We thank Mr. Christopher Manzella, MD/PhD student in the RKG laboratory, for helping to edit and proofread our manuscript.

젤라틴 단백질 혼합물에 성장 3D 카코 2 세포 배양 : 카코 2의 3D 문화 시스템에 소장 전송기 1. 연구 <ol><li> 해동 성장 인자는 8 시간 동안 얼음에 젤라틴 단백질 혼합물을 감소 (또는 O / N) 4 ℃에서. 일단 1 mL를하거나 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에서 사용하거나 보관 500 μL 씩을, 해동. </li><li> 문화의 날, 얼음에 문화 (RNA 및 단백질 추출을위한) 판 또는 (면역 염색 용) 챔버 슬라이드를 사전 냉각. 여덟 잘 챔버 유리 슬라이드 (또는 6 웰 플레이트의 웰 당 120 μL)의 각 웰에 젤라틴 단백질 혼합물의 30 μL를 추가하고 균일하게 확산. 과정에서 기포가 발생하지 않도록주의하십시오. </li><li> (15) 37 ℃에서 세포 배양 용 인큐베이터 안에서 슬라이드 / 플레이트 플레이스 - 30 분, 젤라틴 단백질 혼합물을 응고 할 수있다. </li><li> 젤라틴 단백질 혼합물이 응고하는 동안, 카코 -2 세포의 합류 플라스크를 Trypsinize. </li><li> 수를 계산세포의 5 분 탁상 원심 분리기 500 XG에서 그들을 스핀. 필요한 3D 카코이 배지에서 세포 펠렛을 다시 일시. </li><li> (플레이트 잘 당 20,000) 잘 4,000 세포에서 유리 챔버 슬라이드를 시드. 세포를 37 ℃에서 5 % CO 2 인큐베이터에서 성장 가습 할 수있다. 4 D - 매체 매 3을 변경합니다. </li></ol> 3D 카코이 세포의 상피 전송기 2. 면역 형광 염색법 : 1 일 <ol><li> 배지를 흡인하고 RT에서 30 분 동안 (NaOH로 8.5로 조정하여 pH PBS)에서 2 % 파라 포름 알데히드 400 μL (PFA)으로 세포를 고정한다. 주 : PFA 용액을 39 ° C에서 이상 1 주간 저장해서는 안되며 갓 만든 용액을 사용할 수있다. 주의 : PFA는 매우 독성 및 잠재적 인 발암 물질이다. 항상 화학 후드주의 및 개인 보호 장비를 사용하여 그것을 처리 할 수 ​​있습니다. </li><li> (1X PBS로 두 번 우물을 씻어 PBS에 4 ° C에서 슬라이드를 저장하는 400 μL /잘). 일단 고정, 최대 일주일 동안 4 ° C에 저장합니다. </li><li> RT로 챔버 슬라이드 (이는 젤라틴 단백질 혼합물 층을 경화하고, 세척 단계 동안에 흡하기 쉽게 만들) 가온. </li><li> 더 이상 15 분 동안 PBS에서 0.5 % 트리톤으로 세포를 Permeabilize 하시려면. </li><li> PBS-글리신 완충액 (130 mM의 염화나트륨, 7 밀리미터 나 2 HPO 4, 3.5 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 100 mM의 글리신)을 준비합니다. RT에서 10 분마다 1X PBS-글리신과 함께 배를 씻어. </li><li> 면역 완충액 (IF)를 제조 하였다 : 130 mM의 염화나트륨을 7 밀리미터 나 2 HPO 4, 3.5 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 100mM의 글리신, 7.7 mM의 NaN이 3, 0.1 % BSA, 0.2 % 트리톤-100, 0.05 % 트윈 -20 . </li><li> IF의 워시 배 실온에서 10 분마다 버퍼. 5 %의 블록 IF 버퍼에 정상 염소 혈청 (NGS). IF + 1 % 염소 혈청 희석 차 항체, 200 μL에 품어 / 웰, 1 - 실온에서 2 시간. 10 분마다 IF 버퍼 3 배 씻으시오. </li><li> 이차 항에 품어본체 (1 : 200)을 실온에서 1 시간 동안, IF + 1 % NGS 200 μL / 웰의 희석. </li><li> 10 분마다 IF 버퍼로 3 회 씻는다. 이 단계에서 어둠 속에서 슬라이드를 유지합니다. 가장자리 연락처 우물의 가장자리까지 홀더를 통해 흰색 리프터 검은 색 홀더에 챔버 슬라이드를 배치하고 슬라이딩하여 유리 슬라이드에서 플라스틱 챔버를 들어 올립니다. 조심스럽게 챔버 (홀더 및 리프터는 문화 슬라이드와 함께합니다)를 잡아 당깁니다. </li><li> 느린 안티 - 페이드 매체를 탑재하고 실온에서 10 분간 건조 할 수 있습니다. </li><li> 완전히 건조되면, 매니큐어 및 공 초점 현미경과 이미지를 함께 슬라이드를 밀봉. 2 주 또는 몇 달 동안 -20 ° C에서 4 ° C에서 슬라이드를 저장합니다. </li></ol> 3D 카코 -2 세포 3. RNA와 단백질 추출 <ol><li> 이러한 TGF-β1의 같은 시험 제제와 함께 14 일 (10 NG / ㎖, 1H) - (12) 젤라틴 단백질 혼합물에서 배양 세포를 처리한다. </li><li> 치료 후 1 셀을 씻어X PBS. 30 분은 젤라틴 단백질 혼합물을 액화하는 얼음에 세포를 유지합니다. </li><li> 냉장 PBS로 우물을 세척하고 각각의 원심 분리기 튜브에 세포를 수집합니다. 500 × g으로 10 분간 4 ℃에서 저속 원심 분리하여 세포를 수집한다. 표준 절차를 사용하여 RNA를 추출하고 실시간 RT-PCR을 사용합니다. </li><li> 단백질 추출을 위해, 1X 프로테아제 억제제 칵테일 (1X)로 보충 된 세포 용해 완충액을 사용하여 세포를 용균. 펠렛을 세포 용해 완충액을 첨가 한 후, 초음파 처리로 세포를 용균 및 7,500 × g으로 10 분간 4 ℃에서 원심 분리하여 세포 파편을 제거한다. </li></ol> Ussing 챔버 활용 마우스 회장의 5-HT 통풍 관 4. 측정 : 창자 준비 및 Seromuscular 스트립 댄스 <ol><li> 안락사 후, 쥐를 해부하고 (위 후 맹장 전) 작은 창자를 제거합니다. 세 부분으로 소장을 나눈다. 중간 제를 폐기 근위 제를 사용공장으로, 그리고 회장 등 원위 세 번째를 사용합니다. 상피의 손상을 방지하기 위해 장간막 첨부 파일에서 장을 당겨하지 마십시오. 얼음처럼 차가운 크렙스 - 링거 중탄산 (KBR) 버퍼를 덮어 조직 섹션 감기를 유지합니다. </li><li> 세로로 가위를 사용하여 장을 엽니 다. KBR은 seromuscular를 제거하기 전에 10 분 동안 1 μM의 인도 메타 신 (indomethacin)를 포함하는 가스를 발산, 얼음처럼 차가운에서 갓 절제 장 섹션을 품어. </li><li> 7 % 아가 로스 또는 경화 된 실리콘 엘라스토머 (0.5 cm 두께)를 포함하는 플레이트에 아래 장내 부 (길이 1 ~ cm) 점막 측에 핀. </li><li> 바닥 조명 해부 실체 현미경 하에서 seromuscular 층을 제거. 깃털 메스 블레이드를 사용하여 seromuscular 층을 잘라. 소장의 길이 방향 축을 따라 층의 에지를 얻는 미세 집게를 사용한다. 참고 : 제거 절차 동안, 실체 현미경의 바닥 조명 파이어 판으로 영역을 파악하고 방지하는 데 도움이에스. </li><li> seromuscular 탈기 종료 후, 반 Ussing 챔버의 핀을 잘 점막 마운트. 전체 과정 동안, 찢어지지 않도록 가장자리에 의해 제거 점막 조직을 유지하도록주의하십시오. </li></ol> 5. 평형 및 조직 치료 <ol><li> Kreb의 용액 조제 : 115 mM의 염화나트륨, 25 mM의 NaHCO3을을 2.4 mM의 K 2 HPO 4, 1.2 mM의 CaCl2를 1.2 밀리미터의 MgCl 2, 95 % O 2 / 5 %로 가스실 pH가 7.4에서 0.4mm의 KH 2 PO 4, 37 ° C에서 CO 2. 삼투압 균형을 유지하기 위해 점막 화장실에 에너지 기판과 10 mM의 만니톨로 사용하기 위해 장막 욕조에 10 mM의 포도당을 추가합니다. 참고 Kreb의 용액을 세포 내 5-HT의 열화를 방지하기 위해 L 아스코르브 산 (100 μM) 및 질라 (100 μM, 모노 아민 옥시 다제 억제제)로 보충된다. </li><li> 꼭대기 (내강)시 모두 노출 챔버로 슬라이더를 삽입드와 Kreb의 솔루션에 대한 조직의 기저 (장막) 측. </li><li> 10 분의 평형 기간 후, J 밀리 초 (점막 - 투 - 장막 플럭스)의 정점 측에 30 분 동안 플루옥세틴 (10 μM)과 회장 조직을 전처리. </li><li> 기저 측에서 1 시간 동안 TGF-β1 (10 NG / mL)로 조직을 치료하고 근단 측에서 30 분 동안 3의 H] -5-HT (20 ㎚)와 함께 배양한다. </li></ol> 장막 플럭스 (J 밀리 초) 및 3의 H] 티슈에 -5-HT의 축적에 점막의 6 정량화 <ol><li> 액체 섬광 계수기의 방사능을 측정하고 점막 - 투 - 장막 (J 밀리 초) 유동 비율을 계산하기 위해 (총 5 ㎖의)에 장막 저수지에서 0.75 mL를 분취 액을 수집; 플루옥세틴에 민감한 플럭스는 3 [H] -5-HT 흡수를 SERT이 매개 나타냅니다. </li><li> 장막 측과 재에서 샘플을 채취, 플럭스 기간 동안 점막에서 수압 차이를 방지하려면목욕 매체의 동일한 볼륨에 배치합니다. 참고 : 플럭스 계산은 최종 샘플 (4.25 ㎖ / 5 ㎖ = 0.85)의 희석 수정합니다. </li><li> 3의 H] 조직에 축적 -5-HT의 정량화를 들어, 슬라이더에서 점막을 분리 얼음처럼 차가운 KRB 버퍼로 한번 씻어, 유리 문화 튜브에 넣습니다. </li><li> 밤새 37 ° C에서 10 % KOH 0.5 ㎖의 점막 부화. 액체 섬광 계수기를 사용하여 (삼중)에 용 해물을 150 μL 씩의 방사능을 측정한다. </li><li> 브래드 포드 (Bradford) 방법을 이용하여 단백질 농도를 측정 해물의 - (5 μL 3) 분취 량을 사용한다. 주 : 방사성 세로토닌을 함유하는 배양 배지 10 mL를 표준으로 사용된다. 5-HT는 pmol의 / mg protein / min으로 산출되는 조직에서 유지. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

장내 트랜스 10, 11, 12, 13, 14, 15 공부 상피 단층 편광으로 완전히 분화 카코 -2 세포 단층을 광범위하게 사용되어왔다. 그러나, 장 상피 세포의 생체 조직을 모방하는 3 차원의 카코 -2 문화의 발달에 상당한 관심이 있었다. 장 상피 세포에 대한 3 차원 ...

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Arivarasu N. Anabazhagan
to:
Arivarasu N. Anbazhagan

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Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

장 상피 세포는 루멘에 유체의 분비 및 이온 다양한 수송 단백질 (채널, -ATPase를, 공동 운송 및 기) 영양소, 전해질의 흡수에 이르기까지 다양한 기능을 수행하고, 마약을 갖추고있다. 수송 단백질이 방식의 vectorial 이온 또는 분자의 이동을 허용하는 전기 화학적 구배를 생성한다. 이것은 편광 상피 세포의 정단 및 기저 세포막 반송 시스템의 비대칭 분포에 의해 달성된다. 또한, 인접하는 상피 세포 밧줄 단단한 접합부는 꼭대기 및 기저 멤브레인 도메인 사이 intramembrane 성분의 확산에 대한 장벽으로서이 과정에서 중요한 역할을한다. 네이티브 소장의 이러한 특징적인 기능을 흉내 낸 적합한 모델 시스템 (즉, 극성, 분화, 꽉 접합 무결성)은 능의 연구에 중요한상피 교통 시스템의 된 스위치들. 모델에 관해서는, 장 상피 전송 연구에 현재 사용되는 전형적인 세포주는 카코이 완전히 분화의 모델이다 소장 상피 세포를 흡수; 및 T-84 세포 또는 HT-29 서브 클론, 토굴에서 파생 된 큰 장 상피 세포 하나의 모델. 통상적으로, 이러한 세포 라인은 플라스틱 표면에 단일 층 또는 코팅 된 트랜스 웰 인서트에서 재배된다. 어느 정도 트랜스 웰 세포 배양 인서트 편광 세포 basolaterally 공급할 수 있도록하여 생체 내 환경을 닮은. 그러나, 종래의 2 차원 배양 시스템에 제한은 세포가 인공 편평하고 단단한 표면에 적응하도록 강요된다는 것이다. 따라서, 원시 상피 생리 복잡성 정확하게 차원 시스템에 반영되지 않는다. 이 제한은 예컨대 젤라틴 단백질 mixtur 같은 특정 미세 차원에서 세포를 성장하는 방법에 의해 극복되었다즉, 세포 외 매트릭스 성분 (2, 3)의 종류를 포함. 그럼에도 불구하고, 체외 배양 여러 세포 유형과 장내 영역 특정 구조를 갖는 장 상피의 복잡성을 시뮬레이션 할 수있다. 따라서, 세포 배양 모델을 이용하여 연구를 기본 대장에 추가 검증을 요구한다. 체외 3D 세포 배양 및 마우스 장 점막을 사용하여, 우리는 장 세로토닌 수송 (SLC6A4, SERT)의 조절을 연구하기 위해 여기에 간단한 방법을 설명합니다. 의존적 과정 - SERT 수송이 급격히 나 + / CL을 통해 운반하여, 중요한 호르몬 및 신경 전달 물질 5- 하이드 록시 (5-HT)의 세포 외 가용성을 조절한다. SERT는 항우울제의 알려진 대상 최근 설사와 장의 염증과 같은 위장관 질환의 새로운 치료 대상으로 떠오르고있다.방법은 장내 상피 세포에서 5-HT의 흡수가 이전에 기술 된 조사합니다. 예를 들어, 플라스틱 또는 투과성 지지체 인서트 성장 카코 -2 세포는 정단 및 기저 영역에서 모두 4 플루옥세틴 성 3 H-5-HT 흡수를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 인간 장기 기증자 소장으로부터 제조 된 절연 브러시 테두리 막 소포 (BBMVs)에 SERT 함수의 측정은 또한 우리 (5)에 의해 설명되었다. 인간 BBVMs 3 H-5-HT 흡수는 플루옥세틴 성 및 나트륨 + / CL 것으로 나타났다 - 의존성과는 300 K에서 5 nM의 m 포화 동력학을 나타내었다. 유사한 방법을 활용, 우리는 이전에 마우스 장 BBMVs 6 세 H-5-HT 흡수로 SERT 기능을 측정 하였다. 그러나, 순수한 세포막 소포의 제조 조직 점막 많은 양을 필요로한다. 예 radiog 같은 다른 방법3 H-5-HT 흡수 사이트의 raphic 시각화는 또한 기니 돼지와 쥐 소장 (7) 이전에 표시되었습니다. Ussing 챔버 여러 상피 조직에 걸쳐 이온, 영양분, 약물의 이동을 측정하는 이상의 생체 시스템을 제공한다. Ussing 챔버 기술의 주요 장점은 그대로 편광 장 상피의 전기 및 전송 파라미터의 정확한 측정을 가능하게한다는 것이다. 또한, 내장 신경 근육 시스템의 영향을 최소화하기 위해, 장 점막의 seromuscular 박리는 상피 8 수송의 조절을 조사하기 위해 수행 될 수있다. 우리는 젤라틴 단백질에 3D로 성장 카코이 세포는 별개의 혀끝과 기저 마커를 발현하는 중공 루멘을 형성하는 것을 보여줍니다. 이 세포들은 2D 카코이 세포에 비해 SERT의 높은 표현을 보여줍니다. 방법 3D 세포를 성장하고 퍼가기하기rform의 면역 염색 또는 RNA 및 단백질 추출 기술되어있다. 또한, 우리는 Ussing 챔버 기술을 이용하여, 소장 점막 TGF-β1하는다면 발현 성 시토 킨에 의해 SERT 및 규제 기능을 연구하는 방법을 설명한다.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;reg; HTB&amp;shy;37&amp;trade;</td><td>Cells</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Microsope for confocal Imaging</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;[H]-5-HT&amp;nbsp;</td><td>LabtekII</td><td>152453</td><td>Culturing cells for microscopy</td></tr><tr><td>5-HT&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>70013-032</td><td>Not a hazardous substance</td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;- 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; cylinder</td><td>KPL</td><td>71-00-27</td><td>Not a hazardous substance</td></tr><tr><td>Agar (for Agar plates)</td><td>Fischer</td><td>BP151-100</td><td>Acute toxicity, Ora</td></tr><tr><td>Agar (for electrode)</td><td>Sigma</td><td>G7126-1KG</td><td>Not a hazardous substance</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Phalloidin</td><td>Sigma</td><td>C3867-1VL</td><td>Not a hazardous substance</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Harmful if swallowed or if inhaled</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>LifeTechnologies</td><td>A12380</td><td>Not a hazardous substance</td></tr><tr><td>Caco-2 Cells</td><td>Sigma</td><td>A8806-5G</td><td>Not a hazardous substance</td></tr><tr><td>Cell lysis Buffer</td><td>Fischer</td><td>BP337-100</td><td>Not a hazardous substance</td></tr><tr><td>Chabered slides</td><td>Sigma</td><td>S5886-1KG</td><td>Not a hazardous substance</td></tr><tr><td>Collagen Type-1 Solution</td><td>Sigma</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>Electrodes</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>EMEM</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>Used as Extracellular matrix</td></tr><tr><td>Fluoxetine</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>Cell culture Media</td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Cell Signaling, Danvers, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepes&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbic acid&amp;nbsp;</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Liquid scintillation counter&amp;nbsp;</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>70013--032</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 Meta</td><td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&amp;nbsp;</td><td>EM-CSYS-8</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&amp;nbsp;</td><td>P2304</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&amp;nbsp;</td><td>VCC MC8</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&amp;nbsp;</td><td>DM MC6</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel Voltage/current Clamp</td><td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&amp;nbsp;</td><td>P2300</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&amp;nbsp;</td><td>P2023-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>BP1423</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (NGS, 10%)</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strp</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Protein assay reagent</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>10420</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase Inhibitor Cocktail</td><td>MEDOX, Chicago, IL&amp;nbsp;</td><td>style G- 12300</td><td></td></tr><tr><td>RNA easy Mini kit</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Single Channel Electrode Input Module&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>Sliders for snapwell Chambers</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>H9523</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>F132</td><td></td></tr><tr><td>Sodium-Hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>T7039</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta;1</td><td>Perkin-Elmer,Waltham, MA</td><td>NFT1167250UC</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Packard Instruments, Downers Grove, IL</td><td>B1600</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Ussing Chamber (chamber only)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>Ussing Chamber Systems</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>A1296</td><td></td></tr></tbody></table>

methods to study epithelial transport protein function and expression in native intestine and caco-2 cells grown in 3d

장 상피 세포는 이물질에 대한 장벽을 제공하면서 신체의 정상적인 생리 기능에 중요한 역할을 중요 전송 및 장벽 기능이 있습니다. 손상된 상피 전송 (이온 영양 또는 약물)는 많은 질환과 관련되어 있으며, 상피 무결성 및 장내 마이크로 바이 영향으로 같은 컨베이어의 정상적인 생리 학적 기능을 넘어 연장 결과를 가져올 수있다. 기능 및 수송 단백질의 조절을 이해하는 것은 개선 된 치료 적 개입의 발전을 위해 중요하다. 상피 수송의 연구에서 가장 큰 문제는 네이티브 장 상피 세포의 중요한 기능 되풀이되었습니다 적합한 모델 시스템을 개발하고있다. 예컨대 카코-2, T-84, 및 HT-29 세포 Cl.19A 여러 시험 관내 세포 배양 모델은 일반적으로 상피 전송 연구에 사용된다. 이 세포주는 전자를 모델링에 환원 접근 방식을 나타냅니다pithelium 및 상피 미생물 작용들의 검사를 포함한 다양한 역학적 연구에서 사용되어왔다. 그러나, 세포 단일 층 정확하게 세포 - 세포 상호 작용과 생체 내 미세 환경을 반영하지 않습니다. 3D에서 자란 세포는 약물 투과 연구 모델 유망한 것으로 도시 하였다. 우리는 3 차원의 카코 -2 세포는 상피 수송을 연구하는데 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 카코 2 세포 연구는 세포 특정 효과를 배제하고 계정에 기본 대장의 복잡성을 다른 모델로하고 있습니다 것이 중요하다. 여러 방법들이 이전에 이러한 절연 상피 세포 또는 절연 세포막 소포에 everted SAC와 같은 흡수 수송의 기능을 평가하기 위해 사용되었다. 모델에 대한 및 수송 기능의 측정을 고려하여 현장에서 문제를 가지고, 여기에서 3D 카코 -2 세포 성장과 같은 Ussing 챔버의 사용을 설명하기위한 프로토콜을 보여효과적인 접근법은 그대로 편광 장내 상피 같이 세로토닌 수송을 측정한다.

3D 카코 2 낭종의 면역 염색은 그림 1과 같다. 팔로이 딘의 굴지 염색 차원 낭종에 잘 경계가 루멘을 나타내는 XY 평면의 대표적인 이미지는도 1a에 도시되어있다. 루멘에 직면 측면은 혀끝의 측면이다. 강력한 상피 표현형의 3D 환경의 결과에서 배양 상피 세포. 액틴과 SERT 공동 염색 하루 12에 다른 카코 2 낭종은 그림 1B에 표시됩니다. XY...

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Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

우리는 3 차원으로 성장 카코 -2 세포를 시험관 내 세포 배양 모델 및 마우스 창자의 생체 모델을 이용하여 장내 세로토닌 운반체 (SERT) 기능과 발현의 조절을 연구하는 간단한 방법을 설명한다. 이러한 방법은 다른 상피 수송의 연구에 적용 할 수있다.

방법은 3D로 재배 원주민 소장과 카코 2 세포에서 상피 전송 단백질의 기능과 발현을 연구하는

The intestinal epithelium has important transport and barrier functions that play key roles in normal physiological functions of the body while providing ...

methods-to-study-epithelial-transport-protein-function-expression

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

15.5K 조회수.  University of Illinois at Chicago.  우리는 3 차원으로 성장 카코 -2 세포를 시험관 내 세포 배양 모델 및 마우스 창자의 생체 모델을 이용하여 장내 세로토닌 운반체 (SERT) 기능과 발현의 조절을 연구하는 간단한 방법을 설명한다. 이러한 방법은 다른 상피 수송의 연구에 적용 할 수있다. 

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Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. Additionally, traversing cellular barriers in the body is crucial for both oral delivery of therapeutic NCs into the circulation and transport from the blood into tissues, where intervention is needed. NC transport across cellular barriers is achieved by: (i) the paracellular route, via transient disruption of the junctions that interlock adjacent cells, or (ii) the transcellular route, where materials are internalized by endocytosis, transported across the cell body, and secreted at the opposite cell surface (transyctosis). Delivery across cellular barriers can be facilitated by coupling therapeutics or their carriers with targeting agents that bind specifically to cell-surface markers involved in transport. Here, we provide methods to measure the extent and mechanism of NC transport across a model cell barrier, which consists of a monolayer of gastrointestinal (GI) epithelial cells grown on a porous membrane located in a transwell insert. Formation of a permeability barrier is confirmed by measuring transepithelial electrical resistance (TEER), transepithelial transport of a control substance, and immunostaining of tight junctions. As an example, ~200&#160;nm polymer NCs are used, which carry a therapeutic cargo and are coated with an antibody that targets a cell-surface determinant. The antibody or therapeutic cargo is labeled with 125I for radioisotope tracing and labeled NCs are added to the upper chamber over the cell monolayer for varying periods of time. NCs associated to the cells and/or transported to the underlying chamber can be detected. Measurement of free 125I allows subtraction of the degraded fraction. The paracellular route is assessed by determining potential changes caused by NC transport to the barrier parameters described above. Transcellular transport is determined by addressing the effect of modulating endocytosis and transcytosis pathways.

Many therapeutic applications require safe and efficient transport of drug carriers and their cargoes across cellular barriers in the body. This article describes an adaptation of established methods to evaluate the rate and mechanism of transport of drug nanocarriers (NCs) across cellular barriers, such as the gastrointestinal (GI) epithelium.

모델 및 세포 장벽에 걸쳐 약물 전달 시스템의 전송을 평가하는 방법

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

연구

생체공학

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological questions in cell and developmental biology. In addition, organoids together with recent technical advances in gene editing and viral gene delivery promises to advance medical research and development of new drugs for treatment of diseases. Organoids grown in vitro in basement matrix provide powerful model systems for studying the behavior and function of various proteins and are well suited for live-imaging of fluorescent-tagged proteins. However, establishing the expression and localization of the endogenous proteins in ex vivo tissue and in in vitro organoids is important to verify the behavior of the tagged proteins. To this end we have developed and modified tissue isolation, fixation, and immuno-labeling protocols for localization of microtubules, centrosomal, and associated proteins in ex vivo intestinal tissue and in in vitro intestinal organoids. The aim was for the fixative to preserve the 3D architecture of the organoids/tissue while also preserving antibody antigenicity and enabling good penetration and clearance of fixative and antibodies. Exposure to cold depolymerizes all but stable microtubules and this was a key factor when modifying the various protocols. We found that increasing the ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) concentration from 3 mM to 30 mM gave efficient detachment of villi and crypts in the small intestine while 3 mM EDTA was sufficient for colonic crypts. The developed formaldehyde/methanol fixation protocol gave very good structural preservation while also preserving antigenicity for effective labeling of microtubules, actin, and the end-binding (EB) proteins. It also worked for the centrosomal protein ninein although the methanol protocol worked more consistently. We further established that fixation and immuno-labeling of microtubules and associated proteins could be achieved with organoids isolated from or remaining within the basement matrix.

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

We present protocols for isolation of intestinal 3D structures from in vivo tissue and in vitro basement matrix embedded organoids, and detail different fixation and staining protocols optimized for immuno-labeling of microtubule, centrosomal, and junctional proteins as well as cell markers including the stem cell protein Lgr5.

Microtubules 및 전 비보 장 조직 및 장 Organoids 3 차원 생체 외에서 Centrosomal 단백질의 면역 형광 라벨

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

발생학

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted in sophisticated in vitro models of the intestinal mucosa. Leveraging these emerging model systems will require adaptation of tools and techniques developed for 2D culture systems and animals. Here, we describe a technique for measuring epithelial barrier permeability in human intestinal organoids in real-time. This is accomplished by microinjection of fluorescently-labeled dextran and imaging on an inverted microscope fitted with epifluorescent filters. Real-time measurement of the barrier permeability in intestinal organoids facilitates the generation of high-resolution temporal data in human intestinal epithelial tissue, although this technique can also be applied to fixed timepoint imaging approaches. This protocol is readily adaptable for the measurement of epithelial barrier permeability following exposure to pharmacologic agents, bacterial products or toxins, or live microorganisms. With minor modifications, this protocol can also serve as a general primer on microinjection of intestinal organoids and users may choose to supplement this protocol with additional or alternative downstream applications following microinjection.

This protocol describes the measurement of epithelial barrier permeability in real-time following pharmacologic treatment in human intestinal organoids using fluorescent microscopy and live cell microscopy.

인간의 장 Organoids에 상피 장벽 침투성의 실시간 측정

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

병원 균, 공생, 그리고 호스트 창 자 상피 사이 상호 작용을 공부 하는 인간 Colonoid Monolayers

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

면역학 및 감염병학

Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was not possible in classical cell culture monolayers. Moreover, monolayer cell cultures are good in vitro model systems but do not represent the complex cellular differentiation processes and functions that rely on 3D structure. This has so far only been possible in animal experiments, which are laborious, time consuming, and hard to assess by optical techniques. Here we describe an assay to quantitatively determine the barrier integrity over time in living small intestinal mouse organoids. To validate our model, we applied interferon gamma (IFN-&#947;) as a positive control for barrier destruction and organoids derived from IFN-&#947; receptor 2 knock out mice as a negative control. The assay allowed us to determine the impact of IFN-&#947; on the intestinal barrier integrity and the IFN-&#947; induced degradation of the tight junction proteins claudin-2, -7, and -15. This assay could also be used to investigate the impact of chemical compounds, proteins, toxins, bacteria, or patient-derived probes on the intestinal barrier integrity.

Here we describe a technique to quantify the barrier integrity of small intestinal organoids. The fact that the method is based on living organoids enables the sequential investigation of different barrier integrity modulating substances or combinations thereof in a time-resolved manner.

살아있는 오르가노이드의 장 장벽 고장 조사

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was ...

의학

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).

Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

소장에 의해 지질 전송을 연구하기 위해 카코 2 셀을 사용하여

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

생물학

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 접근 장 상피 세포 침투성을 결정 하

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

오가노이드 유래 상피 단층: 장 장벽 기능을 위한 임상적으로 관련된 시험관내 모델

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

장 관성 오르가노이드 모델을 사용하여 정법별 상호 작용을 연구하는 문화 방법

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

파라핀 Embedding을 이용한 3D 장 점막 모델 구축

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the pharmacological screening of potentially beneficial substances, and for toxicity studies on potentially harmful food components. Of relevance, there is a current demand for the development of cell-based in vitro models to substitute animal models. Here, a protocol for a basic, &#8220;healthy tissue&#8221; three-dimensional (3D) intestinal equivalent model using cell lines is presented with the dual benefit of providing both experimental simplicity (standardized and easily repeatable system) and physiological complexity (Caco-2 enterocytes with a supporting immune component of U937 monocytes and L929 fibroblasts). The protocol also includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents, thereby providing the advantage of analyzing multiple visual parameters from a single experiment. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) stained sections showing the Caco-2 columnar cells forming a tight and regular monolayer in control treatments are used to verify the efficacy of the model as an experimental system. Using gluten as a pro-inflammatory food component, parameters analyzed from sections include reduced monolayer thickness, as well as disruption and detachment from the underlying matrix (H&#38;E), decreased tight junction protein expression as shown from occludin staining (quantifiable statistically), and immune-activation of migrating U937 cells as evidenced from the cluster of differentiation 14 (CD14) staining and CD11b-related differentiation into macrophages. As shown by using lipopolysaccharide to simulate intestinal inflammation, additional parameters that can be measured are increased mucus staining and cytokine expression (such as midkine) that can be extracted from the medium prior to fixation. The basic three-dimensional (3D) intestinal mucosa model and fixed sections can be recommended for inflammatory status and barrier integrity studies with the possibility of analyzing multiple visual quantifiable parameters.

저자 스포트라이트: 3D 인간 세포주 모델을 사용하여 화합물이 장 조직에 미치는 영향 조사 

Here we describe constructing a basic three-dimensional (3D) intestinal cell line model system and a paraffin embedding protocol for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents. Staining of selected proteins permits the analysis of multiple visual parameters from a single experiment for potential use in preclinical drug screening studies.

면역 성분이 있는 기본 3차원(3D) 장 모델 시스템

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...