Name: a comprehensive procedure to evaluate the in vivo performance of cancer nanomedicines
Uploaded: 2017-03-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
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The authors would like to thank Drs. Helene Salmon and Miriam Merad from Icahn School of Medicine at Mount Sinai for providing the B16-F10-YFP cells and for their expert advice on melanoma mouse models. The authors further thank the Animal Imaging Core Facility, the Radiochemistry and Molecular Imaging Probes Core Facility, and the Molecular Cytology Core Facility at Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) for their support. This work was supported by National Institutes of Health grants NIH 1 R01 HL125703 (W.J.M.M.), R01CA155432 (W.J.M.M.), K25 EB016673 (T.R.) and P30 CA008748 (MSK Center Grant). The authors also thank the Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (CMINT) at MSK for their financial support (T.R.).

Das Verfahren besteht aus dem Dual - radioaktive und fluoreszierende Markierung von Nanopartikeln in vivo PET-CT - Bildgebung, ex vivo Bioverteilung Messungen und ex vivo - Immunfärbung und Durchflusszytometrie analysiert. Alle Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee von Memorial Sloan Kettering Cancer Center genehmigt. 1. Herstellung von zweifach markierten Liposome HINWEIS: Syngene B16 Melanomtumoren kann durch Einspritzen von 300.000 B16-F10-Zellen in den hinteren Flanken von C57BL / 6-Mäusen unter Narkose durch das Einatmen von 2% -Isofluran haltigen Sauerstoff induziert werden. Verwenden Sie sterile Reagenzien und Werkzeuge in einem sterilen Arbeitsbereich während der Operation. Nach der Operation sorgfältig beobachten die Tiere bis zu ihrem Erwachen aus der Narkose. Setzen Sie die Tiere wieder in ihren Käfigen nur dann, wenn sie die volle Bewusstsein und Mobilität wiederzuerlangen. Haus sie in sterilen Räumen für Tiere mit xenografted Tumoren. Tumoren mit einer Größevon 300 mm sind 3 für Nanopartikel - Charakterisierung ideal aufgrund ihrer ausgeprägten erhöhte Permeabilität und Retention Effekte (EPR), die Nanopartikel - Akkumulation zu erhöhen. Die detaillierten Protokolle sind unten angegeben. <ol><li> In einem Rundkolben wurde ein Gemisch aus 20 mg der Lipide in 2 ml Chloroform , enthaltend 1,2-Dipalmitoyl- sn - glycero-3-phophocholine (DPPC) auflösen, Cholesterol, 1,2-sn - glycero disearoyl- 3-phosphoethanolamin-poly (ethylenglykol) 2000 (DSPE-PEG2000), DSPE-Deferoxamin (DFO-DSPE) 8, und 1,1-diododecyl-3,3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine-5,5-disulfonsäure ( DiIC12 [5] -DS) bei molaren Verhältnissen von 61,3%, 33,4%, 5, 0,2% und 0,1% betragen. ANMERKUNG: Diese Lipidzusammensetzung ist sehr ähnlich zu der liposomalen Formulierung von Doxorubicin verwendet wird derzeit in der Klinik 2. Die resultierenden Liposomen aus unserem Verfahren wird eng imitieren die in vivo - Wirksamkeit der klinischen nanomedicine. </li><li> Verwenden eines Rotationsverdampfers das organische Lösungsmittel zu entfernen und eine dünne Lipidfilm bei Raumtemperatur bilden. 20 ml PBS und beschallen für 30 min zur liposomalen Nanoteilchen erzeugen, indem ein 3,8-mm Beschallungsspitze und einer Amplitude von 30 W verwendet, wobei eine ausreichende Kühlung auf Eis. </li><li> Zentrifugieren Sie die Liposom-Lösung bei 4.000 × g für 10 min die Aggregate zu entfernen und zu waschen, die Nanopartikel mit PBS unter Verwendung von Zentrifugenfiltration (Molekulargewicht cut-off (MWCO:. 100 kDa) freie Lipide und restliche organische Lösungsmittel zu entfernen, konzentrieren sich die Liposomen, die wird bleiben in der oberen Kammer, und übertragen sie in ein neues Röhrchen. die Liposome können, bevor die nachfolgenden Schritte für bis zu 1 Woche in PBS in einem Kühlschrank gelagert werden. </li><li> Für die Qualitätskontrolle, charakterisieren die Liposomen durch dynamische Lichtstreuung (DLS). Genauer gesagt, mit 950 &amp; mgr; l PBS, 50 &amp; mgr; l Liposomen mischen und dann die Mischung in die Schlichte Küvette übertragen. Setzen Sie die Küvette in den Analysator und messen den PartikelGrößen und deren Größenverteilung. Die Teilchengrößen und deren Größenverteilung (Polydispersitätsindex (PDI)) erwartet 90 zu sein - jeweils 0,2, - 120 nm und 0,1. </li><li> Zur radioaktiven Markierung, mischen die gereinigten Liposomen, entsprechend 2 mg von Lipiden, in PBS bei einem pH - Wert zwischen 6,9 und 7,1 mit 1 mCi 89 Zr-Oxalat bei 37 ° C für 2 h in einem 1,5-ml - Röhrchen, (Gesamtvolumen: ~ 100 &amp; mgr; l). Entfernen Sie die freie, nicht umgesetzten 89 Zr durch Zentrifugenfiltration (MWCO = 100 kDa), ähnlich zu Schritt 1.3 umgesetzt. Waschen des Retentats mit sterilem PBS und verdünne sie auf das gewünschte Volumen. 95% - Die radiochemische Ausbeute sollte 80 sein. VORSICHT! Arbeiten mit radioaktiven Stoffen ist stark reguliert. Die Institute müssen die notwendigen Einrichtungen, Personal Training zertifiziert und bieten werden, und eine strenge Überwachung der Radioaktivität Einsatz. Forscher müssen eine angemessene Ausbildung zu erhalten und persönliche Schutzausrüstung und Dosimetrie Ringe / Abzeichen tragen, wenn die Radioaktivität der Handhabung. </li><liBestimmen&gt; , um die radiochemische Reinheit der radiomarkierten Liposomen durch Grßenausschluß-HPLC Radio, die typischerweise mehr als 98% betragen sollte 10. Die radiochemische Reinheiten von weniger als 95% weisen auf unzureichendes Waschen auf Schritt 1.5. </li><li> Nach radioaktiven Markierung, um die Größe der Nanopartikel durch dynamische Lichtstreuung bestimmen. Die Größe und die PDI werden voraussichtlich innerhalb der gleichen Größenordnung wie die Messungen in Schritt 1.4 10 zu sein. HINWEIS: Wenn radioaktive Proben nicht im Flow Cytometer erlaubt oder Fluoreszenzmikroskop, nicht-radioaktive nat Zr-Oxalat verwendet werden können Liposomen in Schritt 1.5 zu etikettieren. Diese nicht-radioaktiven Liposome haben identische Eigenschaften ihrer radioaktiven Analoga. Eine Beschreibung dieses Verfahrens ist in Figur 2 zur Verfügung gestellt. </li></ol> 2. In - vivo - PET-CT Bildgebung und Biodistribution Dual-markierten Liposome <ol><li> Injizieren etwa 100 &amp; mgr; l doppelt markierte Liposomen with etwa 300 &amp; mgr; Ci von Radioaktivität in gezügelt Melanom - Mäuse (C57BL / 6, weiblich, 10 - 16 Wochen alt) durch ihre Schwanzvenen, bei etwa 10 mCi 89 Zr / kg Körpergewicht. </li><li> Um die Halbwertszeit bestimmen, ziehen Blut aus der Schwanzvene von narkotisierten Tieren unter 2% Isofluran-Sauerstoff enthält, unter Verwendung von 28-G Insulinspritzen. Sammeln Blut (10 bis 20 &amp; mgr; l) in vorgewogenen Röhrchen bei 2 min, 15 min, 1 h, 4 h, 8 h, 24 h und 48 h nach der Injektion. Wiegen Sie das Blut durch den Unterschied bestimmen Radioaktivität Inhalt eines Gammazählers verwendet, und berechnen die Radioaktivität Konzentration als Prozentsatz der injizierten Dosis pro Gramm (% ID / g). HINWEIS: Führen Sie das Verfahren in einem Raum mit einem Anästhesiesystem ausgestattet, Erholungskäfigen, eine Heizung und ein Biohazard Kapuze. Stellen Sie sicher, dass die Tiere vollständig zu erholen und normale Beweglichkeit nach dem Verfahren gewinnen, bevor sie von Erholungskäfigen zu halten Käfige zu übertragen. Haus der tumortragenden Tiere in Räumen für Tiere bezeichnet, verabreicht mitradioaktive Materialien. </li><li> 24 oder 48 h nach der Injektion des Liposomen, Bild die Mäuse in einem Kleintier - microPET-CT - Scanner 10. Platzieren Sie den narkotisierten Tier horizontal auf dem Bauch und halten Sie sie narkotisiert. Verwalten 2% Isofluran-Sauerstoff durch einen Nasenkegel. Bewerben Augensalbe auf seine Augen vor dem Scan zu verhindern, dass sie vor dem Austrocknen. </li><li> Führen Sie eine Ganzkörper-PET statischen Scan-Aufnahme mindestens 50 Millionen übereinstimmend Ereignisse, mit einer Dauer von etwa 15 min. Stellen Sie die Energie und Koinzidenzzeitfenster bei 350-700 keV und 6 ns sind. Danach führen Sie eine 5-min-Computertomographie (CT). Stellen Sie die Röntgenröhre mit einer Spannung von 80 kV und einem Strom von 500 uA; die CT - Abtastung verwendet 120 Rotationsschritte für insgesamt 220 Grad, mit ca. 145 ms pro Rahmen 10. </li><li> Nach dem PET-CT-Scan, opfern sofort die Mäuse durch Ersticken mit Kohlendioxid und bestätigen den Tod von pinching die Pfoten der Tiere. Sobald zervikalen Versetzungen bestätigt, führen. </li><li> Entfernen Sie die Blut in Geweben der Maus durch das erste offene rechte Atrium Schneiden und dann Einspritzen von 20 ml PBS in den linken Ventrikel und anschließend die relevanten Geweben sammeln wie Tumor, Leber, Milz, Lunge, Niere, Muskel und andere 16. </li><li> Wiegen Sie das Gewebe messen ihre Radioaktivität Gehalt durch Gammazählung 8, 9, und berechnen die Radioaktivität Gewebeakkumulation als Prozentsatz der injizierten Dosis pro g (% ID / g). </li></ol> 3. Ex - vivo - Durchflusszytometrie und Immunostaining HINWEIS: Injizieren etwa 100 &amp; mgr; l von fluoreszierenden Liposomen in Melanom-Mäuse durch ihre Schwanzvene in einer Dosis von 0,5 mg Farbstoff pro kg Körpergewicht. Wenn radioaktive Proben werden in dem Durchflusszytometer und Fluoreszenzmikroskop nicht erlaubt, nicht radioaktiven Liposome verwendet werden. <ol><li> Opfern, um die Mäuse 24 Stunden nach der Injektion, wie in Schritt 2.5, und sammeln die Tumoren, die in kaltem PBS gelagert werden müssen. </li><li> Für die Durchflusszytometrie folgendermaßen vor 17: <ol><li> Vorbereiten eines Enzymcocktail aus einer Mischung von gereinigtem Kollagenase I besteht, und II (4 U / ml), Hyaluronidase (60 U / ml) und DNase I (60 U / ml) in Durchflusszytometrie-Puffer (PBS mit 0,5% BSA und 1 mM EDTA). </li><li> Mischungs 100 mg von Tumorgewebe mit 200 &amp; mgr; l Enzymcocktail-Puffer in einem 1,5-ml-Röhrchen und würfeln das Gewebe in kleine Stücke mit einer feinen Schere. Einen weiteren hinzufügen 1,3 ml Enzymcocktail in das Rohr und übertragen seinen Inhalt auf eine 6-Well-Platte. </li><li> Schütteln Sie die 6-Well-Platte auf einem horizontalen Schüttler in einem C-Ofen 37 ° gelegt für 60 min bei 60 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Waschen Sie das Gewebehomogenat mit Durchflusszytometrie-Puffer 3 mal eine Einzelzellsuspension zu erhalten. </li><li> Beflecken die Zellen mit einem Cocktail von Antikörpern, die spezifisch an Biomarkern einschließlich CD45, CD11b, Ly6C, CD11c,CD64, CD3, MHCII und CD31 (1: 200-Verdünnung für alle Antikörper, Klon Informationen werden im Materialkalkulationstabelle zur Verfügung gestellt). Identifizierung relevanten Zelltypen und bestimmen deren mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von DiIC12 (5) -DS in jeder Zellpopulation mit einem entsprechenden Durchflusscytometrie-Analyse-Software. </li></ol></li><li> Für die Immunfärbung, gehen Sie folgendermaßen vor: <ol><li> Legen Sie einen Tumor in eine Kassette mit einer optimalen Schneidmedium (OCT) gefüllt und frieren sie auf Trockeneis. </li><li> Machen Sie 6 um gefrorene Schnitte von Tumorgewebe und legen sie auf die Histologie Glasobjektträger; die Abschnitte sollten die größten Querschnitte des Tumors Abdeckung, die den repräsentativsten Informationen auf dem Gewebe bereitzustellen. </li><li> Stain die Biomarker (zB CD31 für Endothelzellen) von Interesse mit den entsprechenden Antikörpern (zB anti-CD31, Klon MEC13.3). Befestigen Sie die Abschnitte mit Paraformaldehyd; blockieren sie mit Serum der Spezies Ursprung der Sekundärantikörper übereinstimmt; incubaß mit primären Antikörpern für 12 h bei 4 ° C und anschließend mit Sekundärantikörper für 2 h; und schließlich waschen mit PBS und Deckel mit Deckel rutscht. Bild die gefärbten Objektträger mit einem Leica aufrechten konfokalen Mikroskop SP5 13, 16. </li></ol></li></ol>

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The authors have no disclosure to make.

Kritische Schritte im Protokoll: Die hohe Qualität der dual-markierte Liposomen ist der Schlüssel konsistente Ergebnisse über einen langen Zeitraum zu erzeugen. Freie Fluoreszenzfarbstoffe oder 89 Zr - Ionen können völlig unterschiedliche Targeting - Muster erzeugen und müssen vollständig während der Reinigungsschritt entfernt werden. Darüber hinaus deutlich, wenn das Immunsystem experimentellen Krebsnano Leistung beeinflusst, sollte die Verwendung von immunkompetenten Mausm...

Nano verschiebt sich das Paradigma der Krebsbehandlung Entwicklung 1. Inspiriert durch die enorme klinische Auswirkungen früherer Krebs Nanomedizin, wie liposome- und Albumin-basierte nanotherapies 2, 3, haben viele neue Formulierungen wurden in den letzten zehn Jahren hergestellt. Jüngsten Analysen der klinischen Übersetzungs Erfolg dieser Krebsnanomedizin zeigen jedoch, dass nur einige von ihnen sind für die klinische Anwendung 4, 5 zugelassen. Ein großes Hindernis für die klinische Umsetzung von neuen Krebsnanomedizin ist ihre begrenzte Verbesserung des therapeutischen Index im Vergleich mit der direkten Verwaltung der freien therapeutischen Verbindungen 6. Als solche genaue Auswertung der in vivo - Leistung Nanomedizin bei systemischer, Gewebe und zellulärer Ebene in vorklinischen Tiermodellen ist wesentlich für identifdiejenigen y mit optimalen therapeutischen Indizes für zukünftige klinische Übersetzung. Nanomaterialien können in lebenden Tieren , die mit der Positronen - Emissions - Tomographie (PET) Bildgebung für die quantitative Charakterisierung radioaktiv markiert werden, die 7 hervorragende Sensitivität und Reproduzierbarkeit bei allen klinischen Bildgebungsverfahren hat. Zum Beispiel 89 Zr-markierte lange Zirkulationsnanomedizin haben in Mausmodellen für Krebs 8, 9, 10, wie auch in anderen Krankheitsmodellen 11 charakterisiert. Darüber hinaus kann der Bluthalbwertszeit und biologische Verteilung der Nanomedizin extensiv durch Verwendung ex vivo Messungen der Radioaktivität in einzelnen Geweben 8 ausgewertet werden. Daher ermöglicht die radioaktive Markierung für die quantitative Bewertung von Nanomedizin bei einer systemischen und Gewebespiegel. Wichtig ist, dass radiolabeled Nanomedizin allgemein kann nicht auf Einzelzell oder subzellulären Ebenen aufgrund der begrenzten räumlichen Auflösung des radioaktiven Signals analysiert werden. Daher Fluoreszenzmarkierung erweist sich für die Beurteilung von Nanopartikeln mit optischen Abbildungstechniken wie Durchflußzytometrie und Fluoreszenzmikroskopie 12 eine komplementäre Modalität sein. Zu diesem Zweck markiert Nanopartikel mit Radioisotopen und Fluoreszenzmarkierungen kann quantitativ in vivo durch nukleare Bildgebung ausgewertet werden und ex vivo durch Radioaktivität Zählen, und sie können auch ausgiebig auf zellulärer Ebene durch die optische Abbildungs charakterisiert werden. Zuvor haben wir modular Verfahren entwickelt radioaktive und fluoreszierende Markierungen in verschiedene Nanopartikel einzuarbeiten, einschließlich High-Density - Lipoprotein (HDL) 11, Liposome 9, 10, polymere Nanopartikel, Antikörperfragmente und nanoemulsions 10, 13. Diese markierten Nanopartikel wurden zur quantitativen Charakterisierung in relevanten Tiermodellen auf verschiedenen Ebenen erlaubt, die die Optimierung dieser Nanomaterialien für ihre spezifischen Anwendungen geführt. In der aktuellen Studie ist es das Ziel 14 liposomalen Nanopartikel-die meisten etablierten Nano Plattform -wie ein Beispiel zu verwenden , umfassende Verfahren zu demonstrieren , einen Dual-markierte Nanopartikel zu erzeugen , und um es gründlich zu charakterisieren in einem klassischen syngenen Melanom B16-F10 - Maus - Modell 15 . Aus den Ergebnissen können wir diese Nanopartikel Charakterisierung Ansatz überzeugt, angepasst werden kann andere Krebsnanomedizin in relevanten Mausmodellen zu bewerten.

<table><tbody><tr><td>DPPC</td><td>Avantilipids</td><td>850355</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG2000</td><td>Avantilipids</td><td>880120P</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-DFO</td><td>Home made</td><td>110634</td><td>Perez-Medina &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, JNM, 2014</td></tr><tr><td>DiIC12[5]-DS</td><td>AAT Bioquest</td><td>22051</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal filter</td><td>Vivaproducts</td><td>VS2061</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator</td><td>Buchi</td><td>R-100</td><td></td></tr><tr><td>Radio-HPLC</td><td>Shimadzu HPLC with 2 LC-10AT pumps</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;89&lt;/sup&gt;Zr-oxalate</td><td>MSKCC</td><td>Synthesized in house</td><td>TR19/9 variable beam cyclotron (Ebco Industries Inc.)</td></tr><tr><td>Micro PET-CT</td><td>Siemens</td><td>Inveon Micro-PET/CT</td><td></td></tr><tr><td>Gamma counter</td><td>PerkinElmer</td><td>2470-0150</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometry</td><td>BD Biosciences</td><td>Fortessa</td><td>Any multi-parametric flow cytometry analyzers would suffice</td></tr><tr><td>C57BL/6 mice</td><td>Jackson Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B16-YFP melanoma cells</td><td>Home made</td><td>N/A</td><td>Salmon &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Immunity, 2016</td></tr><tr><td>Ly6C (clone HK1.4)--APC-Cy7</td><td>128025</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>MHCII (M5/114/152)--APC</td><td>107613</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD45 (30-F11)--BV510</td><td>103137</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD64 (X54-5/7.1)--PE-Cy7</td><td>139313</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD11b (M1/70)--BV605</td><td>101237</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD3 (17A2)--BV711</td><td>100241</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (13.3)--PE</td><td>561073</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD11c (M418)--PerCP-Cy5.5</td><td>117327</td><td>BD Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (13.3) no fluorophore</td><td>550274</td><td>BD Biosciences</td><td></td></tr></tbody></table>

a comprehensive procedure to evaluate the in vivo performance of cancer nanomedicines

Inspiriert durch den Erfolg der bisherigen Krebsnanomedizin in der Klinik haben die Forscher eine große Anzahl von neuen Formulierungen in den letzten zehn Jahren generiert. Jedoch nur eine geringe Anzahl von Nanomedizin wurden für die klinische Verwendung zugelassen, während die Mehrzahl der Nanomedizin in der klinischen Entwicklung enttäuschenden Ergebnissen geführt haben. Ein wesentliches Hindernis für die erfolgreiche klinische Übersetzung des neuen Krebsnanomedizin ist der Mangel an einem genauen Verständnis ihrer in vivo Leistung. Dieser Artikel enthält ein rigoroses Verfahren das in vivo Verhalten der Nanomedizin in tumortragenden Mäusen bei einer systemischen, Gewebe, single-cell und subzellulären Ebenen über die Integration der Positronen - Emissions - Tomographie-Computertomographie (PET-CT), Radioaktivität Quantifizierungsverfahren zur Charakterisierung fließen, Zytometrie und Fluoreszenzmikroskopie. Mit diesem Ansatz können die Forscher auswerten genau neuartigen nanoskaligen Formulierungen in relevanten Mausmodellen der cancer. Diese Protokolle können die Fähigkeit haben, die vielversprechendsten Krebs Nanomedizin mit hohem translationalen Potenzial zu identifizieren oder bei der Optimierung von Krebs Nanomedizin für die zukünftige Übersetzung zu helfen.

1 zeigt einen Überblick über das Verfahren. Figur 2 zeigt den schematischen Syntheseverfahren der dual-markierte Liposomen in Schritt 1 beschrieben 10. Abbildung 3 zeigt eine repräsentative PET-CT - Bild (Abbildung 3a), Radioaktivität Quantifizierung von PET - Bildgebung (Abbildung 3b), Bluthalbwertszeit (Abbildung 3c) und biologische Verteilung (Abbil...

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A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der<em&gt; In Vivo</em&gt; Performance von Krebs Nanomedizin

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

8.8K Aufrufe.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

Serie: A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. Photosensitizers selectively accumulate in tumor tissue and lead to tumor cell death in the presence of oxygen and the proper wavelength of light.
To increase the therapeutic effect of PDT, we developed both photosensitizer- and anticancer agent-loaded lung cancer-targeted nanoparticles. Both enhanced permeability and retention (EPR) effect-based passive targeting and hyaluronic-acid-CD44 interaction-based active targeting were applied. CD44 is a well-known hyaluronic acid receptor that is often introduced as a biomarker of non-small cell lung cancer. 
In addition, a combination of PDT and chemotherapy is adopted in the present study. This combination concept may increase anticancer therapeutic effects and reduce adverse reactions. 
We chose hypocrellin B (HB) as a novel photosensitizer in this study. It has been reported that HB causes higher anticancer efficacy of PDT compared to hematoporphyrin derivatives1. Paclitaxel was selected as the anticancer drug since it has proven to be a potential treatment for lung cancer2. 
The antitumor efficacies of photosensitizer (HB) solution, photosensitizer encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles (HB-NPs), and both photosensitizer- and anticancer agent (paclitaxel)-encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles (HB-P-NPs) after PDT were compared both in vitro and in vivo. The in vitro phototoxicity in A549 (human lung adenocarcinoma) cells and the in vivo antitumor efficacy in A549 tumor-bearing mice were evaluated.
The HB-P-NP treatment group showed the most effective anticancer effect after PDT. In conclusion, the HB-P-NPs prepared in the present study represent a potential and novel photosensitizer delivery system in treating lung cancer with PDT.

Photodynamic therapy (PDT) is an alternative choice for lung cancer treatment. To increase the therapeutic effect of PDT, lung cancer-targeted nanoparticles combined with chemotherapy were developed. Both in vitro and in vivo anticancer efficacies of PDT with prepared nanoparticles were evaluated.

Anti-Krebs-Wirksamkeit der Photodynamischen Therapie mit Lungenkrebs-Targeted-Nanopartikel

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

Forschung

Krebsforschung

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its therapeutic benefit. Nanoparticle-based drug combination has been shown to mitigate the problems encountered by free drug combination therapy. Our previous studies have shown that the combination of two anticancer drugs, doxorubicin (DOX) and mitomycin C (MMC), produced a synergistic effect against both murine and human breast cancer cells in vitro. DOX and MMC co-loaded polymer-lipid hybrid nanoparticles (DMPLN) bypassed various efflux transporter pumps that confer multidrug resistance and demonstrated enhanced efficacy in breast tumor models. Compared to conventional solution forms, such superior efficacy of DMPLN was attributed to the synchronized pharmacokinetics of DOX and MMC and increased intracellular drug bioavailability within tumor cells enabled by the nanocarrier PLN. 
To evaluate the pharmacokinetics and bio-distribution of co-administered DOX and MMC in both free solution and nanoparticle forms, a simple and efficient multi-drug analysis method using reverse-phase high performance liquid chromatography (HPLC) was developed. In contrast to previously reported methods that analyzed DOX or MMC individually in the plasma, this new HPLC method is able to simultaneously quantitate DOX, MMC and a major cardio-toxic DOX metabolite, doxorubicinol (DOXol), in various biological matrices (e.g., whole blood, breast tumor, and heart). A dual fluorescent and ultraviolet absorbent probe 4-methylumbelliferone (4-MU) was used as an internal standard (I.S.) for one-step detection of multiple drug analysis with different detection wavelengths. This method was successfully applied to determine the concentrations of DOX and MMC delivered by both nanoparticle and solution approaches in whole blood and various tissues in an orthotopic breast tumor murine model. The analytical method presented is a useful tool for pre-clinical analysis of nanoparticle-based delivery of drug combinations.

This protocol describes an efficient and convenient analytical process of sample extraction and simultaneous determination of multiple drugs, doxorubicin (DOX), mitomycin C (MMC) and a cardio-toxic DOX metabolite, doxorubicinol (DOXol), in the biological samples from a preclinical breast tumor model treated with nanoparticle formulations of synergistic drug combination.

Probengewinnung und gleichzeitige chromatographische Quantifizierung von Doxorubicin und Mitomycin C nach Kombination Medikamentenabgabe in Nanopartikel zur Tumor-tragenden Mäusen

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its ...

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Evaluation von Nanopartikel-Aufnahme in Tumoren in Echtzeit über Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Medizin

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Viral Nanopartikel für<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Biotechnik

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory cytokine interleukin-1 alpha (IL-1&#945;) has been evaluated as an anticancer agent in several preclinical and clinical studies. However, dose-limiting toxicities, including flu-like symptoms and hypotension, have dampened the enthusiasm for this therapeutic strategy. Polyanhydride nanoparticle (NP)-based delivery of IL-1&#945; would represent an effective approach in this context since this may allow for a slow and controlled release of IL-1&#945; systemically while reducing toxic side effects. Here an analysis of the antitumor activity of IL-1&#945;-loaded polyanhydride NPs in a head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) syngeneic mouse model is described. Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells were injected subcutaneously into the right flank of C57BL/6J mice. Once tumors reached 3-4 mm in any direction, a 1.5% IL-1a - loaded 20:80 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane:1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPTEG: CPH) nanoparticle (IL-1&#945;-NP) formulation was administered to mice intraperitoneally. Tumor size and body weight were continuously measured until tumor size or weight loss reached euthanasia criteria. Blood samples were taken to evaluate antitumor immune responses by submandibular venipuncture, and inflammatory cytokines were measured through cytokine multiplex assays. Tumor and inguinal lymph nodes were resected and homogenized into a single-cell suspension to analyze various immune cells through multicolor flow cytometry. These standard methods will allow investigators to study the antitumor immune response and potential mechanism of immunostimulatory NPs and other immunotherapy agents for cancer treatment.

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

A standard protocol is described to study the antitumor activity and associated toxicity of IL-1&#945; in a syngeneic mouse model of HNSCC.

Bewertung der in vivo Antitumoraktivität von Polyanhydrid IL-1α Nanopartikeln

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

Bewertung der Wirksamkeit der Krebsmedikament Sensibilisierung<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.

Validierung der Nanobody und Antikörper-basierte<em&gt; In-vivo-</em&gt; Tumorxenotransplantat NIRF-Bildgebung Experimente bei Mäusen verwenden<em&gt; Ex vivo</em&gt; Durchflusszytometrie und Mikroskopie

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

<meta charset="utf8"></head><body>Nanodrug, das auf onkogene miRNA-10b zur Behandlung von metastasierendem Brustkrebs abzielt

Monitoring of Nanodrug Accumulation in Murine Breast Cancer Metastases

Metastatic breast cancer is a devastating disease with very limited therapeutic options, calling for new therapeutic strategies. Oncogenic miRNAs have been shown to be associated with the metastatic potential of breast cancer and are implicated in tumor cell migration, invasion, and viability. However, it can be difficult to deliver an inhibitory RNA molecule to the tissue of interest. To overcome this challenge and deliver active antisense oligonucleotides to tumors, we utilized magnetic iron oxide nanoparticles as a delivery platform. These nanoparticles target tissues with increased vascular permeability, such as sites of inflammation or cancer. Delivery of these nanoparticles can be monitored in vivo by magnetic resonance imaging (MRI) due to their magnetic properties. Translation of this therapeutic approach into the clinic will be more accessible because of its compatibility with this relevant imaging modality. They can also be labeled with other imaging reporters such as a Cy5.5 near-infrared optical dye for correlative optical imaging and fluorescence microscopy. Here, we demonstrate that nanoparticles labeled with Cy5.5 and conjugated to therapeutic oligomers targeting oncogenic miRNA-10b (termed MN-anti-miR10b, or &#34;nanodrug&#34;) administered intravenously accumulate in metastatic sites, opening a possibility for therapeutic intervention of metastatic breast cancer.

<meta charset="utf8"></head><body>Überwachung der Akkumulation von Nanomedikamenten in Brustkrebsmetastasen bei Mäusen

Here, we describe the protocol for in vivo delivery of magnetic iron oxide nanoparticles carrying RNA oligomers to metastatic breast cancer in animal models, providing a clinically viable approach for the therapeutic silencing of oncogenic nucleic acids.

Überwachung der Akkumulation von Nanomedikamenten in Brustkrebsmetastasen bei Mäusen

Metastatic breast cancer is a devastating disease with very limited therapeutic options, calling for new therapeutic strategies. Oncogenic miRNAs have ...

Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der

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Anti-Krebs-Wirksamkeit der Photodynamischen Therapie mit Lungenkrebs-Targeted-Nanopartikel

Probengewinnung und gleichzeitige chromatographische Quantifizierung von Doxorubicin und Mitomycin C nach Kombination Medikamentenabgabe in Nanopartikel zur Tumor-tragenden Mäusen

Evaluation von Nanopartikel-Aufnahme in Tumoren in Echtzeit über Intravital Imaging

Viral Nanopartikel für

Bewertung der in vivo Antitumoraktivität von Polyanhydrid IL-1α Nanopartikeln

Bewertung der Wirksamkeit der Krebsmedikament Sensibilisierung

Validierung der Nanobody und Antikörper-basierte

Überwachung der Akkumulation von Nanomedikamenten in Brustkrebsmetastasen bei Mäusen

Überwachung der Akkumulation von Nanomedikamenten in Brustkrebsmetastasen bei Mäusen

Überwachung der Akkumulation von Nanomedikamenten in Brustkrebsmetastasen bei Mäusen