The authors would like to acknowledge the funding received from the American Heart Association (SDG12SDG9130039).

1. 비계 리포좀의 제조 참고 : 이상적으로, 초기 실험은 DOPC (1,2-dioleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 또는 PC)와 DGS-NTA (니켈 2 +) (1,2-dioleoyl로 구성된 비교적 간단하고 특색 발판을 (사용해야합니다 - SN -glycero -3 - [(N은 - (5- 아미노 -1- 카르복시) 이미 노디 아세트산) 숙시 닐]. (니켈 염)) 건축 실험 오프 지질 전하, 유연성 및 굴곡 개별 요소로서 도입 될 수있다 잠재적으로 막 근위 상호 작용을 변경한다. 이러한 변경 또는 포스파티딜 리핀 (CL), 포스파티딜 에탄올 아민 (DOPE 또는 PE) 또는 락토 (β) 세라미드 지질 성분을 포함한 특정의 한정된 양의 첨가에 의해 달성 될 수있다. <ol><li> 깨끗한 유리 시험관에 클로로포름 지질 결합. 얇은 지질막을 형성하도록 튜브를 회전시키면서 건조 질소 가스에 용제를 증발시켰다. centrifuga와 잔류 용매를 제거37 ° C에서 1 시간 동안 L 증발기. 참고 : 다양한 리포좀 제제는 프로토콜에 사용되는 아래에 설명 : 비계 리포좀 (3.3 몰 % DGS-NTA (니켈 2 +) / 96.7 몰 %의 DOPC), 카디오 리핀과 비계 리포좀 (3.3 몰 % DGS-NTA 니켈 (Ni 2+) / 10 몰 %의 리핀 / 86.7 몰 %의 DOPC), 카디오 리핀 유연한 골격 리포솜 (3.3 몰 % DGS-NTA (니켈 2+) / 10 몰 %의 리핀 / 35 몰 %의 DOPE / 51.7 몰 %의 DOPC) 및 농축 된 지지체 리포좀 (10 몰 % DGS-NTA (니켈 2+) / 35 몰 % DOPE / 40 몰 %의 DOPC / 15 몰 %의 리핀). </li><li> 37 ° C로 예열 완충액 A (25 mM의 HEPES (4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산) KOH 7.5로 조정 한 150 mM의 KCl을, 산도)를 추가, 최종 지질 농도는 1이되도록 - 2 mm이다. 완전히 지질 혼합물 (도 1a)에 재현 탁하는 비정기 텍싱 37 ° C에서 30 분 동안 인큐베이션. </li><li> 완전히 냉동 (roug 때까지 액체 질소에 튜브, 플라스틱 시험관에 이동 배치hly 30 초), 완전히 해동 (약 1까지 37 ° C의 물을 욕조에 장소 - 2 분). 4 동결 해동 사이클 (그림 1b)의 총 반복합니다. </li><li> 4 필터 지원 및 버퍼의 폴리 카보네이트 필터를 몸을 담글 및 제조업체 지침에 따라 압출기를 조립하여 지질 압출기를 준비합니다. 필터를 통해 21 회 지질 용액을 돌출. 균일 한 크기 분포 (그림 1C)을 보장하기 위해 부드러운, 일정한 압력을 사용합니다. 주 :이 프로토콜에 기재된 모든 실험의 경우, 1.0 ㎛의 폴리 카보네이트 필터를 압출 하였다. 음이온 성 지질로 Drp1 개입 50 nm 내지 400 nm의 12 이상 13 범위 리포솜 다양한 직경으로 관찰 할 수있다. 따라서, 1 ㎛의 필터 사이즈 모두는 GTPase 활성 및 전자 현미경에 적합하도록 선택되었다. 다른 리포좀 직경은 원하는 경우 거대한 단일 층 소포 14, 15 (GUVs) 또는 작은 unilamell의 준비아칸소 사용할 수 있습니다 (16) (포드 SUV)을 소포. 동적 광산란 리포좀 크기 이질성 (13)을 평가하기 위해 사용될 수있다. </li><li> 4 ° C에서 압출 리포좀을 저장하고 3 후 폐기 - 5 라. </li></ol> 단백질 바인딩 분석을위한 발판 리포좀의 2. <ol><li> 샘플 준비 <ol><li> 적어도 15 분 동안, 비계 리포좀 (50 μM 최종 40 몰 %의 PC / 35 몰 %의 PE / 15 몰 % CL / 10 몰 % DGS-NTA 니켈 (Ni 2+))와 (5 μm의 최종) MffΔTM을 그의 - 태그 품어 버퍼 A + BME에 실온에서 (25 mM의 HEPES, 150 밀리미터의 KCl, 10 MM의 β-머 캅토 에탄올 (BME)는, pH는 KOH 7.5로 조정). MFF없는 제어를 위해, NTA 니켈 (Ni 2+)에 노출 된 자신의 태그가 제어 결합하는 (예 : GFP)을 단백질과 방패 리포좀을 품어. 주 :이 이전의 연구에서 설명 된 바와 같이 MffΔTM은 발현시키고 정제 하였다. GFP를 유사한 방식으로 정제되었지만, 이온 교환 공정을 생략 하였다. BME이 experimen 필요했다TS Drp1는 활동 및 조립 특성을 변경할 수 있습니다 산화에 민감하기 때문이다. </li><li> Drp1 (최종 2 μM)를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 배양. 주 :이 이전의 연구에서 설명 된 바와 같이 Drp1은 발현시키고 정제 하였다. Drp1과 부화 후, 막 변형을 구속 염기의 효과가 2 밀리미터의 MgCl 2, 중 1 ㎜ GTP, 1 mM의 GMP-PCP, 또는 버퍼 A + BME를 하나의 추가 시간을 배양하여 조사 할 수있다. </li></ol></li><li> 네거티브 얼룩 투과 전자 현미경 (EM) 분석 <ol><li> 전사 5 실험실 필름의 시트 샘플 μL, 시료에 카본 코팅 구리 / Rh를 그리드 누워. 샘플의 그리드 1 분을 품어 필터 종이에 여분의 액체를 멀리 오 점, 2 %의 우라 닐 아세테이트 한 방울로 전송합니다. 1 분을 품어 필터 종이에 여분의 얼룩을 지워, 및 그리드 상자로 전송할 수 있습니다. 진공 O / N에서 스토어 전체 탈수을 보장합니다. </li><li> 투과형 전자 microsc를 사용하여 이미지 샘플18,500에서 OPE - 30,000X 배율은 단백질과 리포좀 모폴로지 (17)의 미세 구조 변화를 관찰합니다. 참고 : 미세 구조의 변화가 그러한 ImageJ에 (13), 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 정량화 할 수있다 (http://imagej.nih.gov/ij/). 단백질은 장식 벗은 지질 템플릿과 비교하여 측정 할 수있다. 또한, 관형 부분의 직경은 어셈블리 (13)의 최 외곽 부분에서 측정 할 수있다. 보다 상세한 분석은 극저온 전자 현미경 (17)을 사용하여 수행 될 수있다. 이 방법은 코팅 샘플의 중금속 오염을 사용하지 않고 용매 이미지 천연 단백질 지질 어셈블리에 사용될 수있다. 이와 같이, 기본 형태의 지질의 변화를 포함한 음극 얼룩 명백하지 상세한 구조적 특징은 검사하고 정량화 할 수있다. </li></ol></li></ol> 효소 분석을위한 발판 리포좀의 3. 참고 : 로리를통계는 GTPase 분석 (18)는 GTP 가수 분해를 통해 인산 해방을 측정하는 데 사용되었다. 대체는 GTPase 세이 19 사용할 수 있으며, 필요에 따라 구현 될 수있다. <ol><li> (150 μM 최종) 비계 리포좀 버퍼 A + BME (부피 = 30 μL)에 실온에서 15 분간와 그의-태그 MffΔTM (MFF), Fis1ΔTM (Fis1), 또는 GFP가 (모두 5 μm의 최종) 품어. Drp1 (500 nM의 최종)를 추가하고 RT (부피 = 80 μL)에 추가로 15 분을 품어. 참고 Fis1 MFF는 2와 유사한 방식으로 정제되었지만, 이온 교환 크로마토 그래피 단계는 생략 하였다. 그 태깅 된 GFP의 목적은 NTA (니켈 2+) headgroups 실드와 다른 단백질과의 비특이적 상호 작용의 전하를 방지하기위한 것이다. 효과는 GFP의 부재하에 관찰되지 않으면,이 제어가 필요하지 않을 수도있다. (관심있는 단백질에 필적하는 크기의) 대안 차단 단백질도 사용할 수 있지만, GFP는 SCAF와의 상호 작용의 직접적인 시각화를 허용리포좀을 접어주십시오. </li><li> 열 순환기로 전송 튜브는 37 ° C로 설정하고, GTP와의 MgCl 2를 첨가하여 반응을 개시 (각각 1 ㎜, 2 mM의 결승전을, 부피 = 120 μL를). </li><li> 목적하는 시점 (즉, T = 5, 10, 20, 40, 60 분)에서의 Mg 킬레이트 2+하고 반응을 정지 0.5 M EDTA 5 μL를 포함하는 미세 적정 플레이트의 웰에 반응 20 μL 옮긴다. </li><li> 결과를 보정 버퍼 A + BME에서 KH 2 PO 4를 희석하여 인산 표준 세트를 준비합니다. 표준 유용한 집합은 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5, 0 μM이다. 0.5 M EDTA의 5 μL를 포함하는 우물에 각 20 μL를 추가합니다. </li><li> 각 웰에 150 μL 말라카이트 그린 시약 (1 mM의 말라카이트 그린 카비 놀, 10 mM의 몰리브덴 산 암모늄 수화물, 1 N 염산)을 추가하고 OD를 첨가 한 후 650 5 분을 참조하십시오. 주 : GTP는 산 불안정성이며, 말라카이트 그린 시약의 존재 하에서 가수 분해된다. 그 t 확인공작석 시약을 추가하고 읽기 사이에 그는 시간이 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 일정하다. </li><li> 인산염 농도의 함수로서 표준 OD 650 플로팅하여 표준 곡선을 생성한다. 샘플의 OD 650 인산염 농도 사이의 관계를 결정하기 위해 선형 회귀 분석을 사용한다. </li><li> 선형 회귀를 이용 μM 인산염 단백질 반응 시료의 OD 650으로 변환. 시간의 함수로서 인산 농도를 플로팅하여 각각의 반응 액에 대한 포스페이트 생성 속도를 결정하고 Drp1 농도 (0.5 μM)에 의해 속도를 나누어 고양이 k로 변환한다. 참고 : 초기 선형 속도 포스페이트 생성 속도를 결정하기 위해 사용되어야하고, (3) 데이터 포인트의 최소 사용되어야한다. 반응 속도는 처음 세 데이터 포인트가없는 선형 충분히 빠른 경우 사인 (즉, 선형 피팅의 R2는 0.9 미만이다)최소 3 시간 포인트 ificantly 짧은 시간 과정은 수행해야합니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜은 통합 막 단백질을 포함하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사하는 방법을 제공한다. 모듈 리포솜 지지체를 이용하여, 연구자들은 지질 근위 환경에서 하나 이상의 단백질의 활성을 사정 할 수있다. 26 - 이전 연구 세포막 수용체 (24)의 효소를위한 동일한 방법을 증명하고있다. 우리는 지질 보조 인자를 포함하고 미토콘드리아 분열 기계의 mechanoenzymatic 핵심?...

막 인접 단백질 - 단백질 상호 작용을 공부 인해 1 포함 된 통합 막 단백질의 기본 환경을 recapitulating 어려움에 도전적인 노력이다. 이 세제 용해 필요성 및 테오 단백질의 방향 불일치에 기인한다. 이러한 문제를 방지하기 위해, 우리는 통합 막 단백질의 가용성 도메인 그의 태그 융합 단백질로서 발현된다 전략을 채용 한 이러한 가용성 단편 지질에 NTA (니켈 2+) headgroups와의 상호 작용을 통해 지지체 리포솜에 고정되고 표면. 이러한 발판 사용 근위 지질 단백질 상호 작용은 지질 및 단백질 조성의 범위를 조사 할 수있다. 우리는 효과적으로 홍보를 조절하는 지질 상호 작용을 미토콘드리아 분열 복합체의 조립을 지배하는 중요한 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사하고 검토하려면이 방법을 적용했습니다ocess 2. 미토콘드리아 분열 동안 Dynamin 관련 단백질 1 (Drp1) 3이라고하는 보존 막 리모델링 단백질은 에너지 항상성, 세포 사멸 신호, 및 기타 여러 가지를 조절 세포 신호에 응답하여 상기 외부 미토콘드리아 막 (OMM)의 표면에 채용되고 필수적인 미토콘드리아 처리합니다. 8 -이 큰, 세포질는 GTPase는 통합 OMM 단백질 (4)과의 상호 작용을 통해 미토콘드리아의 표면에 채용된다. 그러한 단백질의 역할 미토콘드리아 분열 인자 (MFF)에 의한 시험 관내 Drp1와 겉보기 약한 상호 작용을 해명 어려웠다. 그럼에도 불구하고, 유전자 연구는 명확하게 MFF 성공 미토콘드리아 분열 7,8에 필수적임을 증명하고있다. 이 논문에 기재된 방법은 Drp1 MFF-상호 작용을 촉진 동시 지질 상호 작용을 도입함으로써 기존의 단점을 극복 할 수 있었다. 전반적으로,이 소설 분석 revea미토콘드리아 분열 복합체의 어셈블리를 안내 근본적인 상호 작용을지도하고 필수적인 분자 기계의 지속적인 구조 및 기능 연구에 새로운 단계를 제공했다. 지금까지 Drp1과 MFF 사이의 상호 작용의 검사가 MFF (9)의 고유의 유연성에 의해 복잡하게되었습니다 Drp1의 이질성은 2,10을 중합체 및 어려움 정화 및 손상되지 횡단 도메인 (11)와 함께 전체 길이 MFF를 재구성. 우리는 막 횡단 도메인 (MffΔTM-그의 6) 부족 그의-태그 MFF를 재구성 NTA 니켈 (Ni 2+) 비계 리포좀을 사용하여 이러한 문제를 해결. E의 과발현 때 MffΔTM 매우 수용성이기 때문에이 전략은 유리했다. 콜라이,이 절연 단백질 용이 골격 리포좀에 재구성 하였다. 이러한 지질 템플릿에 닿는 경우, MFF는 멤브레인의 표면 상에 동일한 외측으로 향하는 방향을 가정한다.이러한 장점 등 리핀 등 미토콘드리아 지질 이외에, 멤브레인 (11) MFF 폴딩 및 결합을 안정화 하였다. 카디오 리핀은이 무질서 지역을 안정시키고 분열 기계의 조립을 용이하게 할 수 Drp1 2,12의 가변 도메인과 상호 작용한다. 이 방법은 강력한 막 - 근위 단백질 상호 작용을 평가하고자 미래 연구에 널리 적용 할 수있다. 추가의 테 더링 / 친 화성 상호 작용을 사용하여,이 막 재구성 연구 정교한 세포 내 멤브레인의 표면에서 발견 된 추가 복잡도를 모방하도록 향상 될 수있다. 동시에, 지질 조성물을보다 정확하게 이러한 고분자 복합체의 기본 환경을 모방하도록 수정 될 수있다. 요약하면, 이러한 방법은 중요한 세포 PROC시에 막 모폴로지 형성에 상대적 기여도 단백질과 지질을 검사하는 방법을 제공한다esses.

<table><tbody><tr><td>Phosphatidylcholine (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylethanolamine (DOPE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>DGS-NTA(Ni&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Heart Cardiolipin (CL)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840012</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Acros Organics</td><td>268320010</td><td></td></tr><tr><td>Liposome Extruder</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>Cu/Rh Negative Stain Grids</td><td>Ted Pella</td><td>79712</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge Tube</td><td>Beckman</td><td>357448</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-1012</td><td></td></tr><tr><td>GMP-PCP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3509</td><td></td></tr><tr><td>Microtiter Plate strips</td><td>Thermo Scientific</td><td>469949</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Acros Organics</td><td>40993-0010</td><td></td></tr><tr><td>Instant Blue Coomassie Dye</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P330</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Acros Organics</td><td>223211000</td><td></td></tr><tr><td>4 - 20% SDS-PAGE Gel</td><td>Bio Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Loading Dye</td><td>Bio Rad</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S</td><td></td></tr><tr><td>Malachite Green Carbinol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>229105</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7302</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory Film</td><td>Parafilm</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>Polysciences</td><td>21447</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai T12 100 keV Microscope</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TLA-55 Rotor</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated CentriVap Concentrator</td><td>Labconico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Pro Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VersaMax Microplate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

using scaffold liposomes to reconstitute lipid-proximal protein-protein interactions in vitro

시험관 내에서 세포막 단백질 연구가 많이 소수성 막 횡단 도메인의 존재에 의해 복잡하게된다. 또한 이러한 연구를 복잡하게, 리포좀에 세제 - 가용화 된 막 단백질의 reincorporation 단백질 토폴로지를 적용하는 것은 불가능 확률 과정이다. 본 논문은 리포좀 기반의 발판을 이용하여 이러한 도전적인 기술에 대한 대체 방법을 제공합니다. 단백질의 용해성은 경막 도메인의 결실에 의해 강화되며, 이러한 아미노산 같은 그의 태그 같은 더링 잔기로 대체된다. 이것은 테더가 리포솜의 표면에 균일 한 단백질 토폴로지를 적용 (니트릴 로트리 아세트산 그의 태그 된 단백질 (NTA (니켈 2+))에 의해 조정 니켈 2+) 앵커링 그룹과 상호 작용한다. 필수 막 단백질 미토콘드리아 분열 인자 (MFF)와 Dynamin 관련 단백질 1 (Drp1) 사이의 상호 작용이 INVE이었다 상기 예가 제시이 골격 리포솜 법을 이용 stigated. 이 작품에서 우리는 효율적으로는 GTPase 활동을 자극 리포좀의 표면에 용해 Drp1을 모집 MFF의 능력을 증명하고있다. 또한 Drp1 특정 지질의 존재 MFF 장식 지질 템플릿 관 모양 할 수 있었다. 이 예는 구조 및 기능 분석을 사용하여 골격 리포좀의 효과를 보여주고 Drp1 활성을 조절하는데 MFF의 역할을 강조한다.

MFF Drp1과의 상호 작용은 미토콘드리아 분열에 중요한 것으로 입증되었지만, 이러한 상호 작용은 시험 관내에서 요점을 되풀이하기 어려웠다. 우리의 목표는 더 나은 Drp1과 MFF 상호 작용에있어서, 상기 세포 환경을 에뮬레이션하는 것이 었습니다. 이를 위해 리포좀 NTA (니켈 2+) headgroups의 제한 농도를 함유하는 전술 한 바와 같이 지질 막을 재수 화하여 제조 ...

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Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

using-scaffold-liposomes-to-reconstitute-lipid-proximal-protein

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

8.8K 조회수.  Case Western Reserve University School of Medicine. This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment. 

비디오: Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers are less compatible with detergents.
Here we describe a strategy for bypassing this fundamental limitation using fusogenic oppositely charged liposomes bearing a membrane protein of interest. Fusion between such vesicles occurs within 5 min in a low ionic strength buffer. Positively charged fusogenic liposomes can be used as simple shuttle vectors for detergent-free delivery of membrane proteins into biomimetic target lipid bilayers, which are negatively charged. We also show how to reconstitute membrane proteins into fusogenic proteoliposomes with a fast 30-min protocol.
Combining these two approaches, we demonstrate a fast assembly of an electron transport chain consisting of two membrane proteins from E. coli, a primary proton pump bo3-oxidase and F1Fo ATP synthase, in membranes of vesicles of various sizes, ranging from 0.1 to &#62;10 microns, as well as ATP production by this chain.

Here we present two ultrafast protocols for reconstitution of membrane proteins into fusogenic proteoliposomes, and fusion of such proteoliposomes with target lipid bilayers for detergent-free delivery of these membrane proteins into the postfusion bilayer. The combination of these approaches enables fast and easily controlled assembly of complex multi-component membrane systems.

세제 없는 보완 청구 Proteoliposomes Fusogenic를 사용 하 여 지질 Bilayers에 막 단백질의 초고속 재구성.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

연구

생화학

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum (ER) resident proteins implicated in homotypic fusion of the ER. We detail here a method for purifying a glutathione S-transferase (GST) and poly-histidine tagged Drosophila atlastin by two rounds of affinity chromatography. Studying fusion reactions in vitro requires purified fusion proteins to be inserted into a lipid bilayer. Liposomes are ideal model membranes, as lipid composition and size may be adjusted. To this end, we describe a reconstitution method by detergent removal for Drosophila atlastin into preformed liposomes. While several reconstitution methods are available, reconstitution by detergent removal has several advantages that make it suitable for atlastins and other similar proteins. The advantage of this method includes a high reconstitution yield and correct orientation of the reconstituted protein. This method can be extended to other membrane proteins and for other applications that require proteoliposomes. Additionally, we describe a FRET based lipid mixing assay of proteoliposomes used as a measurement of membrane fusion.

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biological membrane fusion is catalyzed by specialized fusion proteins. Measuring the fusogenic properties of proteins can be achieved by lipid mixing assays. We present a method for purifying recombinant Drosophila atlastin, a protein that mediates homotypic fusion of the ER, reconstituting it to preformed liposomes, and testing for fusion capacity.

지질 혼합 애신을 위한 리포솜으로 재조합 초파리 아틀라스틴의 세제 지원 재구성

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial membrane is a challenging environment to distinguish regulatory factors. Experimental control of protein and lipid components can help answer specific questions of regulation. Yet, quantitative manipulation of these factors is challenging in cellular assays. To investigate the molecular mechanism of mitochondria inner-membrane fusion, we introduced an in vitro reconstitution platform that mimics the lipid environment of the mitochondrial inner-membrane. Here we describe detailed steps for preparing lipid bilayers and reconstituting mitochondrial membrane proteins. The platform allowed analysis of intermediates in mitochondrial inner-membrane fusion, and the kinetics for individual transitions, in a quantitative manner. This protocol describes the fabrication of bilayers with asymmetric lipid composition and describes general considerations for reconstituting transmembrane proteins into a cushioned bilayer. The method may be applied to study other membrane systems.

Mitochondrial fusion is an important homeostatic reaction underlying mitochondrial dynamics. Described here is an in vitro reconstitution system to study mitochondrial inner-membrane fusion that can resolve membrane tethering, docking, hemifusion, and pore opening. The versatility of this approach in exploring cell membrane systems is discussed.

미토콘드리아 멤브레인 역학 을 재구성하기위한 모델 멤브레인 플랫폼

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug discovery because they are the targets of more than half of all drugs. An obstacle to conducting biochemical, biophysical, and structural studies of membrane proteins as well as antibody development has been the difficulty in producing large amounts of high-quality membrane protein with correct conformation and activity. Here we describe a &#8220;bilayer-dialysis method&#8221; using a wheat germ cell-free system, liposomes, and dialysis cups to efficiently synthesize membrane proteins and prepare purified proteoliposomes in a short time with a high success rate. Membrane proteins can be produced as much as in several milligrams, such as GPCRs, ion channels, transporters, and tetraspanins. This cell-free method contributes to reducing the time, cost and effort for preparing high-quality proteoliposomes, and provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

This protocol describes an efficient cell-free method for production of high-quality proteoliposome by bilayer-dialysis method using wheat cell-free system and liposomes. This method provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

막 단백질을 표적으로 하는 기능 분석 및 항체 개발을 위한 프로테올리포좀의 무세포 생산

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component in coordinating shape changes like cytokinesis, polarized growth, and migration. Septins are filament-forming proteins that assemble to form diverse higher-order structures and, in many cases, are found in different areas of the plasma membrane, most notably in regions of micron-scale positive curvature. Monitoring the process of septin assembly in vivo is hindered by the limitations of light microscopy in cells, as well as the complexity of interactions with both membranes and cytoskeletal elements, making it difficult to quantify septin dynamics in living systems. Fortunately, there has been substantial progress in the past decade in reconstituting the septin cytoskeleton in a cell-free system to dissect the mechanisms controlling septin assembly at high spatial and temporal resolutions. The core steps of septin assembly include septin heterooligomer association and dissociation with the membrane, polymerization into filaments, and the formation of higher-order structures through interactions between filaments. Here, we present three methods to observe septin assembly in different contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports. These methods can be used to determine the biophysical parameters of septins at different stages of assembly: as single octamers binding the membrane, as filaments, and as assemblies of filaments. We use these parameters paired with measurements of curvature sampling and preferential adsorption to understand how curvature sensing operates at a variety of length and time scales.

Cell-free reconstitution has been a key tool to understand the cytoskeleton assembly, and work in the last decade has established approaches to study septin dynamics in minimal systems. Presented here are three complementary methods to observe septin assembly in different membrane contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports.

생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

복잡한 단백질 네트워크를 위한 지질 소포 캡슐화 프로토콜

Construction of Out&#45;of&#45;Equilibrium Metabolic Networks in Nano&#45; and Micrometer&#45;Sized Vesicles

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, using purified components. This method is relevant for the design and construction of bioreactors and the study of complex out-of-equilibrium metabolic reaction networks. We start by reconstituting (multiple) membrane proteins into large unilamellar vesicles (LUVs) according to a previously developed protocol. We then encapsulate a mixture of purified enzymes, metabolites, and fluorescence-based sensors (fluorescent proteins or dyes) via freeze-thaw-extrusion and remove non-incorporated components by centrifugation and/or size-exclusion chromatography. The performance of the metabolic networks is measured in real time by monitoring the ATP/ADP ratio, metabolite concentration, internal pH, or other parameters by fluorescence readout. Our membrane protein-containing vesicles of 100-400 nm diameter can be converted into giant-unilamellar vesicles (GUVs), using existing but optimized procedures. The approach enables the inclusion of soluble components (enzymes, metabolites, sensors) into micrometer-size vesicles, thus upscaling the volume of the bioreactors by orders of magnitude. The metabolic network containing GUVs are&#160;trapped in microfluidic devices for analysis by optical microscopy.

저자 스포트라이트: 합성 세포 공학의 과제 해결

We present a protocol for reconstituting membrane proteins and encapsulating enzymes and other water-soluble components in lipid vesicles of sub-micrometer and micrometer size.

나노미터 및 마이크로미터 크기의 소포에서 평형을 벗어난 대사 네트워크 구축

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. During neurotransmitter or hormone release via exocytosis, the fusion pore can transiently open and close repeatedly, regulating cargo release kinetics. Pore dynamics also determine the mode of vesicle recycling; irreversible resealing results in transient, &#34;kiss-and-run&#34; fusion, whereas dilation leads to full fusion. To better understand what factors govern pore dynamics, we developed an assay to monitor membrane fusion using polarized total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution in a biochemically well-defined in vitro system. Fusion of fluorescently labeled small unilamellar vesicles containing v-SNARE proteins (v-SUVs) with a planar bilayer bearing t-SNAREs, supported on a soft polymer cushion (t-SBL, t-supported bilayer), is monitored. The assay uses microfluidic flow channels that ensure minimal sample consumption while supplying a constant density of SUVs. Exploiting the rapid signal enhancement upon transfer of lipid labels from the SUV to the SBL during fusion, kinetics of lipid dye transfer is monitored. The sensitivity of TIRF microscopy allows tracking single fluorescent lipid labels, from which lipid diffusivity and SUV size can be deduced for every fusion event. Lipid dye release times can be much longer than expected for unimpeded passage through permanently open pores. Using a model that assumes retardation of lipid release is due to pore flickering, a pore &#34;openness&#34;, the fraction of time the pore remains open during fusion, can be estimated. A soluble marker can be encapsulated in the SUVs for simultaneous monitoring of lipid and soluble cargo release. Such measurements indicate some pores may reseal after losing a fraction of the soluble cargo.

Here, we present a protocol to detect single, SNARE-mediated fusion events between liposomes and supported bilayers in microfluidic channels using polarized TIRFM, with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution. Lipid and soluble cargo release can be detected simultaneously. Liposome size, lipid diffusivity, and fusion pore properties are measured.

편광 TIRF 현미경에 의해 감시 미세 유동 흐름 전지에 닿는 지원 이중층 단일 테오의 SNARE 매개 퓨전

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

신경과학

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성

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막 단백질을 표적으로 하는 기능 분석 및 항체 개발을 위한 프로테올리포좀의 무세포 생산

생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성

나노미터 및 마이크로미터 크기의 소포에서 평형을 벗어난 대사 네트워크 구축

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분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립