The authors would like to acknowledge the funding received from the American Heart Association (SDG12SDG9130039).

1.足場リポソームの調製注：理想的には、最初の実験は、比較的シンプルで特徴足場を使用する必要があります（DOPC（1,2- dioleoyl- のsn -glycero-3ホスホコリンまたはPC）およびDGS-NTA（ニッケル2 +）（1,2-ジオレオイルで構成される- SN -glycero -3 - [（N - （5-アミノ-1-カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル]（ニッケル塩））建物これらの実験のオフ、脂質電荷、柔軟性、及び曲率は、個々の要素として導入することができます膜近位の相互作用を変化させる可能性を有する。これらの変化は、ホスファチジルセリンまたはカルジオリピン（CL）、ホスファチジルエタノールアミン（DOPEまたはPE）、又はガラクトシル（β）、セラミドを含む特定の脂質成分の規定量を添加することによって達成することができます。 <ol><li>きれいなガラス試験管にクロロホルムに溶解した脂質を組み合わせます。薄い脂質フィルムを形成するためにチューブを回転させながら乾燥窒素ガスで溶媒を蒸発させます。 centrifugaで残留溶媒を除去37℃で1時間リットル蒸発器。 注：様々なリポソーム製剤は、以下に記載されたプロトコルで使用されている：足場リポソーム（3.3モル％DGS-NTA（ニッケル2 +）/ 96.7モル％DOPC）、カルジオリピン（3.3モル％DGS-NTA（ニッケル2+）との足場リポソーム/ 10モル％のカルジオリピン/ 86.7モル％DOPC）、カルジオリピンとの柔軟な足場リポソーム（3.3モル％DGS-NTA（ニッケル2 +）/ 10モル％のカルジオリピン/ 35モル％のDOPE / 51.7モル％DOPC）、および濃縮された足場リポソーム（10モル％DGS-NTAニッケル（Ni 2+）/ 35モル％DOPE / 40モル％のDOPC / 15モル％のカルジオリピン）。 </li><li> 37℃に予熱し、緩衝液A（25mMのHEPES（4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸）、KOHで7.5に調整し、150mMの塩化カリウム、pH値）を追加し、最終脂質濃度が1であるよう - 2 mmです。完全に脂質混合物（ 図1a）を再懸濁し、時々ボルテックスしながら37℃で30分間インキュベートします。 </li><li>完全に凍結（rougまで液体窒素中でチューブを、プラスチック試験管に移す配置HLY 30秒）、37℃の水浴に入れ、完全に解凍するまで（およそ1 - 2分）。 4凍結融解サイクル（ 図1b）の合計に対して、この手順を繰り返します。 </li><li> 4フィルタ支持体およびバッファ内のポリカーボネートフィルターを浸漬し、製造業者の指示に従って押出機を組み立てることによって脂質押出機を準備します。フィルターを通して21回脂質溶液を押し出します。均質なサイズ分布（ 図1c）を確保するために、穏やかに、一定の圧力を使用してください。 注：このプロトコールに記載されているすべての実験について、1.0μmのポリカーボネートフィルター押出のために使用しました。アニオン性脂質とDRP1の相互作用は、50ナノメートルから400ナノメートル12以上13までの範囲のリポソーム直径の様々な観察することができます。したがって、1μmのフィルタサイズは、両方のGTPアーゼ活性および電子顕微鏡法のために理想的であるように選択しました。他のリポソームの直径が所望される場合には、巨大な単層小胞14,15（GUVs）の調製または小unilamellARベシクル16（SUV車）を用いることができます。動的光散乱は、リポソームサイズの異質13を評価することができます。 </li><li> 4℃で押し出されたリポソームを格納し、3の後に捨てる - 5日間。 </li></ol>タンパク質結合分析のための足場リポソームの2. <ol><li>試料調製<ol><li>足場リポソームとHisタグMffΔTM（最終5μM）をインキュベート（40モル％のPC / 35モル％PE / 15モル％CL / 10モル％DGS-NTA（ニッケル2+）;最終50μM）は、少なくとも15分間緩衝液A + BMEにおけるRT（25mMのHEPES、150mMの塩化カリウム、10mMのβメルカプトエタノール（BME）、pHはKOHで7.5に調整）で。 MFF無制御のために、結合してシールドする（GFPなど）のhisタグ付き対照タンパク質を有するリポソームをインキュベートNTAニッケル（Ni 2+）が露出。 注：以前の研究2で説明したようにMffΔTMを発現および精製しました。 GFPは、同様の方法で精製したが、イオン交換工程を省略しました。 BMEは、これらのexperimenために必要でしたTS DRP1は、その活性およびアセンブリ特性を変化させることができる酸化に敏感に反応するためです。 </li><li> DRP1（2μM最終）を追加し、室温で1時間インキュベートします。 注：以前の研究2で説明したようにDRP1を発現および精製しました。 DRP1とのインキュベーション後、膜の変形に結合ヌクレオチドの効果は、2のMgCl 2および1mM GTP、1mMのGMP-PCP、または緩衝液A + BMEのいずれかでさらに1時間インキュベートすることにより調べることができます。 </li></ol></li><li>ネガティブ染色透過型電子顕微鏡（EM）分析<ol><li>実験用フィルムのシートへの転写サンプルの5μLを、サンプル上に炭素被覆銅/ Rhのグリッドを置きます。サンプル上のグリッド1分間インキュベートし、濾紙上で余分な液体を離れブロット、および2％酢酸ウラニルのドロップに移します。 、1分間インキュベートし、濾紙上で余分な汚れを吸い取ると、グリッドボックスに転送します。完全な乾燥を確実にするために、真空O / Nの下に保管してください。 </li><li>透過型電子microscを使用して画像サンプル18500でのOPE - 30,000Xの倍率は、タンパク質およびリポソームの形態17における超微細構造の変化を観察しました。 注：微細構造の変化は、ImageJの13（http://imagej.nih.gov/ij/）として、画像解析ソフトウェアを用いて定量することができます。裸の脂質のテンプレートと比較してタンパク質の装飾を測定することができます。さらに、管状セグメントの直径は、アセンブリ13の最も外側の部分から測定することができます。より詳細な分析は、低温電子顕微鏡17を用いて行うことができます。この方法は、そのコートサンプルを重金属の汚れを使用せずに溶媒中に画像天然タンパク質、脂質集合体に使用することができます。このようにして、基礎となる脂質の形態の変化を含む、ネガティブ染色で明らかでない詳細な構造的特徴は、検査及び定量することができます。 </li></ol></li></ol>酵素アッセイのための足場リポソームの3. 注：コロリメトリックGTPアーゼアッセイ18は、GTP加水分解を介してリン酸遊離を測定するために使用されました。代替GTPアーゼアッセイは、19入手可能であり、必要に応じて実施することができます。 <ol><li>緩衝液A + BME（ボリューム= 30μL）中、室温で15分間足場リポソーム（最終150μM）でHis標識MffΔTM（MFF）、Fis1ΔTM（Fis1）、またはGFP（すべての最終的な5μM）をインキュベートします。 DRP1（最終500 nM）を追加し、RT（体積= 80μL）でさらに15分間インキュベートします。 注：Fis1はMFF 2と同様に精製したが、イオン交換クロマトグラフィー工程を省略しました。 HisタグGFPの目的は、NTA（ニッケル2+）頭部基を保護し、他のタンパク質との非特異的な電荷相互作用を防止することです。何の効果がGFPの非存在下で観察されていない場合、この制御が必要とされないかもしれません。 （目的のタンパク質に匹敵する大きさの）代替的なブロッキングタンパク質も同様に使用することができるが、GFPはSCAFとの相互作用の直接可視化を可能にしますリポソームを折ります。 </li><li>転送37℃に設定したサーモサイクラーにチューブ、およびGTPおよびMgCl 2の添加によって反応を開始（それぞれ1から2mmの最終;体積= 120μL）。 </li><li>所望の時点（ すなわち、T = 5、10、20、40、60分）で、マグネシウムをキレート2+と反応を停止させるために0.5 M EDTAを5μLを含むマイクロタイタープレートのウェルに反応の20μLを移します。 </li><li>結果を校正するために緩衝液A + BMEにKH 2 PO 4を希釈することにより、リン酸標準のセットを準備します。標準の有用なセット100、80、60、40、20、10、5、0μMです。 0.5 M EDTAの5μLを含むウェルに各20μLのを追加します。 </li><li>各ウェルにマラカイトグリーン試薬の150μL（1 mMのマラカイトグリーンカルビノール、10mMのモリブデン酸アンモニウム四水和物、および1NのHCl）を追加し、さらに後にOD 650 5分をお読みください。 注：GTPは酸に不安定であり、マラカイトグリーン試薬の存在下で加水分解する。そのトンを確認してくださいマラカイト試薬を添加し、読書の間、彼は時間が再現可能な結果を​​確実にするために一定です。 </li><li>リン酸濃度の関数として標準のOD 650をプロットすることにより標準曲線を生成します。サンプル中のOD 650とリン酸濃度との関係を決定するために、線形回帰を使用してください。 </li><li>線形回帰を使用して、タンパク質の反応試料のOD 650は μMリン酸に変換します。時間の関数としてのリン酸濃度をプロットすることにより、各反応混合物のためのリン酸生成速度を決定し、DRP1濃度（0.5μM）によって速度を分割して猫を kに変換します。 注：のみ最初の線形速度は、リン酸の生成速度を決定するために使用する必要があり、そして3つのデータ点の最小値を使用しなければなりません。反応速度は、最初の3つのデータ点が線形ではないことは十分に迅速である場合（線形フィットのR 2は 0.9未満である）記号少なくとも3の時点でificantly短い時間のコースを実施すべきです。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

このプロトコルは、内在性膜タンパク質を含むタンパク質 - タンパク質相互作用を調査するための方法を提供しています。モジュラーリポソーム足場を利用することにより、研究者らは、脂質近位環境内の1つ以上のタンパク質の活性を評価することが可能です。 26 -これまでの研究は、原形質膜24の受容体酵素の同様の方法を実証しました。私たちは、脂質補因子を?...

膜近位のタンパク質-タンパク質相互作用を研究することにより、1関わる内在性膜タンパク質のネイティブ環境を反復するのが困難に挑戦し努力です。これは、界面活性剤可溶化およびプロテオリポソーム中のタンパク質の矛盾した姿勢の必要性に起因しています。これらの問題を回避するために、我々は、内在性膜タンパク質の可溶性ドメインは、Hisタグ融合タンパク質として発現させる戦略を採用しており、これらの可溶性断片は、脂質でNTAニッケル（Ni 2+）頭部基との相互作用を介して足場リポソームに固定されています表面。これらの足場を使用して、脂質近位タンパク質相互作用は、脂質およびタンパク質組成の範囲にわたって調べることができます。 我々は、ミトコンドリア分裂複合体のアセンブリを管理する重要なタンパク質 - タンパク質相互作用を調査し、このPRを調節する脂質との相互作用を調べるために、この方法を有効に適用していますocess 2。ミトコンドリア分裂の間、ダイナミン関連タンパク質1（DRP1）3と呼ばれる保存された膜のリモデリングタンパク質は、エネルギー恒常性、アポトーシスシグナル伝達、およびその他のいくつかを調節する細胞シグナルに応答してミトコンドリア外膜（OMM）の表面に補充され一体的なミトコンドリアのプロセス。 8 -この大規模な、細胞質ゾルのGTPアーゼは、一体のOMMタンパク質4との相互作用を介してミトコンドリアの表面に補充されます。そのようなタンパク質の役割、ミトコンドリア分裂因子（MFF）は、原因in vitroで DRP1と明らか弱い相互作用に解明することは困難でした。それにもかかわらず、遺伝学的研究は、MFFが成功したミトコンドリア分裂7,8に必須であることを実証しました。本稿に記載される方法は、DRP1、MFFの相互作用を促進し、同時に脂質相互作用を導入することによって、以前の欠点を克服することができました。全体的に、この新規アッセイreveaミトコンドリア分裂複合体の構築を導く基本的な相互作用を導き、この本質的な分子機械の継続的な構造的および機能的研究のための新たなステージを提供します。 現在までに、DRP1とMFFの間の相互作用の検討はMFF 9、DRP1ポリマー2,10、および精製することが困難と無傷の膜貫通ドメイン11と、全長MFFを再構成するの異質性の固有の柔軟性によって複雑にされています。私たちは、その膜貫通ドメイン（MffΔTM-彼の6）を欠いているHisタグMFFを再構成するNTA（ニッケル2+）足場リポソームを用いて、これらの課題に対処しました。 Eにおいて過剰発現された場合MffΔTMは非常に可溶であったため、この戦略が有利でした。大腸菌 、この単離されたタンパク質は、簡単に足場リポソームに再構成しました。これらの脂質のテンプレートに繋留すると、MFFは、膜の表面上の同一の、外向きの方向性を仮定しました。これらの利点に加えて、カルジオリピンのようなミトコンドリアの脂質は、膜11とMFFの折り畳みおよび会合を安定化させるために添加しました。カルジオリピンはまた、この無秩序地域を安定させ、核分裂機械の組み立てを容易にすることができるDRP1 2,12の可変ドメインと相互作用します。 このロバストな方法は、膜近位タンパク質相互作用を評価するために求める将来の研究のために広く適用可能です。追加のテザリング/親和性相互作用を使用することにより、これらの膜の再構成の研究の高度化は、細胞内の膜の表面で見出される付加的な複雑性を模倣するように拡張することができます。これと同時に、脂質組成物は、より正確に、これらの巨大分子複合体のネイティブ環境を模倣するように改変することができます。要約すると、この方法は、重要な細胞PROC中に膜形態を形成する上でのタンパク質及び脂質の相対的な寄与を検討するための手段を提供しますesses。

<table><tbody><tr><td>Phosphatidylcholine (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylethanolamine (DOPE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>DGS-NTA(Ni&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Heart Cardiolipin (CL)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840012</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Acros Organics</td><td>268320010</td><td></td></tr><tr><td>Liposome Extruder</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>Cu/Rh Negative Stain Grids</td><td>Ted Pella</td><td>79712</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge Tube</td><td>Beckman</td><td>357448</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-1012</td><td></td></tr><tr><td>GMP-PCP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3509</td><td></td></tr><tr><td>Microtiter Plate strips</td><td>Thermo Scientific</td><td>469949</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Acros Organics</td><td>40993-0010</td><td></td></tr><tr><td>Instant Blue Coomassie Dye</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P330</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Acros Organics</td><td>223211000</td><td></td></tr><tr><td>4 - 20% SDS-PAGE Gel</td><td>Bio Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Loading Dye</td><td>Bio Rad</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S</td><td></td></tr><tr><td>Malachite Green Carbinol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>229105</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7302</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory Film</td><td>Parafilm</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>Polysciences</td><td>21447</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai T12 100 keV Microscope</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TLA-55 Rotor</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated CentriVap Concentrator</td><td>Labconico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Pro Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VersaMax Microplate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

using scaffold liposomes to reconstitute lipid-proximal protein-protein interactions in vitro

インビトロでの内在性膜タンパク質の研究は、しばしば、疎水性膜貫通ドメインの存在によって複雑になります。さらに、これらの研究を複雑に、リポソームへの界面活性剤で可溶化膜タンパク質の再取り込みは、タンパク質のトポロジーが強制することは不可能である確率過程です。本稿では、リポソームベースの足場を利用し、これらの困難な技術に代わる方法を提供しています。タンパク質の溶解度は、膜貫通ドメインの欠失によって増強され、そしてこれらのアミノ酸は、Hisタグのように、つなぎ部分で置換されています。このテザーはアンカー基ニッケル（Ni 2+ Hisタグタンパク質についてニトリロ三酢酸（NTAニッケル（Ni 2+））によって調整）、リポソームの表面に均一なタンパク質のトポロジーを強制すると相互作用します。内在性膜タンパク質、ミトコンドリア分裂因子（MFF）とダイナミン関連タンパク質1（DRP1）の間の相互作用は、inveだった例が提示されますこの足場のリポソーム法を用いstigated。本研究では、効率的にそのGTPase活性を刺激したリポソームの表面に可溶性DRP1を募集するMFFの能力を実証しています。また、DRP1は、特定の脂質の存在下でMFF装飾脂質テンプレートをチューブ状にすることができました。この例では、構造的および機能的アッセイを用いて足場リポソームの有効性を実証し、DRP1活性の調節におけるMFFの役割を強調しています。

DRP1とMFFとの間の相互作用は、ミトコンドリア分裂に重要であることが実証されているが、この相互作用は、 インビトロで再現することは困難でした。私たちの目標は、より良いDRP1とMFFが相互作用前記細胞環境をエミュレートすることでした。この目的のために、NTAニッケル（Ni 2+）の限界濃度を含有するリポソームは、頭部基は、上述のように脂質?...

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Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

using-scaffold-liposomes-to-reconstitute-lipid-proximal-protein

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

8.8K ビュー.  Case Western Reserve University School of Medicine. This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment. 

ビデオ: Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers are less compatible with detergents.
Here we describe a strategy for bypassing this fundamental limitation using fusogenic oppositely charged liposomes bearing a membrane protein of interest. Fusion between such vesicles occurs within 5 min in a low ionic strength buffer. Positively charged fusogenic liposomes can be used as simple shuttle vectors for detergent-free delivery of membrane proteins into biomimetic target lipid bilayers, which are negatively charged. We also show how to reconstitute membrane proteins into fusogenic proteoliposomes with a fast 30-min protocol.
Combining these two approaches, we demonstrate a fast assembly of an electron transport chain consisting of two membrane proteins from E. coli, a primary proton pump bo3-oxidase and F1Fo ATP synthase, in membranes of vesicles of various sizes, ranging from 0.1 to &#62;10 microns, as well as ATP production by this chain.

Here we present two ultrafast protocols for reconstitution of membrane proteins into fusogenic proteoliposomes, and fusion of such proteoliposomes with target lipid bilayers for detergent-free delivery of these membrane proteins into the postfusion bilayer. The combination of these approaches enables fast and easily controlled assembly of complex multi-component membrane systems.

洗剤無料補完充電プロテオリポソーム融合ペプチドを用いた脂質膜に膜タンパク質の超高速再構成。

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

生化学

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum (ER) resident proteins implicated in homotypic fusion of the ER. We detail here a method for purifying a glutathione S-transferase (GST) and poly-histidine tagged Drosophila atlastin by two rounds of affinity chromatography. Studying fusion reactions in vitro requires purified fusion proteins to be inserted into a lipid bilayer. Liposomes are ideal model membranes, as lipid composition and size may be adjusted. To this end, we describe a reconstitution method by detergent removal for Drosophila atlastin into preformed liposomes. While several reconstitution methods are available, reconstitution by detergent removal has several advantages that make it suitable for atlastins and other similar proteins. The advantage of this method includes a high reconstitution yield and correct orientation of the reconstituted protein. This method can be extended to other membrane proteins and for other applications that require proteoliposomes. Additionally, we describe a FRET based lipid mixing assay of proteoliposomes used as a measurement of membrane fusion.

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biological membrane fusion is catalyzed by specialized fusion proteins. Measuring the fusogenic properties of proteins can be achieved by lipid mixing assays. We present a method for purifying recombinant Drosophila atlastin, a protein that mediates homotypic fusion of the ER, reconstituting it to preformed liposomes, and testing for fusion capacity.

脂質混合アッセイ用リポソームへの組換えショウジョウバエアラストシンの洗剤支援再構成

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial membrane is a challenging environment to distinguish regulatory factors. Experimental control of protein and lipid components can help answer specific questions of regulation. Yet, quantitative manipulation of these factors is challenging in cellular assays. To investigate the molecular mechanism of mitochondria inner-membrane fusion, we introduced an in vitro reconstitution platform that mimics the lipid environment of the mitochondrial inner-membrane. Here we describe detailed steps for preparing lipid bilayers and reconstituting mitochondrial membrane proteins. The platform allowed analysis of intermediates in mitochondrial inner-membrane fusion, and the kinetics for individual transitions, in a quantitative manner. This protocol describes the fabrication of bilayers with asymmetric lipid composition and describes general considerations for reconstituting transmembrane proteins into a cushioned bilayer. The method may be applied to study other membrane systems.

Mitochondrial fusion is an important homeostatic reaction underlying mitochondrial dynamics. Described here is an in vitro reconstitution system to study mitochondrial inner-membrane fusion that can resolve membrane tethering, docking, hemifusion, and pore opening. The versatility of this approach in exploring cell membrane systems is discussed.

ミトコンドリア膜動態を再構成するためのモデル膜プラットフォーム

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug discovery because they are the targets of more than half of all drugs. An obstacle to conducting biochemical, biophysical, and structural studies of membrane proteins as well as antibody development has been the difficulty in producing large amounts of high-quality membrane protein with correct conformation and activity. Here we describe a &#8220;bilayer-dialysis method&#8221; using a wheat germ cell-free system, liposomes, and dialysis cups to efficiently synthesize membrane proteins and prepare purified proteoliposomes in a short time with a high success rate. Membrane proteins can be produced as much as in several milligrams, such as GPCRs, ion channels, transporters, and tetraspanins. This cell-free method contributes to reducing the time, cost and effort for preparing high-quality proteoliposomes, and provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

This protocol describes an efficient cell-free method for production of high-quality proteoliposome by bilayer-dialysis method using wheat cell-free system and liposomes. This method provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

膜タンパク質を標的とした機能解析と抗体開発のためのプロテオリポソームの無細胞生産

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component in coordinating shape changes like cytokinesis, polarized growth, and migration. Septins are filament-forming proteins that assemble to form diverse higher-order structures and, in many cases, are found in different areas of the plasma membrane, most notably in regions of micron-scale positive curvature. Monitoring the process of septin assembly in vivo is hindered by the limitations of light microscopy in cells, as well as the complexity of interactions with both membranes and cytoskeletal elements, making it difficult to quantify septin dynamics in living systems. Fortunately, there has been substantial progress in the past decade in reconstituting the septin cytoskeleton in a cell-free system to dissect the mechanisms controlling septin assembly at high spatial and temporal resolutions. The core steps of septin assembly include septin heterooligomer association and dissociation with the membrane, polymerization into filaments, and the formation of higher-order structures through interactions between filaments. Here, we present three methods to observe septin assembly in different contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports. These methods can be used to determine the biophysical parameters of septins at different stages of assembly: as single octamers binding the membrane, as filaments, and as assemblies of filaments. We use these parameters paired with measurements of curvature sampling and preferential adsorption to understand how curvature sensing operates at a variety of length and time scales.

Cell-free reconstitution has been a key tool to understand the cytoskeleton assembly, and work in the last decade has established approaches to study septin dynamics in minimal systems. Presented here are three complementary methods to observe septin assembly in different membrane contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports.

生物物理学的特性と機能を研究するための膜でのセプチンアセンブリの再構成

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

複雑な蛋白質ネットワークのための脂質小胞のカプセル化のプロトコール

Construction of Out&#45;of&#45;Equilibrium Metabolic Networks in Nano&#45; and Micrometer&#45;Sized Vesicles

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, using purified components. This method is relevant for the design and construction of bioreactors and the study of complex out-of-equilibrium metabolic reaction networks. We start by reconstituting (multiple) membrane proteins into large unilamellar vesicles (LUVs) according to a previously developed protocol. We then encapsulate a mixture of purified enzymes, metabolites, and fluorescence-based sensors (fluorescent proteins or dyes) via freeze-thaw-extrusion and remove non-incorporated components by centrifugation and/or size-exclusion chromatography. The performance of the metabolic networks is measured in real time by monitoring the ATP/ADP ratio, metabolite concentration, internal pH, or other parameters by fluorescence readout. Our membrane protein-containing vesicles of 100-400 nm diameter can be converted into giant-unilamellar vesicles (GUVs), using existing but optimized procedures. The approach enables the inclusion of soluble components (enzymes, metabolites, sensors) into micrometer-size vesicles, thus upscaling the volume of the bioreactors by orders of magnitude. The metabolic network containing GUVs are&#160;trapped in microfluidic devices for analysis by optical microscopy.

著者スポットライト:合成細胞工学における課題への取り組み

We present a protocol for reconstituting membrane proteins and encapsulating enzymes and other water-soluble components in lipid vesicles of sub-micrometer and micrometer size.

ナノ・マイクロメートル小胞における非平衡代謝ネットワークの構築

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. During neurotransmitter or hormone release via exocytosis, the fusion pore can transiently open and close repeatedly, regulating cargo release kinetics. Pore dynamics also determine the mode of vesicle recycling; irreversible resealing results in transient, &#34;kiss-and-run&#34; fusion, whereas dilation leads to full fusion. To better understand what factors govern pore dynamics, we developed an assay to monitor membrane fusion using polarized total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution in a biochemically well-defined in vitro system. Fusion of fluorescently labeled small unilamellar vesicles containing v-SNARE proteins (v-SUVs) with a planar bilayer bearing t-SNAREs, supported on a soft polymer cushion (t-SBL, t-supported bilayer), is monitored. The assay uses microfluidic flow channels that ensure minimal sample consumption while supplying a constant density of SUVs. Exploiting the rapid signal enhancement upon transfer of lipid labels from the SUV to the SBL during fusion, kinetics of lipid dye transfer is monitored. The sensitivity of TIRF microscopy allows tracking single fluorescent lipid labels, from which lipid diffusivity and SUV size can be deduced for every fusion event. Lipid dye release times can be much longer than expected for unimpeded passage through permanently open pores. Using a model that assumes retardation of lipid release is due to pore flickering, a pore &#34;openness&#34;, the fraction of time the pore remains open during fusion, can be estimated. A soluble marker can be encapsulated in the SUVs for simultaneous monitoring of lipid and soluble cargo release. Such measurements indicate some pores may reseal after losing a fraction of the soluble cargo.

Here, we present a protocol to detect single, SNARE-mediated fusion events between liposomes and supported bilayers in microfluidic channels using polarized TIRFM, with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution. Lipid and soluble cargo release can be detected simultaneously. Liposome size, lipid diffusivity, and fusion pore properties are measured.

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層​​を持つシングルプロテオリポソー​​ムのSNARE媒介性の融合

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

神経科学

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

分子相互作用研究のための細胞模倣支援及び懸濁脂質二重層モデルの組み立て

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します

要約

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洗剤無料補完充電プロテオリポソーム融合ペプチドを用いた脂質膜に膜タンパク質の超高速再構成。

脂質混合アッセイ用リポソームへの組換えショウジョウバエアラストシンの洗剤支援再構成

ミトコンドリア膜動態を再構成するためのモデル膜プラットフォーム

膜タンパク質を標的とした機能解析と抗体開発のためのプロテオリポソームの無細胞生産

生物物理学的特性と機能を研究するための膜でのセプチンアセンブリの再構成

ナノ・マイクロメートル小胞における非平衡代謝ネットワークの構築

ナノ・マイクロメートル小胞における非平衡代謝ネットワークの構築

ナノ・マイクロメートル小胞における非平衡代謝ネットワークの構築

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層を持つシングルプロテオリポソームのSNARE媒介性の融合

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足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します

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