ、これはiPS細胞の品質とその分化能を変える可能性があるため。 <ol><li>コート製造者の説明書に従ってEHSマトリックスとの60mm組織培養皿。 </li><li> 1×10 6個のヒトiPS細胞のアリコートを解凍。 EHSマトリックスでコーティングされた60 mmの組織培養皿にiPS細胞を播種し、培地A（ 材料表を参照）の5 mLを含みます。細胞は〜80％コンフルエントに達したときに5〜7日後に毎日、メディアとの通路を変更します。 注：通路80％コンフルエントで融解性IPSCが少なくとも一度分化を開始する前に、そのようなコロニー21の酵素を含まない剥離などの標準的な方法を用いて。簡単に述べると、のiPSC培地を除去し、予め温めた37℃のダルベッコ変法イーグル培地で細胞を1回洗浄：栄養混合物のF12（DMEM / F12）、及び製造業者の次iPS細胞をインキュベート試薬A（材料の表を参照）を使用説明​​書。単一の細胞に解離を避けるために推奨されるインキュベーション時間を超えないようにしてください。ヒトiPS細胞は剥離し、凝集体としてではなく、単一細胞としてフローティングされるべきです。そして、彼らは新しいEHSマトリックスでコーティングされた皿に転送することができます。例えば、一つのiPSC 60-mmディッシュから凝集体は、4つの新しい60-mmディッシュに分配することができます。 </li><li>製造元の指示に従ってマイコプラズマ検出キットでマイコプラズマを確認してください。マイコプラズマは、iPS細胞の分化能を変更できるよう、唯一のマイコプラズマフリーのiPS細胞を使用してください。 </li></ol></li><li> iPS細胞（80％コンフルエント）を解離し、試薬Bを用いて、単一細胞懸濁液を調製<ol><li>予め温めた（37℃）DMEM / F12で一回性IPSCを洗います。 </li><li> CO 2予め温めておいた試薬B（ 例えば 60 mmディッシュに1 ml）を加え、37℃で5分間、iPS細胞をインキュベートし、5％。 </li><li>の側部および底部に指先でフリック20回iPS細胞を剥離する一品。顕微鏡下で細胞の剥離を確認してください。 </li><li> 1 mLのマイクロピペットで皿に上下に5回の細胞懸濁液をピペット。 </li><li>試薬Bの1ミリリットルを希釈し、15 mL遠心管中の細胞懸濁液を収集するために、媒体Aの3ミリリットルを加えます。 </li><li>穏やかに室温で4分間性IPSC（500 XG）をスピンダウン。 </li><li>媒体Bの1mLに細胞ペレットを再懸濁し、血球計数器で細胞数を数えます。 注：再懸濁用培地のみBを使用して注意してください。それが分化を阻害可能性があるbFGFの高すぎる濃度を、含まれているとして、培地Aを使用しないでください。 </li></ol></li><li> 10μMのRho関連タンパク質キナーゼ阻害剤（Y-27632）を添加した培地B 1ml当たり4.5×10 5細胞に細胞懸濁液を希釈します。 </li><li>非接着、V底96ウェルプレートにウェル当たり100μLを加えます。 注：ことを確認した細胞を均等にSUSに分散されています100μL部分を取り出す前に、チューブを毎回揺れによって年金。各ウェルのサイズ及び形状（円形、定義された面）に均一なニューロスフェアを得るために、同等の細胞数を含むべきであることが重要です。 </li><li>穏やかに3分間500×gで、室温で細胞をプレートをスピンダウンし、37℃、5％CO 2でインキュベートします。 </li><li> 50μLを削除し、次の5日間、各ウェルに新鮮な培地Bの50μLを追加することにより、日々のメディアを変更します。 </li></ol></li></ol> EHSマトリックス2.埋め込みニューロスフェア（4日） <ol><li> （W /なし100（v / v）の補充2：1：DMEM / F12培地C 1混合物（v / v）を、1：200（v / v）の補充1、1以下を混合することによってニューロスフィア培地を調製O）ビタミンA、1：100 L-グルタミン、0.05mMの非必須アミノ酸（MEM）、100 U / mLペニシリン、100μg/ mLのストレプトマイシン、1.6グラム/ Lのインスリン、及び0.05mMのβメルカプトエタノール。 </li><li>ニューロスフェアのウィットを収集予め滅菌ハサミで切っ〜2mmのチップを用いて200μLマイクロピペットヘクタール。 </li><li>空の100mmの皿に約5mm離れたパラフィンフィルム（3×3 cm 2）を上の互いに神経球を配置し、慎重にできるだけ残り媒体のできるだけ多くを除去します。 </li><li>各単一のニューロスフェアにEHSマトリックスの低下（7μL）を加えます。 </li><li> EHSマトリックスはインキュベーターで15分間、ニューロスフェアとインキュベート低下します。 </li><li>ニューロスフィア培地でそれらをフラッシュすることによって慎重にパラフィンフィルムからニューロスフェアを洗います。フラッシュするために、1 mLのマイクロピペット及びニューロスフィア培地10mLを含有する新たな100 ム・ペトリ皿を使用します。 </li><li>次の4日間の神経球をインキュベートし、2日目に新鮮なニューロスフェア培地の2ミリリットルを追加します。 注：EHSマトリックスに埋め込まれたニューロスフェアは、皿の片側に集まってしまうしないようにインキュベータ内の棚が平らであることを確認してください。 </li></ol>ロータリーサスペンション3.オルガノイド文化（14日） <ol><li> 1：DMEM / F12培地C 1混合物（v / v）を、1：200（v / v）の補充1、1：W / O 100（v / v）のサプリメント2以下を混合することにより脳オルガノイド培地を調製ビタミンA、1：100 L-グルタミン、0.05mMのMEM、100 U / mLペニシリン、100μg/ mLのストレプトマイシン、1.6グラム/ Lのインスリン、0.5μMドルソモルフィン、5μMSB431542、及び0.05mMのβメルカプトエタノール。 </li><li>そのサイドアームを介して各スピナーフラスコに脳オルガノイド培地100mlを添加し、少なくとも20分間予備加温するための恒温器に置きます。 </li><li>製造元の指示に従って、25 rpmで攪拌しながらプログラムを設定します。 注：スピナーフラスコにEHSマトリックスに埋め込まれたニューロスフェアを転送する前に、彼らはすべて分離されていることを確認してください。二つ以上がEHSマトリックスを介して接続されている場合は、メスと連結マトリックスを切断することによって、それらを分離します。 </li><li>注意深くオルガノイド培地100mlを含むスピナーフラスコにEHSマトリックス包埋ニューロスフェアを転送米国2mLの血清学的ピペットをする。フラスコ内の神経球を転送するためにスピナーフラスコの側の腕を使用してください。 </li><li> 37℃および5％CO 2インキュベーター中の磁気攪拌プラットフォーム上のスピナーフラスコを置きます。これは、オルガノイド文化の日0です。 </li><li> （またはより頻繁に色の変化があるとき）培地の半分を取り除き、新鮮な培地の同量を追加することでは週に1回の媒体を変更します。 注：インキュベーターのうち、スピナーフラスコを取った場合、オルガノイドは、フラスコの底まで沈むようにする3-5分待ちます。液体の表面上（ポンプに接続された）ガラスピペットチップを配置することによって培地を除去。フラスコの一方の側の開口部/アームを通して注意深く培地を吸引します。これらの操作は、層流フードの下に行われなければなりません。 </li></ol>脳オルガノイド4.分析<ol><li> オルガノイドの固定 <ol><li>スピナーフラスコ培養のwiの14日目にオルガノイドを収集カット1mLのマイクロピペット（カット約5 mm）の目。 60ミリメートル皿にそれらのすべてを入れて、3分間のウォームDMEM / F12 5mLで一度洗って。 </li><li>暖かい4％パラホルムアルデヒド（PFA）の500μLと1.5mLのチューブを準備します。 注意：PFA固定液を取り扱う際の安全フードの下の皮膚や目の保護と仕事を着用してください。 </li><li>それぞれが別々に各チューブに室温で少なくとも30分間、それらを修正オルガノイド置きます。長くより60分オルガノイドを固定しないでください。オルガノイドを移動させるために、白金耳又は好都合である任意の他の工夫を使用します。 </li><li> PFAを除去し、PBS 1mLで10分間2回固定オルガノイドを洗います。 </li><li>さらに使用するまで、最大で7日間、4℃でPBS 1mL中オルガノイドを格納します。 </li></ol></li><li> 凍結切片のためのオルガノイドを埋め込み <ol><li> PBSを除去し、それらをcryofreezing前オルガノイドを脱水するチューブ当たり蒸留水の溶液中の30％ショ糖の1ミリリットルを加えます。 SUCROを追加した後SE溶液は、オルガノイドは表面に浮遊しなければなりません。 4°Cでのショ糖溶液中で一晩オルガノイドを保管してください。次の日で、オルガノイドは、チューブの底に沈んでダウンしている必要があります。 注：必要に応じてオルガノイドは、ショ糖溶液中で4℃で最長3〜5日間保存することができます。 </li><li>最適切断温度（OCT）化合物の400μLとビニル検体金型を満たすと、金型の中心にオルガノイドを配置するために白金耳を使用します。サンプル名を持つ金型のリムにラベルを付けます。 </li><li>凍結切片まで-80℃でオルガノイドを含む金型をフリーズします。 </li><li>室温で5分間、PBS中の0.1％ポリ-L-リジン溶液（PLL）を用いてコートガラスcryoslidesスライドを3時間乾燥させ。 4℃でスライドを保存し、使用前に温帯部屋にそれらをウォームアップ。 注：PLL-コーティング、それは離れて浮いからオルガノイドスライスを防ぐことができますよう、重要なステップです。最大3 4℃でPLL溶液を収集し、店舗数ヶ月。再使用する前に、0.22μmのシリンジでそれをフィルタリングし、室温までそれが暖かくてみましょう。 </li><li> PLLでコーティングされたガラス上に20~50ミクロンの厚さのスライスに区分cryofrozenのオルガノイド22を cryoslides。セクションで、スライドを室温で1時間乾燥させます。さらに処理するまで-80℃でセクションを保管してください。 </li></ol></li></ol>オルガノイドセクションの5.免疫染色注：ネスチン、神経前駆マーカー、およびTUJ1、汎神経マーカーで染色するオルガノイドの一般的な特性については、推奨されます。追加の例、有糸分裂の頂端放射状グリア細胞を標識ホスホ - ビメンチン（P-のVim）、及びArl13bと免疫蛍光染色として、繊毛のために、記載されています。アポトーシスをテストするには、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdTを）dUTPニック - 末端標識（TUNEL）アッセイを使用しています。ほこり、光から保護するためにインキュベーションの間にプラスチック製の箱にスライドを置き、そして乾燥。 <ol><li>室温で30分間スライドを解凍します。 </li><li> PFA誘発性自己蛍光をクエンチするために3分間PBS-グリシン（PBS中のグリシンの0.225グラム）の200μLで二回スライドを洗浄します。 </li><li> 0.5％のTriton X100の200μL/室温で10分間PBS溶液中の0.1％Tweenで切片を透過性。 </li><li> 3分間PBS-グリシン溶液200μLで二回、それらを洗ってください。 </li><li>非特異的抗原結合をブロックするために室温で又は一晩4℃で1時間、PBS中の0.5％魚ゼラチンの200μL/ 0.1％トリトンX100でそれらをインキュベートします。 注：TUNELアッセイが必要な場合は、製造元のプロトコルに従ってアッセイを行います。それは二次抗体に干渉し、その後使用時のフルオロフォアを消光可能性があるとして、免疫染色を行う前に、TUNELアッセイを開始します。 </li><li> 、ネスチン1：以下の濃度でブロッキング溶液中の抗体を希釈する200。 P-Vimは、1：500。 TUJ1、1：200;Arl13b、1：20;および二次抗体、1：1,000。 </li><li>室温または4℃で一晩1-2時間、第一の一次抗体（ 例えば、ネスチン）の200μLとインキュベートします。 </li><li>ブロッキング溶液200μLで3×3分間洗浄します。 </li><li>ブロッキング溶液中で1,000〜室温で1~2時間、200μLでスライドをインキュベートする：最初の（抗マウス488）二次抗体1を希釈。これからは、常に光からスライドを保護します。 </li><li>ブロッキング溶液200μLで3×3分間洗浄します。 </li><li>室温または4℃で一晩1~2時間、次の一次抗体（ 例えば、TUJ1）の200μLとインキュベートします。 </li><li>ブロッキング溶液200μLで3×3分間洗浄します。 </li><li>室温で1~2時間、次の二次抗体（抗ウサギ647）の200μLを加えます。 </li><li> 3×3分を洗います。ブロッキング溶液の200μLと。 </li><li> 30 nMの濃にて4&#39; の200μL、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を追加核染色のために室温で15分間PBSでentration。 </li><li>ブロッキング溶液200μLで2×3分洗浄します。 </li><li>蒸留水200μLと、1×1分間洗浄し、明白な水滴がもはや表示されなくなるまでのセクションでは、10〜20分間乾燥させ。 </li><li>メディアを埋め込んでセクションをマウントします。彼らは数週間まで4℃で光から保護して保管してください。 </li><li>画像の顕微鏡分析オルガノイド、心室ゾーン、原始皮質板、及び関心の他の領域の概要を進めます。 </li><li> 1、10を使用する蛍光色素タグ化二次抗体に応じて選択63X油目的と蛍光フィルターを備えた共焦点顕微鏡を使用します。 </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Neural differentiation of human embryonic stem cells.</a> J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).</li><li>Christie, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+synthetic+retinoid+derivatives+as+inducers+of+stem+cell+differentiation.">Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation.</a> Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+enhancement+of+neural+differentiation+from+human+ES+and+iPS+cells+regardless+of+their+innate+difference+in+differentiation+propensity.">Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity.</a> Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).</li><li>Gabriel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Zika+Virus+Isolates+Induce+Premature+Differentiation+of+Neural+Progenitors+in+Human+Brain+Organoids.">Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids.</a> Cell stem cell. , (2017).</li><li>Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+Characterization+of+a+MYF5+Reporter+Human+iPS+Cell+Line+Using+CRISPR/Cas9+Mediated+Homologous+Recombination.">Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination.</a> Sci. Rep. 6, 18759 (2016).</li><li>Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genomic+correction+methods+in+human+iPS+cells+using+CRISPR-Cas9+system.">Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods. 101, 27-35 (2016).</li><li>Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Isogenic+Human+iPS+Cell+Line+Precisely+Corrected+by+Genome+Editing+Using+the+CRISPR/Cas9+System.">Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System.</a> Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).</li><li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+organoids+recapitulate+gene+expression+programs+of+fetal+neocortex+development.">Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure.">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165, 1238-1254 (2016).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain-like+Organoids+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Contain+Functional+Dopaminergic+and+Neuromelanin-Producing+Neurons.">Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons.</a> Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).</li><li>Mariani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXG1-Dependent+Dysregulation+of+GABA/Glutamate+Neuron+Differentiation+in+Autism+Spectrum+Disorders.">FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders.</a> Cell. 162, 375-390 (2015).</li><li>D'Avanzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+in+3D+culture:+challenges+and+perspectives.">Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives.</a> Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

MCPHは、in vivoまたはin vitroでの単純なヒト細胞培養アプローチに動物モデルで再現されることができない複雑なヒト神経発達障害です。 MCPHの臨床症状は、早期の神経発生が開始されると、最初の学期中に現れ始めます。このように、3D脳オルガノイドはMCPH開発をモデル化するための信頼性の高い実験系を表します。また、3Dヒト脳オルガノイドは重要なこと、iii）は、様?...

このよう小頭症など人間の神経発達障害は、不十分にしかによる人間の脳は、拡張された皮質表面、ヒト以外の動物は異なる独特の特徴を持っているという事実のために、動物モデルで研究することができます。 この局面は、 インビトロ細胞培養系では 、人間の脳の発達に十分に2Dで研究することができない複雑なプロセスになります。新興3D培養技術は、人工多能性幹細胞（iPS細胞）から組織様オルガノイドの生成を可能にします。 3D懸濁培養における多能性幹細胞のインビトロ分化は、組織化、層状組織1、2、3を生じさせる、タイムリーかつ領域特異的な様式で種々の細胞型を形成することができます。 3D培養技術を開拓し、幹細胞から始まる、器官形成の複雑さを詳解研究所のおかげで、私たちは、人間の脳の発達の初期事象を描写すると試験管 1、2、3 に小頭症をモデル化するために、脳のオルガノイドを生成する強力な方法を開発しました。我々がランカスターらによって開発されたオリジナルの方法を適応することを注目すべきです。脳オルガノイド1を生成します。この方法は、我々の実験の要件に応じて変更されました。 ガブリエルらから研究の目的。脳の発達中の神経幹細胞の維持の細胞および分子メカニズムを分析することでした。これを行うためには、機械的な研究は、小頭症患者4由来の3D脳オルガノイドにおける神経前駆細胞（NPCの）を分析することにより行いました。この患者はCPAP、中心体の生合成に必要な5保存された中心体タンパク質に変異を運びました。広く受け入れられているハイポ論文は、小頭は、NPCのプールの枯渇の結果であり、これは、細胞死または早期分化1、6、7、8、9のいずれかに起因するかもしれないということです。 小頭脳オルガノイドの心室ゾーン（VZS）を分析することによって、それはのNPCのかなりの数は、健康なドナー4に由来する脳オルガノイドは異なり、非対称細胞分裂を受けることが示されました。小頭脳オルガノイドの広範な顕微鏡および生化学的解析は、タイムリーな繊毛分解4におけるCPAPのための予想外の役割を明らかにしました。具体的には、突然変異したCPAPは遅繊毛の分解に関連しているとのNPC 4の早期分化につながる、再入細胞周期を遅らせました。これらの結果は、小頭と目における繊毛の役割を示唆します神経発生と脳のサイズ制御10時のEIR関与。 このプロトコルの最初の部分は、均質脳オルガノイドを生成するための三段階法の説明です。前に述べたように、オリジナルのランカスタープロトコルが適応と我々の目的1に合わせて変更されました。まず、人間性IPSCは、エンゲル・ホルム - スウォーム（EHS）マトリックス上に定義された無フィーダー条件で培養します。このステップは、フィーダ依存性多能性幹細胞培養物の変動を回避します。このプロトコルでは、神経上皮を形成するために神経分化の誘導性IPSCから直接始まります。胚様体（EB）形成工程、より制御および指向様式で神経分化進行をスキップし。このアプローチは、中胚葉および内胚葉のような他の胚細胞層の自発的および無向形成を制限します。このプロトコルを適用することにより、神経のロゼットを含むニューロスフェアは、EHのために5日目に収穫することができますS行列の埋め込み静止懸濁培養。我々のプロトコルの第三の工程のために使用オルガノイド媒体はドルソモルフィンおよびSB431542が補充されます。ドルソモルフィンは、骨形成タンパク質（BMP）の小分子阻害剤であり、SB431542はTGFβ/アクチビン/ノーダルシグナル伝達経路を阻害します。これらの要因の組み合わせが神経分化よりも効率的に単独で11、12、13、14、レチノイン酸を促進し得ます。 要するに、これらの修飾は、オルガノイドを横切る最小の変動で、脳オルガノイドの再現可能な生成を可能にします。重要なことは、この方法が確実に中心体および細胞周期のダイナミクスに影響を与える遺伝子の変異を運ぶ患者性IPSC、から小頭脳オルガノイドを生成するために適用されました。 このプロトコルの第2の部分は、BRを調製するための指示を与えます小頭内の細胞の欠陥の分析と解釈のためにAINのオルガノイド。これは固定、凍結切片、免疫蛍光染色、および共焦点顕微鏡分析を含んでいます。このプロトコルは、期待される結果の詳細な説明とし、解釈のためのガイダンスを読者に提供します。

<table><tbody><tr><td>Anti-mouse 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Anti-rabbit 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21245</td><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>Arl13b</td><td>proteintech</td><td>17711-1-AP</td><td>ARL13B rabbit polyclonal antibody&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CELLSPIN system</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>183001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>32670</td><td>4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco, US</td><td>31331093</td><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P5499</td><td>Compound C; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Embedding medium</td><td>AppliChem</td><td>A9011, 0100</td><td>Mowiol; embedding medium; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified</td></tr><tr><td>Fish gelatin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>G7765-250ML</td><td>Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>A1067,1000</td><td>Glycine for molecular biology; multiple suppliers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Inoculation loop with needle, disposable (1 &amp;micro;L)</td><td>Sigma Aldrich, US</td><td>BR452201-1000EA</td><td>multiple suppliers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>I3536-100MG</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco, US</td><td>25030081</td><td>L-glutamine (200 mM)</td></tr><tr><td>Medium A</td><td>Stem cell technologies</td><td>#05850</td><td>mTeSR1 (hiPSC medium)</td></tr><tr><td>Medium B</td><td>Stem cell technologies</td><td>#05835</td><td>Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium</td></tr><tr><td>Medium C</td><td>Gibco, US</td><td>21103049</td><td>Neural Basal Medium</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco, US</td><td>11140035</td><td>MEM non-essential amino acids solution (100x)</td></tr><tr><td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td><td>Lonza, Switzerland</td><td>#LT07-218</td><td>Mycoplasma detection kit; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Novus biologicals</td><td>NBP1-92717</td><td>Nestin mouse monoclonal antibody (4D11)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>AppliChem</td><td>A3813, 0500</td><td>4% in PBS, store solution at -20 &amp;deg;C; caution: wear skin and eye protection and work under hood&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS tablets</td><td>Gibco, US</td><td>18912014</td><td>See manufacturer&amp;acute;s instructions; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)</td><td>Gibco, US</td><td>15140122</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine solution (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P8920-100ML</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>pVim</td><td>MBL</td><td>D076-3S</td><td>Phospho-Vimentin (Ser55) mAb</td></tr><tr><td>Reagent A&amp;nbsp;</td><td>Stem cell technologies</td><td># 05872</td><td>Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer&amp;acute;s protocol; alternative products from muliple suppliers available</td></tr><tr><td>Reagent B&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>A6964-100ML</td><td>Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 &quot;enzymatic cell dissociation solution&amp;rdquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Research Cryostat Leica CM3050 S</td><td>Leica biosystems</td><td>CM3050 S</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1067</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Spinner flask 250 mL</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>182026</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>AppliChem</td><td>A4734, 1000</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Superfrost ultra plus microscope slides</td><td>Thermo scientific, US</td><td>J3800AMNZ</td><td>Slides should be labeled with a &quot;+&quot; and positively charged</td></tr><tr><td>Supplement 1</td><td>Gibco, US</td><td>17502048</td><td>N-2 supplement (100x)</td></tr><tr><td>Supplement 2 w/o Vitamin A</td><td>Gibco, US</td><td>12587010</td><td>B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, NL</td><td>4565</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>Sakura, NL</td><td>4583</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A1388,0500</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>T2200</td><td>&amp;beta;-Tubulin III (rabbit polyclonal)</td></tr><tr><td>TUNEL assay</td><td>Promega, US</td><td>G3250</td><td>DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tween 20 for molecular biology</td><td>AppliChem</td><td>A4974,0500</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>waterproof sheet</td><td>BEMIS company, inc.</td><td>PM996</td><td>Parafilm &amp;ldquo;M&amp;rdquo;; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Y-27632&amp;nbsp;</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1049</td><td>ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco, US</td><td>31350010</td><td>2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers</td></tr></tbody></table>

generation of ipsc-derived human brain organoids to model early neurodevelopmental disorders

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue. 
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro. 
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

脳オルガノイドの生成は、連続培養（ 図1A）の少なくとも三週間を要します。再現性のある結果を達成するために、我々は、研究者は、すべてのステップを文書化して、重要なのは、培地成分、時刻、およびセルの取り扱いに関するあらゆる変更を回避することをお勧めします。ここでは、重要なマイルストーンは、実験の終了時に十分な品質のオルガ?...

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Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

初期の神経発達障害をモデル化するためのiPSC由来のヒト脳オルガノイドの生成

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

19.7K ビュー.  University of Cologne. Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described. 

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Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. Efforts to study human cerebral cortex development have been limited by the availability of model systems. Translating results from rodent studies to the human system is restricted by species differences and studies on human primary tissues are hampered by a lack of tissue availability as well as ethical concerns. Recent development in human pluripotent stem cell (PSC) technology include the generation of three-dimensional (3D) self-organizing organotypic culture systems, which mimic to a certain extent human-specific brain development in vitro. Currently, various protocols are available for the generation of either whole brain or brain-region specific organoids. The method for the generation of homogeneous and reproducible forebrain-type organoids from induced PSC (iPSC), which we previously established and describe here, combines the intrinsic ability of PSC to self-organize with guided differentiation towards the anterior neuroectodermal lineage and matrix embedding to support the formation of a continuous neuroepithelium. More specifically, this protocol involves: (1) the generation of iPSC aggregates, including the conversion of iPSC colonies to a confluent monolayer culture; (2) the induction of anterior neuroectoderm; (3) the embedding of neuroectodermal aggregates in a matrix scaffold; (4) the generation of forebrain-type organoids from neuroectodermal aggregates; and (5) the fixation and validation of forebrain-type organoids. As such, this protocol provides an easily applicable system for the generation of standardized and reproducible iPSC-derived cortical tissue structures in vitro.

Cerebral organoids represent a new model system to investigate early human brain development in vitro. This article provides the detailed methodology to efficiently generate homogeneous dorsal forebrain-type organoids from human induced pluripotent stem cells including critical characterization and validation steps.

標準化され、再現性のある前脳型人間から脳オルガノイドの生成誘導多能性幹細胞

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

発生生物学

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a three-dimensional system. Here we present a relatively straightforward and inexpensive method that yields brain organoids. In this protocol human pluripotent stem cells are broken into small clusters instead of single cells and grown in basic media without a heterologous basement membrane matrix or exogenous growth factors, allowing the intrinsic developmental cues to shape the organoid&#39;s growth. This simple system produces a diversity of brain cell types including glial and microglial cells, stem cells, and neurons of the forebrain, midbrain, and hindbrain. Organoids generated from this protocol also display hallmarks of appropriate temporal and spatial organization demonstrated by brightfield images, histology, immunofluorescence and real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). Because these organoids contain cell types from various parts of the brain, they can be utilized for studying a multitude of diseases. For example, in a recent paper we demonstrated the use of organoids generated from this protocol for studying the effects of hypoxia on the human brain. This approach can be used to investigate an array of otherwise difficult to study conditions such as neurodevelopmental handicaps, genetic disorders, and neurologic diseases.

This protocol was generated as a means to produce brain organoids in a simplified, low cost manner without exogenous growth factors or basement membrane matrix while still maintaining the diversity of brain cell types and many features of cellular organization.

ヒト胚性幹細胞から脳オルガノイドを生成するための静的自己指向法

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older centriole during the G1/G0 phase of the cell cycle, while they disassemble as the cells re-enter the cell cycle at the G2/M phase boundary. They function as signal hubs, by detecting and transducing extracellular signals crucial for many cell processes. Similar to most cell types, all neocortical neural stem and progenitor cells (NSPCs) have been shown harboring a PC allowing them to sense and transduce specific signals required for the normal cerebral cortical development. Here, we provide detailed protocols to generate and characterize two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cell-based models from human induced pluripotent stem cells (hIPSCs) to further dissect the involvement of PC during neocortical development. In particular, we present protocols to study the PC biogenesis and function in 2D neural rosette-derived NSPCs including the transduction of the Sonic Hedgehog (SHH) pathway. To take advantage of the three-dimensional (3D) organization of cerebral organoids, we describe a simple method for 3D imaging of in toto immunostained cerebral organoids. After optical clearing, rapid acquisition of entire organoids allows detection of both centrosomes and PC on neocortical progenitors and neurons of the whole organoid. Finally, we detail the procedure for immunostaining and clearing of thick free-floating organoid sections preserving a significant degree of 3D spatial information and allowing for the high-resolution acquisition required for the detailed qualitative and quantitative analysis of PC biogenesis and function.

We present detailed protocols for the generation and characterization of 2D and 3D human induced pluripotent stem cell (hIPSC)-based models of neocortical development as well as complementary methodologies enabling qualitative and quantitative analysis of primary cilium (PC) biogenesis and function.

2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞ベースのモデルにより、新皮質発生中の原発性繊毛の関与を解剖

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older ...

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology has emerged recently. It is still in its infancy and has some limitations unsolved yet. The current protocols do not allow obtaining organoids to be consistent enough for drug discovery and preclinical studies. The maturation of organoids can take up to a year, pushing the researchers to launch multiple differentiation processes simultaneously. It imposes additional costs for the laboratory in terms of space and equipment. In addition, brain organoids often have a necrotic zone in the center, which suffers from nutrient and oxygen deficiency. Hence, most current protocols use a circulating system for culture medium to improve nutrition.
Meanwhile, there are no inexpensive dynamic systems or bioreactors for organoid cultivation. This paper describes a protocol for producing brain organoids in compact and inexpensive home-made mini bioreactors. This protocol allows obtaining high quality organoids in large quantities.

Here we describe a protocol for generating brain organoids from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). To obtain brain organoids in large quantities and of high quality, we use home-made mini bioreactors.

自家製ミニバイオリアクターにおける人工多能性幹細胞からの脳オルガノイド発生

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

霊長類の脳オルガノイドの遺伝子改変

Targeted Microinjection and Electroporation of Primate Cerebral Organoids for Genetic Modification

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of higher-order cognitive abilities in mammals, in particular, primates. Studying gene functions in primate brains is challenging due to technical and ethical reasons, but the establishment of the brain organoid technology has enabled the study of brain development in traditional primate models (e.g., rhesus macaque and common marmoset), as well as in previously experimentally inaccessible primate species (e.g., great apes), in an ethically justifiable and less technically demanding system. Moreover, human brain organoids allow the advanced investigation of neurodevelopmental and neurological disorders.
As brain organoids recapitulate many processes of brain development, they also represent a powerful tool to identify differences in, and to functionally compare, the genetic determinants underlying the brain development of various species in an evolutionary context. A great advantage of using organoids is the possibility to introduce genetic modifications, which permits the testing of gene functions. However, the introduction of such modifications is laborious and expensive. This paper describes a fast and cost-efficient approach to genetically modify cell populations within the ventricle-like structures of primate cerebral organoids, a subtype of brain organoids. This method combines a modified protocol for the reliable generation of cerebral organoids from human-, chimpanzee-, rhesus macaque-, and common marmoset-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) with a microinjection and electroporation approach. This provides an effective tool for the study of neurodevelopmental and evolutionary processes that can also be applied for disease modeling.

著者スポットライト:遺伝子組換えのための霊長類脳オルガノイドの標的マイクロインジェクションとエレクトロポレーション  

The electroporation of primate cerebral organoids provides a precise and efficient approach to introduce transient genetic modification(s) into different progenitor types and neurons in a model system close to primate (patho)physiological neocortex development. This allows the study of neurodevelopmental and evolutionary processes and can also be applied for disease modeling.

霊長類脳オルガノイドの遺伝子改変のための標的マイクロインジェクションとエレクトロポレーション

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of ...

Generation of 3D Midbrain Organoids from Human-Induced Pluripotent Stem Cells

The development of midbrain organoids (MOs) from human pluripotent stem cells (hPSCs) represents a significant advancement in understanding brain development, facilitating precise disease modeling, and advancing therapeutic research. This protocol outlines a method for generating midbrain-specific organoids using induced pluripotent stem cells (iPSCs), employing a strategic differentiation approach. Key techniques include dual-SMAD inhibition to suppress SMAD signaling, administration of fibroblast growth factor 8b (FGF-8b), and activation of the Sonic Hedgehog pathway using the agonist purmorphamine, guiding iPSCs towards a midbrain fate.
The organoids produced by this method achieve diameters up to 2 mm and incorporate a diverse array of neuroepithelial cell types, reflecting the midbrain&#39;s inherent cellular diversity. Validation of these organoids as authentic midbrain structures involves the expression of midbrain-specific markers, confirming their identity. A notable outcome of this methodology is the effective differentiation of iPSCs into dopaminergic neurons, which are characteristic of the midbrain.
The significance of this protocol lies in its ability to produce functionally mature, midbrain-specific organoids that closely replicate essential aspects of the midbrain, offering a valuable model for in-depth exploration of midbrain developmental processes and the pathophysiology of related disorders such as Parkinson&#39;s disease. Thus, this protocol serves as a crucial resource for researchers seeking to enhance our understanding of the human brain and develop new treatments for neurodegenerative diseases, making it an indispensable tool in the field of neurological research.

This protocol describes a novel method for creating 3D midbrain organoids from human induced pluripotent stem cells, guiding their formation to mimic native midbrain tissue, thereby aiding in the study of development and disorders.

ヒト人工多能性幹細胞からの3D中脳オルガノイドの作製

The development of midbrain organoids (MOs) from human pluripotent stem cells (hPSCs) represents a significant advancement in understanding brain ...

<meta charset="utf8"></head><body>iPS細胞由来HPCを用いた常在性ミクログリアを用いたヒト脳オルガノイドの作製

Derivation of a Human Brain Organoid with Microglia Development

Three-dimensional (3D) brain organoid cultures derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) provide an important alternative in vitro tool&#160;for studying human brain development and pathogenesis of neurological diseases. However, the lack of incorporation of microglia in the human brain organoids is still a major hurdle for 3D models of neuroinflammation. Current approaches include either the incorporation of fully differentiated microglia into mature brain organoids or the induction of microglial differentiation from the early stage of iPSC-derived embryoid bodies (EBs). The first approach misses the stage when microglial differentiation interacts with the adjacent neural environment, and the later approach is technically challenging, resulting in inconsistency among the final organoids in terms of the quantity and quality of microglia. To model brain organoids with microglia to study the early interactions between microglial and neuronal development, highly pure hematopoietic progenitor cells (HPC) differentiated from human iPSCs were incorporated&#160;into iPSC-derived EBs to make brain organoids. Using immunostaining and single-cell RNA sequencing (sc-RNA-seq) analysis, we confirmed that HPCs were incorporated into the 3D organoids, which eventually developed into brain organoids with both microglia and neurons. Compared to brain organoids without HPCs, this approach produces significant microglial incorporation in the brain organoids. This novel 3D organoid model, which consists of both microglial and neural development properties, can be used to study the early interactions between innate immune and nervous system development and potentially as a model for neuroinflammation and neuroinfectious disorders.

<meta charset="utf8"></head><body>ミクログリア発生によるヒト脳オルガノイドの導出

We present a protocol to generate a human brain organoid with resident microglia by incorporating Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived hematopoietic progenitor cells (HPCs) into organoid development.

ミクログリア発生によるヒト脳オルガノイドの導出

Three-dimensional (3D) brain organoid cultures derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) provide an important alternative in vitro tool&#160;for ...

初期の神経発達障害をモデル化するためのiPSC由来のヒト脳オルガノイドの生成

要約

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標準化され、再現性のある前脳型人間から脳オルガノイドの生成誘導多能性幹細胞

ヒト胚性幹細胞から脳オルガノイドを生成するための静的自己指向法

2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞ベースのモデルにより、新皮質発生中の原発性繊毛の関与を解剖

自家製ミニバイオリアクターにおける人工多能性幹細胞からの脳オルガノイド発生

霊長類脳オルガノイドの遺伝子改変のための標的マイクロインジェクションとエレクトロポレーション

霊長類脳オルガノイドの遺伝子改変のための標的マイクロインジェクションとエレクトロポレーション

霊長類脳オルガノイドの遺伝子改変のための標的マイクロインジェクションとエレクトロポレーション

ヒト人工多能性幹細胞からの3D中脳オルガノイドの作製

ミクログリア発生によるヒト脳オルガノイドの導出

ミクログリア発生によるヒト脳オルガノイドの導出