著者らは、有用な議論のためにバスケスの研究室のメンバーに感謝したいと思います。この作品は、健康/国立癌研究所【KMVにCA097175、CA0​​93279]の国立研究所によってサポートされていました。がん予防テキサス州の研究所[RP101501]と。健康/国立がん研究所の国立研究所[KMVにCA093279]：オープンアクセスチャージのための資金。

プラスミド基板上TFO指向のICLの調製<ol><li> 10,11 DNA三重結合緩衝液[50％グリセロール、10mMトリス（pHは7.6）、10 mMの塩化マグネシウムの8μlのソラレン共役TFO AG30と（5μgのプラスミドDNAが良い出発点である）プラスミドpSupFG1の等モル量をインキュベート2]とのdH 2 O琥珀色のチューブで40μlの最終体積に。ピペッティングにより完全に混和します。 12時間37℃の水浴で反応をインキュベートします。 </li><li>フルパワー出力を確保するために、UVAランプをウォームアップ。パラフィンフィルム上の三重反応を置き、UVA（365 nM）をランプの下で氷の上にパラフィンフィルムを配置します。ランプと反応の間にマイラーフィルタを配置します。 </li><li> UVAは1.8 J / cm 2の総線量のために照射します。さらなる使用のために4℃でサンプルを保管してください。 注意：UVA照射との適切な保護メガネや服を着用してください。 </li><li>再で上記で調製したプラスミド200ngの線形化メーカーを使用して20μlの総容量で締め付け酵素エコ R1は10倍のバッファを供給しました。熱は65℃で20分間、酵素を変性させます。万×gで10分間サンプルをスピンし、4℃で保存します。 </li><li> 50倍のアルカリ性緩衝液[1.5 MのNaOH、50mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）]を準備します。 50ミリリットルのdH 2 Oにアガロースの0.5 mgの追加アガロースを溶解し、50℃の水浴中に配置する沸騰。 </li><li>溶解したアガロースの温度がダウンして50℃にした後、50倍のアルカリ性緩衝液1mlを追加し、それを混合し、次いでゲルトレイにゲルを注ぎます。ゲルは使用前に室温で固化するための時間を許可します。 </li><li>線形化DNAサンプルの20μlに0.5 M EDTAの4μlを添加して、室温で10分間インキュベートします。 </li><li>サンプルに1 kbのDNAラダーに6倍のアルカリ性ゲルローディングバッファー（300mMのNaOHを、6 mMのEDTA、18％（ の dH 2 Oでv）の高分子量の多糖類、0.06％ブロモクレゾールグリーン/ワット）を追加します。 注：これは、6倍のアルカリ性ゲルローディング緩衝液を使用することが重要である、議論を参照してください。 </li><li>ロード低温室でゲル上にサンプルおよびセンチあたり3.2ボルトで一晩、1×アルカリ性緩衝液（12-16時間）で実行します。サンプルがゲルを入力したら、浮動からそれを防ぐために、ゲルの上にガラス板を配置します。 </li><li>室温で45分間中和緩衝液にゲルを浸漬することにより、サンプルを中和する[1 Mトリス-Cl（pHは7.6）、1.5 MのNaCl、3 M酢酸ナトリウム（pH5.2）]。 </li><li>室温で1時間、50 mlの水に1％のエチジウムブロマイド（EtBrを）4μlのDNAのためのゲルを染色します。 15分間水で脱色。イメージングシステムを使用してDNAを可視化します。 注意：EtBrをが強力な変異原であり、皮膚から吸収することができます。 EtBrをとの直接の接触を避けます。 </li></ol>ヒト細胞におけるTFO指向ICL含有プラスミドの2トランスフェクションおよび免疫沈降<ol><li>プレート40万哺乳動物細胞（ 例えば、U2OS Oダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中の60 mmディッシュ当たりsteosarcoma細胞）を24時間トランスフェクションの前に、抗生物質を含まない、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充しました。 5％CO 2で37℃で一晩細胞をインキュベートします。 </li><li>水浴中で37℃にトランスフェクション、暖かい増殖培地、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の前に。室温へのトランスフェクション試薬を温めます。 </li><li>で10分間丸底チューブ個別の14ミリリットルで1倍の増殖培地（ミックス1）500μlの1倍速の増殖培地（ミックス2）500μlの中でTFO指向ICL-含むプラスミド2μgのトランスフェクション試薬30μlのインキュベート室温。 </li><li>上下にピペッティングによりよく混ぜ、2を混合するミックス1を追加します。室温で25-30分間インキュベートします。 </li><li>温かいPBSで細胞を2回洗浄します。細胞のプレート全体に均等に分配する滴下方式でトランスフェクションミックスを追加します。プレートに増殖培地の1ミリリットルを追加し、2ミリリットルの最終容量をもたらします。私たちを混ぜますLL。 4時間、5％CO 2で37℃インキュベーターで培養プレートを置きます。 </li><li> 10％FBSを添加し3ミリリットルの成長培地で培地を交換し、16時間さらにインキュベートします。抗生物質を使用しないでください。 </li><li>約1％の最終濃度になるように、プレート当たり37％の新鮮なホルムアルデヒドの80μlの細胞を処理し、光の不存在下で、室温で10分間インキュベートします。 注意：ホルムアルデヒドは有毒であり、その安全上の指示に従って処理してください。ホルムアルデヒド暴露は皮膚、眼、気道に害を引き起こす可能性があります。 </li><li>プレートあたり（市販のキットに付属）チルドグリシンの300μLを添加し、5分間インキュベートすることによりホルムアルデヒド架橋をクエンチしました。メディアを取り出し、冷却PBSで2回洗浄し、その後マイクロ遠心チューブにチルド（4°C）PBS 1ml中でこすることによって細胞を収集します。すべての回で氷上でサンプルを保管してください。 </li><li> 5分Aに対して、4℃で遠心分離して細胞ペレットを準備卓上冷却遠心機を使用して13,400×gでのtは。ピペットで上清アウトし、氷上で細胞ペレットを配置します。 </li><li>均一に1ミリリットル冷蔵（4°C）緩衝液A（市販のキットに付属）にペレットを再懸濁し、氷上で10分間インキュベートします。チューブを反転させて時折混ぜます。細胞をペレット化前と同じように（上記のステップ2.9を参照してください）。 </li><li>均一に1ミリリットル冷蔵（4°C）緩衝液B（市販のキットに付属）にペレットを再懸濁し、反転させることにより、時々混ぜながら10分間氷上でインキュベートします。以前のように遠心分離により細胞をペレット化（上記のステップ2.9を参照してください）。 </li><li>チルド緩衝液Bは、ミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）の2μlを添加して、10分間室温でインキュベート200μl中、再び細胞を再懸濁。チューブをフリックすることによって時折反応を混ぜます。チューブを氷上に置き、40mMのEDTAを添加することにより、MNase反応を停止します。細胞をペレット化前と同じように（上記のステップ2.9を参照してください）。 </li><li> 100μlの1×クロマチンimmunoprで細胞を再懸濁しプロテアーゼ阻害剤カクテルを補充しecipitationバッファ（チップ）のバッファ（市販のキットに付属）。 </li><li>薄壁マイクロチューブに再懸濁した細胞を置きます。氷上で20秒間インキュベートした20秒間水浴超音波処理装置上に浮遊させることによって、サンプルを超音波処理します。繰り返し超音波処理は〜800-1,200 bpの断片を生成するために、9回を繰り返します。 <ol><li>超音波処理したサンプルの20μlにボルテックスでよく3μlの5 M NaClおよび1μlのRNase A.ミックスを追加し、37℃で30分間インキュベートします。続いて、2μlのプロテ​​イナーゼKを追加し、65℃で2時間インキュベートします。 PCR精製キットを用いてサンプルを精製します。 1％アガロースゲル上でサンプルを実行し、EtBrで可視化することができます。 注：得られたDNAの最大強度は千塩基対で、またはの下でなければなりません。 </li></ol></li><li> 3つの別々のチューブでは、予め冷却シリコーン処理チューブ内の溶解液の30μlを添加し、その後追加されたプロテアーゼ阻害剤で冷やした1×チップバッファの70μlを添加します。 1μを追加各チューブに、抗免疫グロブリンG（IgG）（陽性対照として）、抗ヒストンH3、または抗HMGB1抗体のG。連続回転と低温室で一晩インキュベートします。 </li><li>寒い部屋に均一に再懸濁プロテインGビーズ。チューブあたりプロテインGビーズの4μlを添加して、回転と寒い部屋で別の2〜4時間インキュベートします。 </li><li>磁気ラックを使用して、ビーズをペレット化し、上清を除去します。ペレットにプロテアーゼ阻害剤カクテルと混合し、200μlの1×チップバッファを追加し、回転と寒い部屋で5分間洗浄します。二回洗浄を繰り返します。 </li><li>高塩1×チップバッファ（70mMのNaClを含む）で一つの追加の洗浄を行います。 </li><li> （市販のキットで供給される）160μlの溶出緩衝液でペレットを再懸濁し、30分間回転させながら37℃でインキュベートします。 </li><li>ビーズをペレット化し、新しいチューブに上清を収集します。 5 M NaClを6μlのプロテ​​イナーゼKの2μLを追加し、65で一晩インキュベート°C。 </li><li> PCR産物精製キットを用いてDNAを精製し、50μlののdH 2 Oを用いてDNAを溶出</li><li>関心領域にプライマーセットを用いてPCR反応を16（s）を行い、EtBrで染色した1％アガロースゲル上で製品を解決します。 </li></ol> 3.超らせんアッセイおよび2次元アガロースゲル電気泳動<ol><li> DNA修復合成バッファを準備します（45 mMのヘペス-KOH、pHが7.8; 70のKCl、7.4のMgCl 2、0.9mMのDTT、0.4mMのEDTA、2mMのATP、20μMのdNTP、3.4％グリセロール及び18μgのウシ血清アルブミン） 。 -80℃で保管してください。氷上で解凍し、40mMのクレアチンリン酸と2.5μgのクレアチンホスホキナーゼを追加し、使用前に。 </li><li> 10倍の超らせんバッファー[500 mMトリス（pHは8.0）、500mMのNaCl、25mMのMgCl 2を、1 mMのEDTA]を用意し、常温で保存。 </li><li>完全に1倍で1μlのワクシニアトポイソメラーゼI（5-15 U /μl）を使用して、スーパーコイルプラスミドpSupFG1 DNAの300 ngのを線形化10μlの反応における超らせんバッファー。 37℃で1時間混合物をインキュベートします。 </li><li> HeLa細胞を含まない抽出物24は、氷上で解凍します。完全にリラックスしたプラスミドに、25μlのHeLa細胞を含まない抽出物とDNA修復合成バッファを追加します。よく混ぜます。ミックスにワクシニアトポイソメラーゼIの追加の1μl加え、37℃で1時間インキュベートします。 </li><li>ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）（1％最終濃度）およびプロテイナーゼK（0.25ミリグラム/ mlの最終濃度）を加えることにより反応を終了させます。 2時間65℃でインキュベートします。 </li><li> 1×トリスホウ酸EDTA（TBE）緩衝液を用いて1％アガロースゲルをキャストします。 DNAローディング色素を追加し、少なくとも4レーン離れてゲル上に直接反応をロードします。トポイソマーを解決するために、室温で1×TBE中の2 V / cmの（次元1）で8-10時間のためのゲルを実行します。 注：トリス塩基の54グラムを追加することによって、のdH 2 Oの1 Lで5倍TBEストック溶液を準備します。ホウ酸の27.5グラムと0.5 M EDTA（pH8.0）を20ミリリットル。 </li><li> 1×2リットルを準備3 / mlのクロロキンリン酸とTBE。 20分間この溶液200mlにゲルを浸します。アルミホイルでゲルトレイをカバーしています。 </li><li>二次元でゲルを電気泳動するために、時計回りにゲル90°回転し、正と負の超らせんを解決するために、1×TBEを含むクロロキンで2 V / cmので4-6時間のためにそれを実行します。 </li><li>ロッカー上で1時間、EtBrでゲルを染色。 15分間の dH 2 Oを用いてゲルを脱色し、その後イメージャーを使用してトポイソマーの熱分布を可視化します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Moser, H. E., Dervan, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+cleavage+of+double+helical+DNA+by+triple+helix+formation.">Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation.</a> Science. 238, 645-650 (1987).</li><li>Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+oligonucleotide+binding+represses+transcription+of+the+human+c-myc+gene+in+vitro.">Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro.</a> Science. 241, 456-459 (1988).</li><li>Beal, P. A., Dervan, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+structural+motif+for+recognition+of+DNA+by+oligonucleotide-directed+triple-helix+formation.">Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation.</a> Science. 251, 1360-1363 (1991).</li><li>Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+targeting+at+short+polypurine+sites+by+cationic+triplex-forming+oligonucleotides.">Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides.</a> J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).</li><li>Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+XPA+and+RPA+DNA+repair+proteins+participate+in+specific+recognition+of+triplex-induced+helical+distortions.">Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).</li><li>Mukherjee, A., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplex+technology+in+studies+of+DNA+damage,+DNA+repair,+and+mutagenesis.">Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis.</a> Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).</li><li>Chin, J. Y., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+DNA+lesions+associated+with+triplex-forming+oligonucleotides.">Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides.</a> Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).</li><li>Seidman, M. M., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+for+gene+repair+via+triple+helix+formation.">The potential for gene repair via triple helix formation.</a> J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).</li><li>Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+and+processing+of+site-specific+DNA+interstrand+crosslinks.">Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks.</a> Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).</li><li>Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+mammalian+cells+mediated+by+intracellular+triple+helix+formation.">Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation.</a> Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).</li><li>Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+in+mammalian+cells+induced+by+triple+helix+formation+and+transcription-coupled+repair.">Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair.</a> Science. 271, 802-805 (1996).</li><li>Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+function+of+XPC+protein+in+psoralen+and+cisplatin-mediated+DNA+repair+and+mutagenesis.">Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis.</a> Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).</li><li>Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoralen-induced+DNA+interstrand+cross-links+block+transcription+and+induce+p53+in+an+ataxia-telangiectasia+and+rad3-related-dependent+manner.">Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner.</a> Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).</li><li>Vare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interstrand+crosslinks+induce+a+potent+replication+block+followed+by+formation+and+repair+of+double+strand+breaks+in+intact+mammalian+cells.">DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells.</a> DNA repair. 11, 976-985 (2012).</li><li>Huang, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+crosslinking+damage+and+cancer+-+a+tale+of+friend+and+foe.">DNA crosslinking damage and cancer - a tale of friend and foe.</a> Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).</li><li>Mukherjee, A., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGB1+interacts+with+XPA+to+facilitate+the+processing+of+DNA+interstrand+crosslinks+in+human+cells.">HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells.</a> Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).</li><li>Bidney, D. L., Reeck, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+from+cultured+hepatoma+cells+of+two+nonhistone+chromatin+proteins+with+preferential+affinity+for+single-stranded+DNA:+apparent+analogy+with+calf+thymus+HMG+proteins.">Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins.</a> Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).</li><li>Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recognition+of+cruciform+DNA+by+nuclear+protein+HMG1.">Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1.</a> Science. 243, 1056-1059 (1989).</li><li>Jung, Y., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+full-length+HMGB1+binding+to+cisplatin-modified+DNA.">Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA.</a> Biochemistry. 42, 2664-2671 (2003).</li><li>Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+human+high+mobility+group+protein+1+and+replication+protein+A+on+psoralen-cross-linked+DNA.">Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA.</a> Biochemistry. 44, 4188-4195 (2005).</li><li>Das, D., Scovell, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+binding+interaction+of+HMG-1+with+the+TATA-binding+protein/TATA+complex.">The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex.</a> J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).</li><li>Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+recruitment+of+HMGB1+during+V(D)J+recombination+through+interactions+with+RAG1+and+DNA.">Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA.</a> Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).</li><li>Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mobility+group+protein+B1+enhances+DNA+repair+and+chromatin+modification+after+DNA+damage.">High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).</li><li>Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+HMGB1+directly+facilitates+interactions+between+nucleotide+excision+repair+proteins+on+triplex-directed+psoralen+interstrand+crosslinks.">Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks.</a> DNA repair. 8, 865-872 (2009).</li><li>Park, J. Y., Ahn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+DNA+topology+on+plasmid+DNA+repair+in+vivo.">Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo.</a> FEBS letters. , 174-178 (2000).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+triplex-forming+oligonucleotide+target+sequences+in+mammalian+genomes.">High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes.</a> Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).</li><li>Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mobility+group+protein+1+preferentially+conserves+torsion+in+negatively+supercoiled+DNA.">High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA.</a> Biochemistry. 28, 5658-5664 (1989).</li><li>Betous, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+TLS+DNA+polymerases+eta+and+kappa+in+processing+naturally+occurring+structured+DNA+in+human+cells.">Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells.</a> Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).</li><li>Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+intrachromosomal+gene+conversion+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+microinjected+into+mouse+cells.">High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).</li><li>Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+mutations+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+in+mammalian+cells.">Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).</li><li>Puri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+number+of+2'-O-(2-aminoethyl)+residues+required+for+gene+knockout+activity+by+triple+helix+forming+oligonucleotides.">Minimum number of 2'-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides.</a> Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).</li><li>Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+oncogenes+to+improve+breast+cancer+chemotherapy.">Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy.</a> Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).</li><li>Boulware, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplex-forming+oligonucleotides+targeting+c-MYC+potentiate+the+anti-tumor+activity+of+gemcitabine+in+a+mouse+model+of+human+cancer.">Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer.</a> Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).</li></ol>

The authors declare no conflict of interest.

そのターゲットに依存TFOの結合親和性に応じて、その標的DNA基質（とまず、適切な緩衝成分（ 例えば 、 塩化マグネシウム）とTFOのインキュベーション時間：TFO指向のICLの効率的な形成は、二つの重要な要因に依存していますデュプレックス、および使用される濃度）。第二、UVA（365 nm）の照射の適切な用量は、効率的にソラレン架橋を形成します。最適な三重らせん形成は?...

三重らせん構造1-5を形成するためのトリプレックス形成オリゴヌクレオチドフーグスティーン水素結合を介した配列特異的様式で（のTFO）結合二本鎖DNA。三重技術は、転写、DNA損傷修復、ならびに遺伝子ターゲティング（参考文献6-8に概説）などの生体分子メカニズムの多様を調べるために使用されています。 TFOは、レポータープラスミド9,10-の部位特異的な損傷を誘導するために広く使用されています。私たちの研究室などは以前に、プラスミドpSupFG1 5,10-12にsupF遺伝子に部位特異的なDNAの間架橋（のICL）を誘導するためにソラレン分子につながTFO、AG30を、使用しています。これらの病変は、共有結合で2本のDNA鎖を架橋として、および未修復のままの場合のICLは、遺伝子の転写を阻止し、DNA複製機構13,14を妨げることができ、非常に細胞毒性です。なぜなら、それらの細胞毒性ポテンシャルを、ICL誘導剤は、治療において化学療法剤として使用されています癌やその他の病気15の。しかしながら、ヒト細胞中でのICLの加工及び修復は十分に理解されていません。したがって、ヒト細胞中のICLの処理に関与するメカニズムのより良い理解は、ICLベースの化学療法レジメンの有効性を改善するのに役立ち得ます。 TFO誘発性のICLとその修復中間体は、DNAヘリックスに有意な構造的歪みを引き起こす可能性を持っています。このような歪みは、標準的なB型二重鎖DNA 16-20よりも高い親和性で歪んだDNAに結合建築タンパク質、その考えられる標的です。ここでは、クロマチン免疫沈降（チップ）ソラレン架橋のプラスミド上のアッセイによって、ヒト細胞中でのICLと非常に豊富な建築タンパク質の結合、HMGB1を学び、ヒトにおいてソラレン架橋プラスミドDNAのトポロジーを調節することでHMGB1の役割を同定し癌細胞溶解物。 HMGB1は非常に豊富かつ普遍的に発現された非彼損傷したDNAに結合するトーン建築タンパク質および標準的なB型DNA 17-20よりも高い親和性を持つ代わりに構造化されたDNA基質。 HMGB1は、転写、DNA複製、DNA修復16,21-23などのいくつかのDNA代謝過程に関与しています。我々は以前HMGB1は高親和性20でインビトロで TFO指向のICLに結合することを実証しています。さらに、我々は、HMGB1の欠如はTFO指向のICLの変異原処理を増加し、ヌクレオチド除去修復（NER）補因子23,24としてHMGB1を同定していることを実証しました。最近、我々は、HMGB1がヒト細胞においてTFO向けのICLに関連付けられており、このような病変への募集はNERタンパク質、XPA 16に依存していることを発見しました。 DNAの負の超らせんをNER 25によりDNA損傷の効率的な除去を促進することが示されており、我々は、HMGB1はTFO指向ICL含有のPLAに優先的に負の超らせん形成を誘導することを発見しました（非損傷プラスミド基質に対して）、中間基板16、NER補因子としてHMGB1の潜在的な役割（複数可）のより良い理解を提供します。 ICLの処理は、完全ヒト細胞では理解されていません。このように、本明細書中に記載の分子ツールに基づいて開発された技術およびアッセイは、順番に、がん化学療法レジメンの有効性を改善するために利用することができる薬理学的標的として役立つ可能性がある、ICL修復に関与する追加のタンパク質の同定につながる可能性があります。 ここでは、アガロースゲル電気泳動を変性させることによって、プラスミドDNAでTFO指向ICL形成の効率を評価するための効果的なアプローチが検討されています。さらに、TFO指向のICLを含むプラスミドを用いて、修飾のChIPアッセイを用いて細胞の文脈でICL損傷プラスミドでHMGB1の結合を決定するための技術が記載されています。また、容易な方法は、番目によって導入されたトポロジカル修正を研究します特にヒト細胞溶解物中のICL損傷プラスミド基板上の電子建築タンパク質HMGB1は、二次元のアガロースゲル電気泳動を介して、スーパーコイルアッセイを実施することによって決定されています。説明される技術は、ヒト細胞中でのプラスミドの標的DNA損傷の処理において、DNA修復および建築タンパク質の関与の理解を促進するために使用することができます。 我々は、プラスミドDNA、及びその後のプラスミドチップそれぞれ、DNAのトポロジーを改変病変と会合するタンパク質、およびタンパク質を同定するためのアッセイをスーパーコイルのTFO-部位特異的ソラレンのICLを形成するための詳細なプロトコルを記述する。これらのアッセイは、他のDNA損傷剤、のTFO、プラスミド基質、および目的の哺乳動物細胞株を使用して実行するように変更することができます。実際に、我々はヒトゲノム26内のすべての注釈付き遺伝子内の少なくとも一つの潜在的な固有かつ高親和性のTFO結合部位が存在することを示しています。どうやって我々はムカジー＆バスケス、2016年16で利用してきたように、これまで、分かりやすくするために、我々は人間のU2OS細胞に特異的な変異レポータープラスミド（pSupFG1）上の特定のソラレン共役TFO（pAG30）を使用するためにこれらの技術を説明しました。

<table><tbody><tr><td>5&#039;HMT Psoralen-AG30</td><td>Midland Certified Reagent Co., Midland, TX</td><td>Custom order</td><td>HPLC (or gel) purified</td></tr><tr><td>Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit</td><td>Cell signaling Inc.</td><td>9003</td><td>Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer.</td></tr><tr><td>GoTaq Green</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td>PCR master mix</td></tr><tr><td>HMGB1 antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab18256</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Gel and PCR cleanup kit</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Chloroquine-diphosphate salt</td><td>Sigma</td><td>C6628-50G</td><td>For two-dimensional agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>GenePORTER transfection reagent</td><td>Genlantis</td><td>T201015</td><td></td></tr><tr><td>Vaccinia Topoisomerase I</td><td>Invitrogen</td><td>38042-024</td><td></td></tr><tr><td>Blak-Ray long wave ultraviolet lamp</td><td>Upland, CA</td><td>B 100 AP</td><td>UVA lamp</td></tr><tr><td>EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100</td><td>Epigentek</td><td>EQC-1100</td><td>Water bath sonicator</td></tr><tr><td>Mylar filter</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>80112939</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6111</td><td></td></tr><tr><td>BIO-RAD Chemidoc</td><td>BIO-RAD</td><td>XRS+ system</td><td>DNA imaging system</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-25ML</td><td>Used for crosslinking&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td>Cell culture media</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70013073</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Bromocresol green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114-359</td><td>DNA loading dye</td></tr><tr><td>Siliconized tubes</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>02-681-320</td><td>Low retention microfuge tube</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A74-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24731</td><td></td></tr><tr><td>Photometer</td><td>InternationalLight Technologies</td><td>ILT1400-A</td><td>UVA dose measurement</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell lines&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human U2OS osteosarcoma</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-96</td><td>Cultured according to supplier&amp;rsquo;s recommendation</td></tr><tr><td>Human cervical adenocarcinoma HeLa</td><td>ATCC</td><td>ATCC-CCL-2</td><td>Cultured according to supplier&amp;rsquo;s recommendation</td></tr><tr><td>Proximal forward primer</td><td>5&amp;prime;-gcc ccc ctg acg agc atc ac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proximal reverse primer</td><td>5&amp;prime;-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Distal forward primer</td><td>5&amp;prime;-aat acc gcg cca cat agc ag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Distal reverse primer</td><td>5&amp;prime;-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tools to study the role of architectural protein hmgb1 in the processing of helix distorting, site-specific dna interstrand crosslinks

高移動度グループボックス1（HMGB1）タンパク質は、転写、DNA複製、DNA修復などのゲノム中の多くの重要な機能を調節することに関与する非ヒストン建築タンパク質です。 HMGB1は、標準的なB-DNAへのより高い親和性を有する構造的に歪んだDNAに結合します。例えば、我々は、HMGB1がDNAに結合することがわかった共有結合、DNAの2本鎖をリンクらせんの歪みを引き起こし、未修復のままの場合は細胞死を引き起こす可能性が架橋（のICL）を、インター。それらの細胞毒性ポテンシャルを、いくつかのICL誘導剤は、現在臨床での化学療法剤として使用されます。 ICL形成剤は、特定の塩基配列の環境（ 例えば、5&#39;-TA-3 &#39;ソラレンのための好ましい架橋部位である）を示すが、それらは主に無差別様式でDNA損傷を誘発します。しかし、共有結合的に配列特異的にDNAに結合する三重鎖形成オリゴヌクレオチド（TFO）、にICL誘導剤を結合することにより、方法は、標的DNAの損傷を達成することができます。ここでは、ツールとして使用するために変異レポータープラスミド上のサイト固有のICLを生成するために、共有結合、8トリメチルソラレン（HMT）ソラレン5 &#39;、4&#39;-ヒドロキシメチル-4,5-へ&#39;末端に結合させTFOを使用しますアーキテクチャの変更、処理、およびヒト細胞におけるHMGB1による複雑なDNA損傷の修復を研究します。私たちは、レポータープラスミドにTFO指向のICLを調製するための、およびクロマチン免疫沈降アッセイを用いて、細胞の状況にTFO指向のICLとHMGB1の関連を調べるために実験技術について説明します。また、我々はHMGB1によってソラレン架橋プラスミドに導入超らせん巻きの量を測定することにより、損傷を受けたDNAの特定の建築変更を評価するために、DNAの超らせんのアッセイが記載されています。これらの技術は、TFO指向のICLまたは目的の任意の細胞株における他の標的DNA損傷処理および修復に関与する他のタンパク質の役割を研究するために使用することができます。

TFO指向ICLの形成はヒト細胞でICL処理の建築タンパク質の役割を調べるために使用されているプラ​​スミドに基づくアッセイ、のために重要です。変性アガロースゲル電気泳動は、TFO指向ICL形成の効率を決定するための容易な方法です。非架橋対照プラスミド（ 図1A、レーン2）と比較した場合TFO指向のICLを保有するプラスミドをアガロースゲルマトリッ...

Watch this Scientific Journal Video about Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks at JoVE.com

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.

ツールは、Helix歪曲、部位特異的DNA鎖間架橋の処理に建築タンパク質HMGB1の役割を研究するために

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

tools-to-study-role-architectural-protein-hmgb1-processing-helix

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

8.2K ビュー.  The University of Texas at Austin. Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein. 

ビデオ: Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

405 Nm レーザ マイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

遺伝学

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in mammalian cell lines. Rather than globally assaying removal of xenobiotic-induced or spontaneous chromosomal DPC removal, this assay examines the repair of a homogeneous, chemically defined lesion specifically introduced at one site within a plasmid DNA substrate. Importantly, this approach avoids the use of radioactive materials and is not dependent on expensive or highly-specialized technology. Instead, it relies on standard recombinant DNA procedures and widely available real-time, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) instrumentation. Given the inherent flexibility of the strategy utilized, the size of the crosslinked protein, as well as the nature of the chemical linkage and the precise DNA sequence context of the attachment site can be varied to address the respective contributions of these parameters to the overall efficiency of DPC repair. Using this method, plasmids containing a site-specific DPC were transfected into cells and low molecular weight DNA recovered at various times post-transfection. Recovered DNA is then subjected to strand-specific primer extension (SSPE) using a primer complementary to the damaged strand of the plasmid. Since the DPC lesion blocks Taq DNA polymerase, the ratio of repaired to un-repaired DNA can be quantitatively assessed using qPCR. Cycle threshold (CT) values are used to calculate percent repair at various time points in the respective cell lines. This SSPE-qPCR method can also be used to quantitatively assess the repair kinetics of any DNA adduct that blocks Taq polymerase.

The goal of this protocol is to quantify the repair of defined DNA-protein crosslinks on plasmid DNA. Lesioned plasmids are transfected into recipient mammalian cell lines and low-molecular weight harvested at multiple time points post-transfection. DNA repair kinetics are quantified using strand-specific primer extension followed by qPCR.

シンプル、迅速、かつ定量的アッセイのプラスミド dna-タンパク質クロスリンクのメジャー修理に哺乳類細胞にトランスフェクション

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

ハイC：ゲノムの三次元構造を研究する方法。

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

生物学

ユビキチン化、SUMO化、およびADPリボシル化DNA-タンパク質架橋の測定

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

著者スポットライト:DNAタンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

生化学

<meta charset="utf8"></head><body>ssDNA-RPAトラクト成長によるCMG媒介DNA巻き戻しの観察

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:真核生物のDNA複製のダイナミクスを解明する:単一分子の可視化による

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

CMGヘリカーゼによるDNA巻き戻しの1分子リアルタイム可視化

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

Capturing Common Fragile Site Breaks by Native &#947;H2A.X ChIP

Replication stress induced by exposure to extrinsic agents can lead to DNA breaks at common fragile sites, which are regions in the genome known to be prone to structural instability. The &#947;H2A.X chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay serves as a powerful tool in genotoxicity studies, as &#947;H2A.X phosphorylation is a well-established marker for DNA double-strand breaks. Traditional &#947;H2A.X ChIP assays, however, are often labor-intensive and involve multiple, time-consuming steps. In this study, we present a simplified yet effective method that combines subcellular fractionation with native ChIP to isolate &#947;H2A.X-associated complexes. This approach is particularly suitable for analyzing &#947;H2A.X-chromatin interactions with enhanced specificity and efficiency. Using subcellular fractionation, chromatin-unbound materials are effectively removed, resulting in a purified chromatin fraction. Subsequent micrococcal nuclease (MNase) digestion under mild conditions allows chromatin fragmentation while preserving physiological interactions between &#947;H2A.X and its associated protein complexes. This preservation is essential for studying native interaction partners involved in DNA damage response pathways. This optimized native ChIP protocol substantially reduces the time and labor associated with conventional &#947;H2A.X ChIP assays. The streamlined procedure not only simplifies the workflow but also yields highly reproducible results, making it particularly advantageous in settings where high-throughput processing of multiple samples is required. This method has broad applicability in studies focused on genome stability, DNA repair, and chromatin biology, where accurate and efficient detection of DNA damage sites is critical. By employing optimized protocols and streamlined steps, this method enables the detection of DNA damage at fragile sites with improved sensitivity and minimal sample handling, making it a valuable tool for studies on genome stability and DNA damage response.

We present a rapid and efficient method to detect common fragile site breaks through native &#947;H2A.X chromatin immunoprecipitation (ChIP). This approach significantly reduces both the time and labor associated with traditional &#947;H2A.X ChIP assays while maintaining high reproducibility and reliability of results.

ネイティブγH2Aによる一般的な脆弱サイトブレークのキャプチャ。X ChIPの

Replication stress induced by exposure to extrinsic agents can lead to DNA breaks at common fragile sites, which are regions in the genome known to be ...

ツールは、Helix歪曲、部位特異的DNA鎖間架橋の処理に建築タンパク質HMGB1の役割を研究するために

要約

さらに動画を探す

この動画の章

405 Nm レーザマイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

シンプル、迅速、かつ定量的アッセイのプラスミド dna-タンパク質クロスリンクのメジャー修理に哺乳類細胞にトランスフェクション

ハイC：ゲノムの三次元構造を研究する方法。

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

CMGヘリカーゼによるDNA巻き戻しの1分子リアルタイム可視化

CMGヘリカーゼによるDNA巻き戻しの1分子リアルタイム可視化

CMGヘリカーゼによるDNA巻き戻しの1分子リアルタイム可視化

ネイティブγH2Aによる一般的な脆弱サイトブレークのキャプチャ。X ChIPの

ツールは、Helix歪曲、部位特異的DNA鎖間架橋の処理に建築タンパク質HMGB1の役割を研究するために

要約

さらに動画を探す

この動画の章

405 Nm レーザ マイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

シンプル、迅速、かつ定量的アッセイのプラスミド dna-タンパク質クロスリンクのメジャー修理に哺乳類細胞にトランスフェクション

ハイC：ゲノムの三次元構造を研究する方法。

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

CMGヘリカーゼによるDNA巻き戻しの1分子リアルタイム可視化

CMGヘリカーゼによるDNA巻き戻しの1分子リアルタイム可視化

CMGヘリカーゼによるDNA巻き戻しの1分子リアルタイム可視化

ネイティブγH2Aによる一般的な脆弱サイトブレークのキャプチャ。X ChIPの

405 Nm レーザマイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査