저자는 도움이 토론 바스케즈 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 [KMV하는 CA097175, CA093279] 건강 / 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)의 국립 연구소에 의해 지원되었다; 암 예방 및 텍사스 연구소 [RP101501]합니다. 오픈 액세스 요금 자금 : 국립 연구소 건강 / 국립 암 연구소 [KMV에 CA093279].

플라스미드 기판에 TFO 지시 ICLS 1. 준비 <ol><li> 10,11 DNA 삼중 결합 완충액 [50 % 글리세롤, 10 mM 트리스 (PH 7.6), 10 mM의를 MgCl2 8 μL에 랄렌 공역 TFO AG30와 (5 μg의 플라스미드 DNA 좋은 출발점) 플라스미드 pSupFG1 몰량 부화 2] 호박색 튜브에서 40 μL의 최종 부피 DH 2 O. 로 pipetting 아래로 잘 섞는다. 12 시간 동안 37 ℃로 물을 욕조에서 반응을 품어. </li><li> 최대 전력 출력을 보장하기 위해 UVA 램프 워밍업. 파라핀 영화의 삼박자 반응을 배치하고, UVA (365 ㎚) 램프 아래에 얼음에 파라핀 필름을 배치합니다. 램프와 반응 사이의 마일 라 (Mylar) 필터를 놓습니다. </li><li> UVA가 18 J / ㎠의 총 투여 량에 대해 조사한다. 더 사용하기 위해 4 ° C에서 샘플을 저장합니다. 주의 : UVA 조사와 적절한 보호 안경과 복을 착용 할 것. </li><li> 재와 상기 제조 된 플라스미드 200 ng의 선형화제조업체를 사용하여 20 μl의 총 부피에 striction 효소 에코 R1 10 배 버퍼를 제공. 열은 65 ° C에서 20 분 동안 효소를 변성. 10,000 XG에 10 분 동안 샘플을 스핀 4 ℃에서 저장한다. </li><li> 50 배 알칼리 버퍼 [1.5 M의 NaOH, 50 mM의 에틸렌 디아민 산 (EDTA)]를 준비합니다. 50 ㎖ DH 2 O.에 아가로 오스의 0.5 mg을 추가 아가로 오스를 해산하고 50 ° C의 물을 욕조에 배치하는 끓인다. </li><li> 용해 된 아가로 오스의 온도가 아래로 50 ° C에 후에는 50 배 알칼리 버퍼 1 ㎖를 추가하여 혼합 한 후 젤 트레이에 젤을 붓는다. 젤은 사용하기 전에 실온에서 응고 할 때까지 기다립니다. </li><li> 선형화 된 DNA 시료를 20 ㎕의 0.5 M EDTA 4 μl를 첨가하고 실온에서 10 분 동안 배양한다. </li><li> 6 배 알칼리 젤 로딩 버퍼 추가 (300 mM의 NaOH를 6 mM의 EDTA (승 / 18 % v)의 고 분자량 폴리 사카 라이드, 0.06 % 브로 모 크레졸 그린 DH 2 O)에 샘플 및 1 킬로바이트 DNA 사다리. 주 : 6 배 알칼리 젤 로딩 버퍼를 사용하는 것이 중요하다, 논의를 참조하시기 바랍니다. </li><li> 로드 추운 방에 젤 위에 샘플 cm 당 3.2 볼트에서 하룻밤 1X 알칼리 버퍼 (12-16 시간)에서 실행합니다. 샘플이 겔을 입력하면, 플로팅되는 것을 방지하기 위하여, 겔 위에 유리판을 배치했다. </li><li> 중화 완충액 [1 M 트리스 CL (PH 7.6), 1.5 M의 NaCl, 3M 아세트산 나트륨 (pH5.2)]을 실온에서 45 분 동안의 겔을 침지하여 시료를 중화. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 50 ml의 물에 1 %의 에티 디움 브로마이드 (EtBr로) 4 μL에 대한 DNA 젤 얼룩. 15 분 동안 물 Destain. 촬상 시스템을 이용하여 DNA를 시각화. 주의 : EtBr이 돌연변이는 강력하고 피부를 통해 흡수 될 수있다. EtBr이 직접 접촉을 피하십시오. </li></ol> 인간의 세포에서 TFO 지시 ICL 포함하는 플라스미드 2. 형질과 면역 침전 <ol><li> 플레이트 400,000 포유류 세포 (예를 들면, O U2OS둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 60mm 접시 당 steosarcoma 세포)를 형질 감염 24 시간 전에 항생제없이 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충. 5 % CO 2와 37 ° C에서 하룻밤 세포를 품어. </li><li> 수욕에서 37 ° C로 형질 따뜻한 성장 배지 및 인산 완충 생리 식염수 (PBS)에 앞서. 실온으로 형질 감염 시약을 따뜻하게. </li><li> 10 분에 500 1 배 성장 미디어 μL (혼합 1)과 (2) 별도의 14 mL에 1 배 성장 미디어 (혼합 2) 500 μL의 플라스미드를 ICL 함유 TFO 지시 둥근 바닥 튜브 μg의와 형질 전환 시약의 30 μl를 품다 실온. </li><li> 2 믹스로 pipetting 아래로 잘 혼합 믹스 1을 추가합니다. 실온에서 25 ~ 30 분 동안 품어. </li><li> 따뜻한 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 세포의 플레이트에 걸쳐 균등하게 분배 적가 방식으로 형질 전환 혼합물을 추가한다. 접시에 성장 배지 1 ㎖를 추가하고 2 ml의에 최종 볼륨을 가지고. 우리 믹스게요. 4 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C를 인큐베이터에서 배양 플레이트를 놓습니다. </li><li> 10 % FBS와 보충 3 ㎖ 성장 미디어와 미디어를 교체하고 16 시간 동안 더 배양한다. 항생제를 사용하지 마십시오. </li><li> 대략 1 %의 최종 농도로 플레이트 당 신선한 37 % 포름 알데히드의 80 μL로 세포를 처리하고, 빛의 부재하에 실온에서 10 분 동안 배양한다. 주의 : 포름 알데히드는 독성 및 안전 지침에 따라 처리되어야한다. 포름 알데히드의 노출은 피부, 눈과 호흡 기관에 해를 입힐 수 있습니다. </li><li> 접시 당 (시판 키트에 공급) 냉장 글리신의 300 μl를 추가하고 5 분 동안 배양하여 포름 알데히드 가교을 끄다. 용지를 제거하고 차가운 PBS로 두 번 세척 한 후 microcentrifuge 관에 냉장 (4 ℃) PBS 1 ml의 근근이 살아가고에 의해 세포를 수집합니다. 항상 얼음에 샘플을 유지합니다. </li><li> 5 분 a를 4 ℃에서 원심 분리하여 세포 펠렛을 준비탁상 냉장 원심 분리기를 사용하여 13,400 XG에서 t. 피펫 밖으로 뜨는을하고 얼음에 세포 펠렛을 배치합니다. </li><li> 균일 1 ml의 냉장 (4 ℃) 버퍼 A (시판 키트에 공급)에 펠렛을 재현 탁하고 10 분 동안 얼음에 품어. 튜브를 반전 가끔 섞는다. 펠렛 세포 이전 (위의 단계 2.9 참조). </li><li> 균일하게 냉각 한 용액에 펠릿 (4 ° C) 버퍼 B를 (시판 키트에 제공) 재현 탁하고 반전 가끔 믹싱과 10 분 동안 얼음에 품어. 이전 원심 분리하여 펠렛 세포 (위의 단계 2.9 참조). </li><li> 버퍼 B. 냉각 200 μL에 다시 세포를 재현 탁하면 Micrococcal의 클레아 제 (MNase)의 2 μl를 추가하고 10 분 동안 실온에서 품어. 튜브를 쓸어 넘겨 때때로 반응을 섞는다. 얼음에 튜브를 배치하고 40 mM의 EDTA를 첨가하여 MNase 반응을 멈춘다. 펠렛 세포 이전 (위의 단계 2.9 참조). </li><li> 100 ㎕의 1 배 염색질 immunopr에 재현 탁 세포프로테아제 억제제 칵테일로 보충 ecipitation 버퍼 (칩) 버퍼 (시판 키트에 제공). </li><li> 얇은 벽의 microfuge 튜브에 재현 탁 세포를 놓습니다. 얼음에 20 초 동안 배양 한 다음 20 초 동안 물 목욕 초음파기에 그들을 떠하여 샘플을 sonicate하세요. 반복 초음파는 ~ 800-1,200 bp의 단편을 생성하기 위해 9 번 단계를 반복합니다. <ol><li> 초음파 처리 된 샘플 20 μL에 텍싱에 의해 잘 3 ㎕의 5 M NaCl을 1 μL의 RNase A. 믹스를 추가하고 30 분 동안 37 ° C에서 품어. 그 후, 2 μL 테 K를 추가하고 65 ° C에서 2 시간 동안 품어. PCR 정제 키트를 이용하여 시료를 정제. 1 % 아가 로스 겔에서 샘플을 실행하고 EtBr이 함께 시각화. 참고 : 결과 DNA의 최대 강도에서 1,000 bp의 아래에 있어야한다. </li></ol></li><li> 세 개의 튜브에 미리 냉장 실리콘 처리 된 튜브에 해물 30 μl를 추가 한 다음 추가 프로테아제 억제제와 냉장 1 배의 칩 버퍼의 70 μl를 추가합니다. 1 μ 추가각각의 튜브에 안티 - 면역 글로불린 G (IgG를) (양성 대조군으로), 안티 - 히스톤 H3, 또는 안티 HMGB1 항체의 g. 연속 회전 추운 방에서 밤새 품어. </li><li> 균일하게 추운 방에 재현 탁 단백질 G 비즈. 튜브 당 단백질 G 비즈의 4 μl를 추가하고 회전 추운 방에 또 다른 2-4 시간 동안 배양한다. </li><li> 자기 랙을 사용하여 구슬 펠렛과 뜨는을 제거합니다. 펠렛에 프로테아제 억제제 칵테일 혼합 200 μl의 1X 칩 버퍼를 추가하고 회전 추운 방에서 5 분간 씻는다. 두 번 씻어 반복합니다. </li><li> 높은 소금 1 배 칩 버퍼 (70 mM의 NaCl을 함유하는)와 하나의 추가 세척을 수행합니다. </li><li> (시판 키트에 제공됨) 160 ㎕의 용출 완충액으로 펠렛을 재현 탁하고, 30 분 동안 회전하여 37 ° C에서 배양한다. </li><li> 구슬을 펠렛과 신선한 튜브에 뜨는를 수집합니다. 5 M NaCl을 6 μL와 단백질 분해 효소 K 2 μl를 추가, 65에서 하룻밤 배양기음. </li><li> PCR의 산물 정제 키트를 사용하여 DNA를 정제하여, 50 μL의 2 O. DH를 사용하여 DNA를 용출 </li><li> PCR에게 관심 영역 (들)에 프라이머 세트를 사용하여 16 반응을 수행하고 EtBr이 물들 1 % 아가 로스 겔에 제품을 해결. </li></ol> 3. 수퍼 코일 분석 및 2 차원 전기 영동 아가로 스겔 <ol><li> DNA 수리 합성 버퍼를 준비한다 (45 mM의 헤 페스-KOH, pH가 7.8, 70 mM의 KCl을 7.4 밀리미터의 MgCl 2, 0.9 mM의 DTT, 0.4 mM의 EDTA, 2 mM의 ATP, 20 μM의 dNTPs, 3.4 % 글리세롤, 18 μg의 소 혈청 알부민) . -80 ° C에서 보관하십시오. 얼음과 이전에 녹여 40 밀리미터 크레아틴 인산 및 2.5 μg의 크레아틴 포스 포 키나제를 추가 사용할 수 있습니다. </li><li> 실온에서 10 배 수퍼 코일 버퍼 [500 mM 트리스 (산도 8.0), 500 mM의 NaCl을, 25 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 EDTA], 및 저장을 준비합니다. </li><li> 완전히 1X 1 μL 백시 토포 이소 머라 제 I (5-15 U / μL)을 사용하여 수퍼 코일 pSupFG1 플라스미드의 DNA 300 ng의 선형화10 μl의 반응에서 수퍼 코일 버퍼입니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 혼합물을 인큐베이션. </li><li> 얼음 헬라 무 세포 추출물 (24)를 해동. 완전히 이완 된 플라스미드로 25 μL 헬라 무 세포 추출물 및 DNA 수선 합성 버퍼에 추가한다. 잘 섞다. 믹스에 백시 니아 토포 이소 머라 제 I의 추가 1 μl를 추가하고, 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 소듐 도데 실 설페이트 (SDS) (1 % 최종 농도) 및 프로 티나 제 K (0.25 ㎎ / ㎖ 최종 농도)을 첨가하여 반응을 종료한다. 2 시간 동안 65 ° C에서 품어. </li><li> 1X 트리스 붕산염 EDTA (TBE) 완충액으로 1 % 아가 로스 겔을 전송. DNA 로딩 염료를 추가하고 최소 4 차선 떨어져 겔에 직접 반응을로드합니다. topoisomers를 해결하기 위해 실온에서 1 배 TBE 2 V / cm (차원 1)에 8 ~ 10 시간 동안 젤을 실행합니다. 주 : 트리스 염기 54g을 첨가함으로써 DH 2 O 1 L의 5 배 TBE 원액을 준비한다. 붕산 27.5 g과의 0.5 M EDTA (pH 8.0) 20 ㎖. </li><li> 1 배의이 L 준비3 μg의 / ㎖의 클로로퀸 포스페이트와 TBE. 20 분 동안이 용액 200 ㎖에 젤을 만끽 해보세요. 알루미늄 호일로 겔 트레이를 커버. </li><li> 두 번째 차원의 젤을 electrophorese하려면 시계 방향 방식으로 겔 90 °를 설정하고 양극과 음극 supercoils를 해결하기 위해 1X TBE를 포함 클로로퀸 2 V / cm에서 4-6 시간 동안 실행합니다. </li><li> 로커에 1 시간 동안 EtBr이와 젤을 얼룩. 15 분 동안 DH 2 O로 겔 Destain이어서 이미 저를 사용하여 topoisomers의 열분포를 시각화. </li></ol>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mobility+group+protein+1+preferentially+conserves+torsion+in+negatively+supercoiled+DNA.">High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA.</a> Biochemistry. 28, 5658-5664 (1989).</li><li>Betous, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+TLS+DNA+polymerases+eta+and+kappa+in+processing+naturally+occurring+structured+DNA+in+human+cells.">Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells.</a> Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).</li><li>Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+intrachromosomal+gene+conversion+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+microinjected+into+mouse+cells.">High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).</li><li>Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+mutations+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+in+mammalian+cells.">Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).</li><li>Puri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+number+of+2'-O-(2-aminoethyl)+residues+required+for+gene+knockout+activity+by+triple+helix+forming+oligonucleotides.">Minimum number of 2'-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides.</a> Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).</li><li>Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+oncogenes+to+improve+breast+cancer+chemotherapy.">Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy.</a> Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).</li><li>Boulware, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplex-forming+oligonucleotides+targeting+c-MYC+potentiate+the+anti-tumor+activity+of+gemcitabine+in+a+mouse+model+of+human+cancer.">Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer.</a> Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).</li></ol>

The authors declare no conflict of interest.

TFO 지시 ICLS의 효율적 형성이 중요한 요인에 따라 달라집니다 : 목표에 TFO의 결합 친화도에 따라 그 대상 DNA의 기판과의 TFO의 배양, 적절한 버퍼 구성 요소 (예를 들어,의 MgCl 2) 첫 번째 시간 (종속 이중 및 농도)를 사용; 둘째, UVA의 적절한 투여 량 (365 ㎚)을 조사 효율적 소라렌 가교 결합을 형성한다. 최적 삼중 형성 HPLC 또는 겔 정제 TFOs를 사용함으로써 달성 될 수있다. TFO 오염 불순...

삼중 나선 구조를 형성하는 1-5 훅 스틴 수소 결합을 통해 서열 - 특이 적 방식으로 올리고 뉴클레오티드 (TFOs) 바인드 듀플렉스 DNA를 플렉스가 형성. 플렉스 기술은 이러한 전사, DNA 손상을 복구하고 유전자 타겟팅 (참고 문헌 6-8에서 검토)와 같은 생체 분자 메커니즘의 다양한 심문 사용되고있다. TFOs는 리포터 플라스미드 9,10-에 부위 - 특이 적 손상을 유도하기 위해 널리 사용되어왔다. 우리의 실험실과 다른 사람은 이전에 플라스미드 pSupFG1 5,10-12에 supF 유전자에 사이트 별 DNA의 interstrand의 가교 (ICLS)을 유도하기 위해 소 랄렌 분자에 닿는 TFO, AG30을 사용하고 있습니다. ICLS 이러한 병변 공유 개의 DNA 가닥 가교로서 매우 독성이며, 수리되지두면 유전자 전사를 차단하고, DNA 복제 장치 (13, 14)을 방해 할 수있다. 때문에 독성 잠재력, ICL 유도 화제는 치료에 항암제로 사용되어왔다암 및 기타 질병 15. 그러나, 인간의 세포에서 ICLS의 처리 및 수리가 잘 이해되지 않습니다. 따라서, 인간 세포에서 ICLS의 처리에 관여하는 메카니즘에 대한 이해는 ICL 계 화학 요법의 효능을 개선하는 데 도움이된다. TFO 유도 ICLS 및 수리 중간체는 DNA의 나선 구조에 상당한 왜곡을 야기 할 가능성이있다. 이러한 왜곡은 정규 B 형 이중 DNA 16-20보다 더 높은 친화력으로 왜곡 된 DNA에 결합 건축 단백질에 대한 가능성이 대상입니다. 여기, 우리는 염색질 면역 (칩) 소 랄렌 교 플라스미드에 대한 분석을 통해 인간의 세포에서 ICLS와 매우 풍부한 건축 단백질 협회, HMGB1을 공부하고 인간의 소 랄렌 가교 플라스미드 DNA의 토폴로지를 변조에 HMGB1의 역할을 확인 암 세포 용 해물. HMGB1은 매우 풍부하고 재하 표현이 아닌 자신의정규 B 형 DNA 17-20보다 더 높은 친화력으로 손상된 DNA와 대안 구조화 된 DNA 기판에 결합 톤 건축 단백질. HMGB1 그러한 전사, DNA 복제 및 DNA 수선 16,21-23 여러 DNA 대사 과정에 관여한다. 우리는 이전에 HMGB1 높은 친 화성 (20)와 체외에서 TFO 지시 ICLS에 결합하는 것을 증명하고있다. 또한, 우리는 HMGB1의 부족 뉴클레오티드 절단 수리 (NER) 보조 인자 (23, 24)로 TFO 지시 ICLS의 돌연변이 처리 및 확인 HMGB1 증가 있음을 증명하고있다. 최근에, 우리는 HMGB1는 인간의 세포에서 TFO 지시 ICLS과 관련된 이러한 병변의 채용은 NER 단백질, XPA (16)에 의존하는 것을 발견했다. DNA의 음의 수퍼 코일은 NER (25)에 의해 DNA 병변의 효율적인 제거를 촉진하기 위해 표시되었습니다, 우리는 HMGB1는 TFO 지시 ICL 함유 플라스틱으로에 우선적으로 부정적인 수퍼 코일을 유도하는 것을 발견했다NER 공동 인자로서 HMGB1의 잠재적 인 역할 (들)에 대한 이해를 제공한다 (비 손상된 플라스미드 기판에 대해) 중간 기판 (16). ICLS의 처리는 완전한 인간 세포에서 알려져 있지 않다; 따라서, 본 명세서에 기재된 분자 도구에 기초한 기술과 개발 분석 차례로 암 화학 요법의 효능을 향상시키기 위해 이용 될 수있는 바와 같이 약물 표적을 제공 할 수있다 ICL 수리에 관련된 추가적인 단백질의 동정을 초래할 수있다. 여기서, 효과적인 방법은 논의 된 아가 로스 겔 전기 영동을 변성하여 플라스미드 DNA의 TFO 지시 ICL 형성의 효율성을 평가. 또한, TFO 지시 ICLS를 포함하는 플라스미드를 사용하는 기술이 설명되었다 변성 칩 어 세이를 이용하여 셀룰러 환경에서 ICL 손상된 플라스미드 HMGB1 연관을 결정한다. 또한, 손쉬운 방법은 제 도입 위상 수정을 공부구체적으로는 인간 세포 용 해물에서 ICL 손상된 플라스미드 기판상의 전자 구조적 단백질 HMGB1은 이차원 아가 로스 겔 전기 영동을 통해 수퍼 코일 분석을 수행함으로써 측정되었다. 설명 된 기술은 인간 세포에서 플라스미드의 타겟 DNA 손상 처리에 DNA 수리 및 구조적 단백질 관여의 이해를 촉진하기 위해 사용될 수있다. 우리는 플라스미드 DNA, 이후 플라스미드 칩 각각 DNA 토폴로지 변경 병변과 연관 단백질 및 단백질을 확인하는 분석을 수퍼 코일에 TFO 지시 부위 특이 랄렌 ICLS의 형성에 대한 상세한 프로토콜을 설명한다. 이러한 분석은 다른 DNA 손상 제, TFOs 플라스미드 기판 및 관심 포유 동물 세포 라인을 수행하도록 변형 될 수있다. 사실, 우리는 적어도 하나의 전위와 친 화성이 높은 고유 TFO 결합 부위는 인간 게놈 26의 모든 주석 유전자 내에 있다는 것을 보여 주었다. 방법우리 케르 및 바스, 2016 (16)에 이용되는 것처럼 지금까지, 명확성을 위해, 우리는 인간 U2OS 세포에서 특정 돌연변이 리포터 플라스미드 (pSupFG1)의 특정 랄렌 공역 TFO (pAG30)의 사용을위한 이러한 기술을 설명했다.

<table><tbody><tr><td>5&#039;HMT Psoralen-AG30</td><td>Midland Certified Reagent Co., Midland, TX</td><td>Custom order</td><td>HPLC (or gel) purified</td></tr><tr><td>Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit</td><td>Cell signaling Inc.</td><td>9003</td><td>Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer.</td></tr><tr><td>GoTaq Green</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td>PCR master mix</td></tr><tr><td>HMGB1 antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab18256</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Gel and PCR cleanup kit</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Chloroquine-diphosphate salt</td><td>Sigma</td><td>C6628-50G</td><td>For two-dimensional agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>GenePORTER transfection reagent</td><td>Genlantis</td><td>T201015</td><td></td></tr><tr><td>Vaccinia Topoisomerase I</td><td>Invitrogen</td><td>38042-024</td><td></td></tr><tr><td>Blak-Ray long wave ultraviolet lamp</td><td>Upland, CA</td><td>B 100 AP</td><td>UVA lamp</td></tr><tr><td>EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100</td><td>Epigentek</td><td>EQC-1100</td><td>Water bath sonicator</td></tr><tr><td>Mylar filter</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>80112939</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6111</td><td></td></tr><tr><td>BIO-RAD Chemidoc</td><td>BIO-RAD</td><td>XRS+ system</td><td>DNA imaging system</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-25ML</td><td>Used for crosslinking&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td>Cell culture media</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70013073</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Bromocresol green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114-359</td><td>DNA loading dye</td></tr><tr><td>Siliconized tubes</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>02-681-320</td><td>Low retention microfuge tube</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A74-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24731</td><td></td></tr><tr><td>Photometer</td><td>InternationalLight Technologies</td><td>ILT1400-A</td><td>UVA dose measurement</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell lines&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human U2OS osteosarcoma</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-96</td><td>Cultured according to supplier&amp;rsquo;s recommendation</td></tr><tr><td>Human cervical adenocarcinoma HeLa</td><td>ATCC</td><td>ATCC-CCL-2</td><td>Cultured according to supplier&amp;rsquo;s recommendation</td></tr><tr><td>Proximal forward primer</td><td>5&amp;prime;-gcc ccc ctg acg agc atc ac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proximal reverse primer</td><td>5&amp;prime;-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Distal forward primer</td><td>5&amp;prime;-aat acc gcg cca cat agc ag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Distal reverse primer</td><td>5&amp;prime;-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tools to study the role of architectural protein hmgb1 in the processing of helix distorting, site-specific dna interstrand crosslinks

높은 이동성 그룹 상자 1 (HMGB1) 단백질은 전사, DNA 복제 및 DNA 수선 등 게놈 많은 중요한 기능을 조절에 관여하는 히스톤 비 구조적 단백질이다. HMGB1은 정식 B-DNA보다 더 높은 친화력과 구조적으로 왜곡 된 DNA에 결합한다. 예를 들어, 우리는 HMGB1은 DNA가 나선의 왜곡을 야기 공유 결합 DNA의 두 가닥을 연결 가교 (ICLS)를 interstrand, 왼쪽 경우 복구되지 않은 세포 사망을 일으킬 수에 결합하는 것을 발견했다. 때문에 자신의 세포 독성 잠재력, 여러 ICL 유도 에이전트는 현재 병원에서 화학 요법 제로서 사용된다. ICL-형성 제는 특정 염기 서열 (예, &#39;- TA-3 5&#39;는 소 랄렌에 대한 선호 가교 사이트)에 대한 환경 설정을 표시하는 동안, 그들은 크게 무차별 방식으로 DNA 손상을 유도한다. 그러나, 공유 결합 서열 - 특이 적으로 DNA에 결합하는 삼중 - 형성 올리고 뉴클레오티드 (TFO)에 ICL 유도제를 연결함으로써방법은 타겟 DNA 손상이 달성 될 수있다. 여기서는 도구로 사용할 돌연변이 리포터 플라스미드의 부위 특이 ICL을 생성하는 공유 8 trimethylpsoralen (HMT) 랄렌 5 &#39;은 4&#39;- 히드 록시 메틸 4,5&#39;말단에 컨쥬 게이션 TFO를 사용 인간의 세포에서 HMGB1에 의해 복잡한 DNA 병변의 건축 변경, 처리 및 수리를 공부합니다. 우리는 실험 기술 리포터 플라스미드에 TFO 지시 ICLS을 준비하고, 염색질 면역 침전 분석법을 사용하여 휴대 맥락에서 TFO 지시 ICLS와 HMGB1의 연결을 심문에 대해 설명합니다. 또, HMGB1 의해 소라렌 가교 플라스미드 도입 superhelical 회전의 양을 측정함으로써 손상된 DNA의 특정 구조적 변형을 평가하기 위해 수퍼 코일 DNA의 분석을 설명한다. 이러한 기술은 TFO 지시 ICLS 또는 관심있는 세포주 다른 타겟 DNA 손상의 복구 처리에 관여하는 다른 단백질의 역할을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

TFO 지시 ICL의 형성은 인간 세포에서 ICL 처리에서의 구조적 단백질의 역할을 심문하는 데 사용되는 플라스미드 기반 분석을 위해 중요하다. 아가 로스 겔 전기 영동을 변성하면 TFO 지시 ICL 형성의 효율성을 결정하기위한 용이 한 방법이다. TFO 지시 ICLS 은닉 플라스미드는 비 - 가교 결합 된 제어 플라스미드 (도 1a, 레인 2)에 비교하여, 아가 로스 겔 매트릭스 <str...

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Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.

도구 나선 왜곡, 사이트 별 DNA Interstrand 가교의 처리에 건축 단백질 HMGB1의 역할을 연구하는

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

tools-to-study-role-architectural-protein-hmgb1-processing-helix

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

8.2K 조회수.  The University of Texas at Austin. Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein. 

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Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

연구

유전학

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in mammalian cell lines. Rather than globally assaying removal of xenobiotic-induced or spontaneous chromosomal DPC removal, this assay examines the repair of a homogeneous, chemically defined lesion specifically introduced at one site within a plasmid DNA substrate. Importantly, this approach avoids the use of radioactive materials and is not dependent on expensive or highly-specialized technology. Instead, it relies on standard recombinant DNA procedures and widely available real-time, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) instrumentation. Given the inherent flexibility of the strategy utilized, the size of the crosslinked protein, as well as the nature of the chemical linkage and the precise DNA sequence context of the attachment site can be varied to address the respective contributions of these parameters to the overall efficiency of DPC repair. Using this method, plasmids containing a site-specific DPC were transfected into cells and low molecular weight DNA recovered at various times post-transfection. Recovered DNA is then subjected to strand-specific primer extension (SSPE) using a primer complementary to the damaged strand of the plasmid. Since the DPC lesion blocks Taq DNA polymerase, the ratio of repaired to un-repaired DNA can be quantitatively assessed using qPCR. Cycle threshold (CT) values are used to calculate percent repair at various time points in the respective cell lines. This SSPE-qPCR method can also be used to quantitatively assess the repair kinetics of any DNA adduct that blocks Taq polymerase.

The goal of this protocol is to quantify the repair of defined DNA-protein crosslinks on plasmid DNA. Lesioned plasmids are transfected into recipient mammalian cell lines and low-molecular weight harvested at multiple time points post-transfection. DNA repair kinetics are quantified using strand-specific primer extension followed by qPCR.

간단 하 고 빠른, 양적 분석 결과에 플라스 미드 DNA-단백질 Crosslinks의 측정 수리에 포유류 세포로 페

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

안녕하세요 - C : Genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

생물학

Ubiquitylated, SUMOylated 및 ADP-Ribosylated DNA-Protein Crosslinks 측정

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

저자 스포트라이트: DNA 단백질 교차결합의 정량적 검출 및 번역 후 변형(Post-Translational Modifications)  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

생화학

<meta charset="utf8"></head><body>ssDNA-RPA Tract Growth에서 관찰된 CMG 매개 DNA 풀기

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Unraveling the Dynamics of Eukaryotic DNA Replication Through Single-Molecule Visualization (단일 분자 시각화를 통한 진핵생물 DNA 복제의 역학 규명)

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

CMG Helicase를 이용한 DNA 풀림의 단일 분자 실시간 시각화

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

Capturing Common Fragile Site Breaks by Native &#947;H2A.X ChIP

Replication stress induced by exposure to extrinsic agents can lead to DNA breaks at common fragile sites, which are regions in the genome known to be prone to structural instability. The &#947;H2A.X chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay serves as a powerful tool in genotoxicity studies, as &#947;H2A.X phosphorylation is a well-established marker for DNA double-strand breaks. Traditional &#947;H2A.X ChIP assays, however, are often labor-intensive and involve multiple, time-consuming steps. In this study, we present a simplified yet effective method that combines subcellular fractionation with native ChIP to isolate &#947;H2A.X-associated complexes. This approach is particularly suitable for analyzing &#947;H2A.X-chromatin interactions with enhanced specificity and efficiency. Using subcellular fractionation, chromatin-unbound materials are effectively removed, resulting in a purified chromatin fraction. Subsequent micrococcal nuclease (MNase) digestion under mild conditions allows chromatin fragmentation while preserving physiological interactions between &#947;H2A.X and its associated protein complexes. This preservation is essential for studying native interaction partners involved in DNA damage response pathways. This optimized native ChIP protocol substantially reduces the time and labor associated with conventional &#947;H2A.X ChIP assays. The streamlined procedure not only simplifies the workflow but also yields highly reproducible results, making it particularly advantageous in settings where high-throughput processing of multiple samples is required. This method has broad applicability in studies focused on genome stability, DNA repair, and chromatin biology, where accurate and efficient detection of DNA damage sites is critical. By employing optimized protocols and streamlined steps, this method enables the detection of DNA damage at fragile sites with improved sensitivity and minimal sample handling, making it a valuable tool for studies on genome stability and DNA damage response.

We present a rapid and efficient method to detect common fragile site breaks through native &#947;H2A.X chromatin immunoprecipitation (ChIP). This approach significantly reduces both the time and labor associated with traditional &#947;H2A.X ChIP assays while maintaining high reproducibility and reliability of results.

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