The authors would like to thank Drs. Helene Salmon and Miriam Merad from Icahn School of Medicine at Mount Sinai for providing the B16-F10-YFP cells and for their expert advice on melanoma mouse models. The authors further thank the Animal Imaging Core Facility, the Radiochemistry and Molecular Imaging Probes Core Facility, and the Molecular Cytology Core Facility at Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) for their support. This work was supported by National Institutes of Health grants NIH 1 R01 HL125703 (W.J.M.M.), R01CA155432 (W.J.M.M.), K25 EB016673 (T.R.) and P30 CA008748 (MSK Center Grant). The authors also thank the Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (CMINT) at MSK for their financial support (T.R.).

절차는 나노 입자의 이중 방사성 형광 라벨, 생체 내 PET-CT 영상, 생체 생체 분포를 측정하고, 생체 면역 구성 및 유세포 분석. 모든 동물 실험은 메모리얼 슬론 케터링 암 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 이중 표지 된 리포좀 1. 준비 주 : 동계 B16 흑색 종 종양은 2 % -isoflurane 함유 산소를 흡입 마취로부터 C57BL / 6 마우스의 후방 측면에 30 B16-F10 세포를 주입함으로써 발생 될 수있다. 수술 중 멸균 작업 공간에서 멸균 시약 및 도구를 사용합니다. 수술 후주의 깊게 마취에서 그들의 회복 될 때까지 동물을 관찰한다. 그들은 전체 의식과 이동성을 회복하는 경우에만 다시 자신의 새장에 동물을 넣습니다. 이종 이식 종양 동물 용 살균 객실을 수용. 크기와 종양300mm의 3에 의한 나노 입자의 축적을 증가시킬 수 있습니다 자신의 발음 향상된 투자율 및 유지 효과 (EPR)에 나노 입자의 특성에 적합하다. 자세한 프로토콜은 아래에 제공됩니다. <ol><li> 둥근 바닥 플라스크에 들어있는 클로로포름 1,2- dipalmitoyl- SN -glycero -3- phophocholine (DPPC), 콜레스테롤, 1,2- disearoyl- SN -glycero- 2 ㎖에 지질의 20 mg의 혼합물을 용해 3 phosphoethanolamine - 폴리 (에틸렌 글리콜) 2000 (PEG2000-DSPE) DSPE-데페 록 사민 (DSPE-DFO) 8 및 1,1- diododecyl-3,3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine -5,5- 디설 폰산 ( DiIC12 [5]는 각각 61.3 %, 33.4 %, 5, 0.2 % 및 0.1 %의 몰비로) -ds. 참고 :이 지질 조성물은 현재 임상 2에 사용 된 독소루비신의 리포좀 제형과 매우 유사합니다. 우리의 과정에서 생성 된 리포좀은 밀접하게 임상 nanomedic의 생체 성능을 모방합니다오프라인. </li><li> 유기 용매를 제거하고, 실온에서 얇은 지질막을 형성하는 회전 증발기를 사용한다. PBS 20 mL를 넣고 30 분 동안 초음파 처리 얼음에 충분한 냉각과 3.8 mm의 초음파 팁 30 W의 진폭을 이용하여 나노 리포좀을 생성한다. </li><li> 원심 분리기 집계를 제거하고 세척 PBS는 원심 여과 (분자량 컷 - 오프 (MWCO 사용과 나노 입자 10 분 동안 4,000 XG에 리포좀 용액 : 어떤 것, 리포좀 무료 지질 및 잔류 유기 용매를 제거하기 위해 100 kDa의)을 집중. 상부 챔버 내에서 유지되고 새로운 튜브로 옮긴다. 리포좀은 후속 단계 전에 1 주 동안 PBS에서 냉장고에 저장 될 수있다. </li><li> 품질 관리, 동적 광산란 (DLS)으로 리포좀을 특성화. 특히, PBS 950 μL와 리포좀의 50 μL를 혼합 한 다음 크기 조정 큐벳에 혼합물을 전송합니다. 분석기에 큐벳을 놓고 입자를 측정크기 및 크기 분포. 각각 0.2 - 120 nm이고, 0.1 - 입자 크기 및 크기 분포 (다 분산도 지수 (PDI)가) 90이 될 것으로 예상된다. </li><li> 방사성 표지의 경우, (1.5 ㎖의 튜브에서 2 시간 동안 37 ° C에서 1 mCi의 89 ZR-옥살산 6.9와 7.1 사이의 pH에서 총 부피를 PBS 지질 2 ㎎에 상응 정제 리포좀, 혼합 ~ 100 μL). 1.3 단계와 유사 원심 여과 (MWCO = 100 kDa의)에 의해 자유, 미 반응 89 ZR을 제거합니다. 멸균 PBS와 잔류 물을 씻고 원하는 볼륨에 희석. 95 % - 방사 화학적 수율은 80해야한다. 주의! 방사성 물질로 작업하는 것은 매우 조절된다. 금융 기관은 인증하고 필요한 시설, 인력 교육, 방사능 사용의 엄격한 모니터링을 제공해야합니다. 연구자들은 적절한 교육을 받고 방사능을 처리 할 때 개인 보호 장비 및 선량 반지 / 배지를 착용해야합니다. </li><li&gt; 일반적으로 98 % 10 이상이어야한다 크기 배제 라디오-HPLC에 의해 방사성 표지 된 리포좀의 방사 화학적 순도를 결정합니다. 95 %보다 낮은 방사 화학적 순도는 단계 1.5에 불충분 한 세척을 나타내는입니다. </li><li> 방사성 표지 한 후, 동적 광산란에 의한 나노 입자의 크기를 결정한다. 크기 및 PDI는 1.4 단계 (10)에서의 측정과 동일한 범위 내에있을 것으로 예상된다. 주 : 방사성 샘플을 유동 세포 계측기 또는 형광 현미경을 허용하지 않는 경우, 비 - 방사성 NAT ZR-옥살 단계 1.5 리포좀 라벨을 사용할 수있다. 이러한 비 방사성 리포좀은 방사성 유사체와 동일한 특성을 갖는다. 이 절차의 묘사는도 2에 제공된다. </li></ol> 이중 표지 된 리포좀의 생체 PET-CT 영상 및 생체 분포 2. <ol><li> w 이중 표지 리포좀의 약 100 μL를 주입i 번째 구속 흑색 종 쥐에 방사능의 약 300 μCi를 - 약 10 mCi의 89 ZR / 체중 kg에서 자신의 꼬리 정맥을 통해 (C57BL / 6, 여성, 1016 주 이전). </li><li> 반감기를 결정하기 위해, 28-G 인슐린 주사기를 사용하여 2 % 이소 플루 란 하에서 산소 - 함유 마취 동물의 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취. 2 분, 15 분, 1 시간, 4 시간, 8 시간, 24 시간, 및 주입 후 48 시간에서 미리 칭량 튜브 - (20 μL 10)에 혈액을 수집한다. , 차에 의해 피 계량 감마 계수기를 사용하여 방사능 콘텐츠를 결정하고, g 당 주입 도즈 (%의 ID / g)의 비율로 방사능 농도를 계산한다. 주 : 마취 시스템, 복구 케이지, 난방 및 생물 학적 후드가 장착 된 방에서 절차를 수행합니다. 동물이 완전히 복구하고 새장을 들고에 복구 케이지에서 그들을 전송하기 전에 시술 후 정상 이동성을 얻을 수 있는지 확인합니다. 하우스 투여 동물 지정된 객실에서 종양 베어링 동물방사성 물질. </li><li> 24 또는 48 시간의 주입 후 작은 동물 MicroPET-CT 스캐너 (10) 리포좀, 이미지 마우스. 그 배에 수평으로 마취 된 동물을 놓고 마취를 유지. 코 콘을 통해 2 % 이소 플루 란 산소를 관리 할 수 ​​있습니다. 건조에서 그들을 방지하기 위해 스캔 전에 눈 안과 연고를 적용합니다. </li><li> 15 분의 대략적인 시간과 함께, 전신 PET 정적 스캔 기록 적어도 5000 만 일치하는 이벤트를 수행한다. 각각 350-700 keV의 6 ns의에서 에너지와 우연의 일치 타이밍 창을 설정합니다. 그 후, 5 분 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 검사를 수행합니다. 80 kV의 500 μA의 전류의 전압으로 X 선 튜브를 설정; 중부 표준시 스캔은 프레임 (10) 당 약 145 밀리로, 220도 총 120 회전 단계를 사용합니다. </li><li> 애완 동물-CT 검사 후 즉시 이산화탄소 질식하여 쥐를 희생하고 pinchi에 의해 죽음을 확인동물의 발을 ng를. 확인되면, 자궁 경부 전위를 수행합니다. </li><li> 먼저 좌심실에 20 mL의 PBS를 주입 한 후 우심방을 열고 절단하여 마우스 조직에서 혈액을 제거하고 이후 종양, 간, 비장, 폐, 신장, 근육, 등 16 관련 조직을 수집합니다. </li><li> 상기 조직 무게 (8, 9)를 계산하여 그 감마 방사능 함량을 측정하고, g 당 주입 도즈 (%의 ID / g)의 비율로 조직 방사능 축적량을 계산한다. </li></ol> 3. 예 생체 유동 세포 계측법 및 면역 염색 주 : 체중 kg 당 0.5 mg의 염료의 투여 량으로 꼬리 정맥을 통하여 마우스에 흑색 형광 리포좀 100 μL를 주입한다. 방사성 샘플을 유동 세포 계측기 및 형광 현미경으로 허용되지 않는 경우, 비 - 방사성 리포좀이 사용되어야한다. <ol><li> 단계 2.5에서와 같이, 마우스 24 시간 후 주입을 희생하고 차가운 PBS에 저장해야 종양를 수집합니다. </li><li> 유동 세포 계측법에 대해 다음 단계 17를 따르십시오 <ol><li> 0.5 % BSA 및 1 (PBS 완충액 유세포에서 정제 된 콜라게나 제 I 및 II (4 U / ㎖), 히알루로 (60 U / ㎖)의 DNase I (60 U / ㎖)의 혼합물로 이루어진 효소 칵테일 준비 mM의 EDTA). </li><li> 1.5 ㎖의 튜브에 효소 칵테일 버퍼 200 μL와 종양 조직 100 mg의 혼합 및 미세 가위로 작은 조각으로 조직을 주사위. 튜브에 효소 칵테일의 또 다른 1.3 mL를 넣고 및 6 웰 플레이트에 그 내용을 전송합니다. </li><li> 60 rpm에서 60 분 동안 37 ℃로 오븐 내부에 배치 수평 진탕 기에서 6 웰 플레이트를 흔들어. </li><li> 단일 세포 현탁액을 얻었다 유세포 버퍼로 3 회 조직 파쇄 액을 씻는다. </li><li> 특정 CD45, CD11b를, Ly6C, 중 CD11c 포함하는 바이오 마커에 대한 항체의 칵테일 세포를 얼룩,CD64, CD3, MHCII와 CD31 (1 : 모든 항체 (200) 희석, 복제 정보가 재료 스프레드 시트에서 제공된다). 중요한 세포 유형을 확인하고 (5) 분석 소프트웨어 계측법 적절한 흐름 각 세포 집단에서 -ds DiIC12들의 평균 형광 강도 (MFI)를 결정한다. </li></ol></li><li> 면역 염색의 경우, 다음 단계를 수행하십시오 : <ol><li> 최적의 절단 매체 OCT ()로 채워진 카세트에 종양을 놓고 드라이 아이스에 동결. </li><li> 종양 조직에서 6 μm의 냉동 섹션을 확인하고 조직학 유리 슬라이드에 배치; 섹션은 조직의 대표적인 정보를 제공하는 종양의 가장 큰 단면을 커버한다. </li><li> 바이오 마커를 얼룩 (예를 들어, 내피 세포에 대한 CD31)에 대응하는 항체 (예를 들어, 항 CD31, 복제 MEC13.3)에 관심. 파라 포름 알데히드와 섹션을 수정; 혈청 보조 항체의 종의 기원을 일치로를 차단; incub4 ° C에서 12 시간 동안 차 항체와 식사를 한 후 2 시간 동안 차 항체; 그리고 마지막으로, PBS로 씻어 커버 전표로 커버. 이미지 라이카 똑바로 공 촛점 SP5 현미경 (13), (16)와 스테인드 슬라이드. </li></ol></li></ol>

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The authors have no disclosure to make.

프로토콜 내에서 중요한 단계 : 이중 표지 된 리포좀의 높은 품질이 장기간에 걸쳐 일관된 결과를 생성하는 열쇠이다. 무료 형광 염료 또는 (89) 지르코늄 이온은 완전히 다른 타겟팅 패턴을 생성 할 수있는 완전히 정제 단계 동안 제거되어야한다. 면역계는 훨씬 실험 암 나노 의학 성능에 영향을 미치는지 또한, 면역 적격 마우스 모델의 사용은이 프로토콜에서 사용 된 ...

나노 의학은 암 치료 개발 한 패러다임 시프트된다. 이러한 liposome- 및 알부민 기반 nanotherapies 2, 3 등의 이전 암 나노 의학의 엄청난 임상 적 충격에 의해 영감을 많은 새로운 제형은 지난 10 년간 생산되고있다. 그러나, 이들 나노 의학 암의 임상 변환 성공의 최근의 분석은 이들 중 일부만 임상 -4,5- 승인 된 것을 나타낸다. 새로운 암 나노 의학의 임상 번역 한 주요 장애물이없는 치료 학적 화합물 (6)의 직접 투여와 비교하여 치료 지수의 제한된 개량이다. 전임상 동물 모델에서 전신 조직에 나노 의학 및 세포 수준의 생체 내 성능 등 정확한 평가로서 IDENTIF에 필수적인Y 미래 임상 번역에 대한 최적의 치료 지수 가진 사람. 나노 물질은 모든 임상 이미징 양식 (7) 중 뛰어난 감도와 재현성을 가지고 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 영상으로 살아있는 동물에서 양적 특성에 대한 방사성 표지가 될 수 있습니다. 예를 들어, 89 나노 의학 암 (8, 9), (10)뿐만 아니라 다른 질병 모델 (11)에 대한 마우스 모델에서 특성화되었다 긴 순환 ZR은 표지. 또한, 나노 의학의 혈중 반감기 및 생체 분포는 광범위 개별 조직 8 생체 방사능을 측정하여 평가할 수있다. 따라서, 방사성 표지는 체계적이고 조직 수준에서 나노 의학의 정량적 평가를 할 수 있습니다. 중요한 것은, radiolabeleD 나노 의학은 일반적으로 인한 방사성 신호의 제한된 공간 해상도로 단일 세포 또는 세포 내 수준에서 분석 될 수 없다. 따라서, 형광 표식은 유동 세포 계측법 및 형광 현미경 (12)와 같은 광학 이미징 기술과 나노 입자의 평가 상보 양상 것을 안다. 이를 위해, 방사성 동위 원소 및 형광 태그로 표지 된 나노 입자는 정량적 핵 촬상하여 생체 내에서 평가 될 수 있고, 생체 방사능 계수에 의해, 이들은 광범위하게 결상에 의한 세포 수준에서 특성화 될 수있다. 이전에는, 고밀도 지단백질 (HDL) (11), 리포좀 (9), (10) 고분자 나노 입자, 항체 단편, 및 nanoemu 등 다양한 나노 입자에 방사성 형광 라벨을 포함하는 모듈 식 절차를 개발lsions 10, 13. 이 라벨이 나노 입자는 특정 응용 프로그램에 대해 이러한 나노 물질의 최적화를 유도 서로 다른 수준에서 관련 동물 모델에서 양적 특성 허용했다. 현재 연구에서, 그 목적은 가장 확립 나노 의학 플랫폼 14 이중 표지 된 나노 입자를 생성하는 광범위한 방법을 설명하는 일례를 가득 차거나 철저히 고전 동계 흑색 종 B16-F10의 마우스 모델 (15)을 특성화하는 리포좀 - 더 나노 입자를 사용하는 . 결과로부터, 우리는이 나노 입자를 특성화 방법 관련 마우스 모델에서 다른 암 나노 의학 평가하도록 구성 될 수 있다고 확신한다.

<table><tbody><tr><td>DPPC</td><td>Avantilipids</td><td>850355</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG2000</td><td>Avantilipids</td><td>880120P</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-DFO</td><td>Home made</td><td>110634</td><td>Perez-Medina &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, JNM, 2014</td></tr><tr><td>DiIC12[5]-DS</td><td>AAT Bioquest</td><td>22051</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal filter</td><td>Vivaproducts</td><td>VS2061</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator</td><td>Buchi</td><td>R-100</td><td></td></tr><tr><td>Radio-HPLC</td><td>Shimadzu HPLC with 2 LC-10AT pumps</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;89&lt;/sup&gt;Zr-oxalate</td><td>MSKCC</td><td>Synthesized in house</td><td>TR19/9 variable beam cyclotron (Ebco Industries Inc.)</td></tr><tr><td>Micro PET-CT</td><td>Siemens</td><td>Inveon Micro-PET/CT</td><td></td></tr><tr><td>Gamma counter</td><td>PerkinElmer</td><td>2470-0150</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometry</td><td>BD Biosciences</td><td>Fortessa</td><td>Any multi-parametric flow cytometry analyzers would suffice</td></tr><tr><td>C57BL/6 mice</td><td>Jackson Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B16-YFP melanoma cells</td><td>Home made</td><td>N/A</td><td>Salmon &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Immunity, 2016</td></tr><tr><td>Ly6C (clone HK1.4)--APC-Cy7</td><td>128025</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>MHCII (M5/114/152)--APC</td><td>107613</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD45 (30-F11)--BV510</td><td>103137</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD64 (X54-5/7.1)--PE-Cy7</td><td>139313</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD11b (M1/70)--BV605</td><td>101237</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD3 (17A2)--BV711</td><td>100241</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (13.3)--PE</td><td>561073</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD11c (M418)--PerCP-Cy5.5</td><td>117327</td><td>BD Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (13.3) no fluorophore</td><td>550274</td><td>BD Biosciences</td><td></td></tr></tbody></table>

a comprehensive procedure to evaluate the in vivo performance of cancer nanomedicines

병원에서 이전 암 나노 의학의 성공에 의해 영감을, 연구진은 지난 10 년간 새로운 제형의 큰 숫자를 생성했다. 임상 개발중인 나노 의학의 대부분 실망스러운 결과를 생산하는 반면, 나노 의학의 단지 소수의 임상 사용이 승인되었다. 새로운 암 나노 의학의 성공적인 임상 번역 한 주요 장애물은 생체 내 성능의 정확한 이해의 부족이다. 이 문서는 양전자 방출 단층 촬영 - 컴퓨터 단층 촬영 (PET-CT), 방사능 정량 방법의 통합을 통해 조직, 조직, 단일 세포 및 세포 내 수준에서 종양 베어링 마우스의 나노 의학의 생체 내 동작을 특성화하기 위해 엄격한 절차를 제공합니다 , 유동 세포 계측법 및 형광 현미경. 이 방법을 사용하여, 연구자들은 정확하게 cance의 중요한 마우스 모델에서 신규 한 나노 조성물을 평가할 수있다아르 자형. 이러한 프로토콜은 높은 병진 전위 가장 유망한 암 나노 의학을 식별하거나 미래 번역 암 나노 의학의 최적화를 도울 수있는 능력을 가질 수있다.

그림 1은 절차의 개요를 보여줍니다. 도 2는 단계 1 내지 10에 기술 된 이중 표지 된 리포솜의 개략적 인 합성 방법을 제시한다. 그림에서 2 단계에 설명 된대로 3 표시 대표적인 PET-CT 이미지 (그림 3a), PET 영상 (그림 3B), 혈중 반감기 (도 3c), 방사성 나노 입자의 생체 분...

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A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

포괄적 인 절차를 평가하는<em&gt; 생체</em&gt; 암 나노 의학의 성능

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

a-comprehensive-procedure-to-evaluate-vivo-performance-cancer

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

8.8K 조회수.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

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Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. Photosensitizers selectively accumulate in tumor tissue and lead to tumor cell death in the presence of oxygen and the proper wavelength of light.
To increase the therapeutic effect of PDT, we developed both photosensitizer- and anticancer agent-loaded lung cancer-targeted nanoparticles. Both enhanced permeability and retention (EPR) effect-based passive targeting and hyaluronic-acid-CD44 interaction-based active targeting were applied. CD44 is a well-known hyaluronic acid receptor that is often introduced as a biomarker of non-small cell lung cancer. 
In addition, a combination of PDT and chemotherapy is adopted in the present study. This combination concept may increase anticancer therapeutic effects and reduce adverse reactions. 
We chose hypocrellin B (HB) as a novel photosensitizer in this study. It has been reported that HB causes higher anticancer efficacy of PDT compared to hematoporphyrin derivatives1. Paclitaxel was selected as the anticancer drug since it has proven to be a potential treatment for lung cancer2. 
The antitumor efficacies of photosensitizer (HB) solution, photosensitizer encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles (HB-NPs), and both photosensitizer- and anticancer agent (paclitaxel)-encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles (HB-P-NPs) after PDT were compared both in vitro and in vivo. The in vitro phototoxicity in A549 (human lung adenocarcinoma) cells and the in vivo antitumor efficacy in A549 tumor-bearing mice were evaluated.
The HB-P-NP treatment group showed the most effective anticancer effect after PDT. In conclusion, the HB-P-NPs prepared in the present study represent a potential and novel photosensitizer delivery system in treating lung cancer with PDT.

Photodynamic therapy (PDT) is an alternative choice for lung cancer treatment. To increase the therapeutic effect of PDT, lung cancer-targeted nanoparticles combined with chemotherapy were developed. Both in vitro and in vivo anticancer efficacies of PDT with prepared nanoparticles were evaluated.

폐암 표적 나노 입자와 광 역학 치료의 항암 효능

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

연구

암 연구학

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its therapeutic benefit. Nanoparticle-based drug combination has been shown to mitigate the problems encountered by free drug combination therapy. Our previous studies have shown that the combination of two anticancer drugs, doxorubicin (DOX) and mitomycin C (MMC), produced a synergistic effect against both murine and human breast cancer cells in vitro. DOX and MMC co-loaded polymer-lipid hybrid nanoparticles (DMPLN) bypassed various efflux transporter pumps that confer multidrug resistance and demonstrated enhanced efficacy in breast tumor models. Compared to conventional solution forms, such superior efficacy of DMPLN was attributed to the synchronized pharmacokinetics of DOX and MMC and increased intracellular drug bioavailability within tumor cells enabled by the nanocarrier PLN. 
To evaluate the pharmacokinetics and bio-distribution of co-administered DOX and MMC in both free solution and nanoparticle forms, a simple and efficient multi-drug analysis method using reverse-phase high performance liquid chromatography (HPLC) was developed. In contrast to previously reported methods that analyzed DOX or MMC individually in the plasma, this new HPLC method is able to simultaneously quantitate DOX, MMC and a major cardio-toxic DOX metabolite, doxorubicinol (DOXol), in various biological matrices (e.g., whole blood, breast tumor, and heart). A dual fluorescent and ultraviolet absorbent probe 4-methylumbelliferone (4-MU) was used as an internal standard (I.S.) for one-step detection of multiple drug analysis with different detection wavelengths. This method was successfully applied to determine the concentrations of DOX and MMC delivered by both nanoparticle and solution approaches in whole blood and various tissues in an orthotopic breast tumor murine model. The analytical method presented is a useful tool for pre-clinical analysis of nanoparticle-based delivery of drug combinations.

This protocol describes an efficient and convenient analytical process of sample extraction and simultaneous determination of multiple drugs, doxorubicin (DOX), mitomycin C (MMC) and a cardio-toxic DOX metabolite, doxorubicinol (DOXol), in the biological samples from a preclinical breast tumor model treated with nanoparticle formulations of synergistic drug combination.

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its ...

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Intravital 이미징을 사용하여 실시간으로 종양의 Nanoparticle의 이해 평가

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

의학

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

생체공학

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory cytokine interleukin-1 alpha (IL-1&#945;) has been evaluated as an anticancer agent in several preclinical and clinical studies. However, dose-limiting toxicities, including flu-like symptoms and hypotension, have dampened the enthusiasm for this therapeutic strategy. Polyanhydride nanoparticle (NP)-based delivery of IL-1&#945; would represent an effective approach in this context since this may allow for a slow and controlled release of IL-1&#945; systemically while reducing toxic side effects. Here an analysis of the antitumor activity of IL-1&#945;-loaded polyanhydride NPs in a head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) syngeneic mouse model is described. Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells were injected subcutaneously into the right flank of C57BL/6J mice. Once tumors reached 3-4 mm in any direction, a 1.5% IL-1a - loaded 20:80 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane:1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPTEG: CPH) nanoparticle (IL-1&#945;-NP) formulation was administered to mice intraperitoneally. Tumor size and body weight were continuously measured until tumor size or weight loss reached euthanasia criteria. Blood samples were taken to evaluate antitumor immune responses by submandibular venipuncture, and inflammatory cytokines were measured through cytokine multiplex assays. Tumor and inguinal lymph nodes were resected and homogenized into a single-cell suspension to analyze various immune cells through multicolor flow cytometry. These standard methods will allow investigators to study the antitumor immune response and potential mechanism of immunostimulatory NPs and other immunotherapy agents for cancer treatment.

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

A standard protocol is described to study the antitumor activity and associated toxicity of IL-1&#945; in a syngeneic mouse model of HNSCC.

폴리안하이드라이드 IL-1α 나노입자의 생체 내 항종양 활성 평가

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

암 약물 과민 반응의 효과를 평가<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.

나노 바디 및 항체 기반의 검증<em&gt; 생체</em마우스에서&gt; 종양 이종 이식 NIRF 이미징 실험 사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 유동 세포 계측법 및 현미경

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

<meta charset="utf8"></head><body>전이성 유방암 치료를 위한 발암성 miRNA-10b를 표적으로 하는 나노약물

Monitoring of Nanodrug Accumulation in Murine Breast Cancer Metastases

Metastatic breast cancer is a devastating disease with very limited therapeutic options, calling for new therapeutic strategies. Oncogenic miRNAs have been shown to be associated with the metastatic potential of breast cancer and are implicated in tumor cell migration, invasion, and viability. However, it can be difficult to deliver an inhibitory RNA molecule to the tissue of interest. To overcome this challenge and deliver active antisense oligonucleotides to tumors, we utilized magnetic iron oxide nanoparticles as a delivery platform. These nanoparticles target tissues with increased vascular permeability, such as sites of inflammation or cancer. Delivery of these nanoparticles can be monitored in vivo by magnetic resonance imaging (MRI) due to their magnetic properties. Translation of this therapeutic approach into the clinic will be more accessible because of its compatibility with this relevant imaging modality. They can also be labeled with other imaging reporters such as a Cy5.5 near-infrared optical dye for correlative optical imaging and fluorescence microscopy. Here, we demonstrate that nanoparticles labeled with Cy5.5 and conjugated to therapeutic oligomers targeting oncogenic miRNA-10b (termed MN-anti-miR10b, or &#34;nanodrug&#34;) administered intravenously accumulate in metastatic sites, opening a possibility for therapeutic intervention of metastatic breast cancer.

<meta charset="utf8"></head><body>Murine Breast Cancer Metastases의 나노약물 축적 모니터링

Here, we describe the protocol for in vivo delivery of magnetic iron oxide nanoparticles carrying RNA oligomers to metastatic breast cancer in animal models, providing a clinically viable approach for the therapeutic silencing of oncogenic nucleic acids.

Murine Breast Cancer Metastases의 나노약물 축적 모니터링

Metastatic breast cancer is a devastating disease with very limited therapeutic options, calling for new therapeutic strategies. Oncogenic miRNAs have ...

포괄적 인 절차를 평가하는

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폐암 표적 나노 입자와 광 역학 치료의 항암 효능

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

Intravital 이미징을 사용하여 실시간으로 종양의 Nanoparticle의 이해 평가

에 대한 바이러스 나노 입자

폴리안하이드라이드 IL-1α 나노입자의 생체 내 항종양 활성 평가

암 약물 과민 반응의 효과를 평가

나노 바디 및 항체 기반의 검증

Murine Breast Cancer Metastases의 나노약물 축적 모니터링

Murine Breast Cancer Metastases의 나노약물 축적 모니터링

Murine Breast Cancer Metastases의 나노약물 축적 모니터링