Name: light-mediated formation and patterning of hydrogels for cell culture applications
Uploaded: 2016-09-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
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이 작품은 약 발견과 (각각 P20GM104316 및 P30의 GM110758-01) 국민 건강의 국립 연구소에서 장군 의학 연구소에서 제도 개발 수상에 의해 자금 고급 생체 적합 물질, 퓨 자선 트러스트에서 델라웨어 코 브레 프로그램에 의해 지원되었다 (00026178), 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 경력 상 (DMR-1253906)에 버로우즈 웰컴 기금 (1,006,787), 델라웨어 대학의 국립 과학 재단 (National Science Foundation) IGERT SBE2 프로그램 (L. Sawicki 씨에 교제). 저자는 공 초점 현미경에 대한 교육과 액세스를 위해 델라웨어 대학의 델라웨어 생명 공학 연구소 BioImaging 센터 감사, 미스 캐서린 윌 에이 비디오 촬영하는 동안 도움 씨 마태 복음 Rehmann 관대 골수, 교수 크리스토퍼 J에서 분리 된 중배엽 줄기 세포를 제공하는 자동 플레이트 리더를 사용합니다. Kloxin 씨 스티븐 마 관대하게 제공하는 포토 마스크, 그리고 교수 윌프레드 첸. </p&gt;

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The authors have nothing to disclose.

여기에 제시된 절차는 티올 - 엔의 클릭 화학에 의해 형성된 하이드로 겔 내에서 세포를 photoencapsulate하는 기술에 대해 설명하고 이후 생화학 적 단서와 젤을 photopattern. 처음 하이드로 겔을 형성하는 광을 이용하여 중합 전에 중합체 용액 내에서 균일하게 혼합하고, 세포 현탁액을 허용한다. 신속한 중합 &quot;잠금&quot;정의 된 몰드의 형상의 겔 및 하이드로 겔 네트워크 내에서 세포를 현탁 캡슐화한다. 젤은 원하는 최종 용도에 따라 여러 가지 형상 (예를 들면, 유리 슬라이드 나 주사기 팁)으로 성형 될 수있다. 광 감쇠가 얇은 시료 내에 한정되어 예를 들어, 유리 슬라이드에 부착 된 하이드로 겔의 3 차원 배양에 캡슐화 된 세포 이미징 애플리케이션에 특히 유용하다. 주사기 금형 단시간에 제조 할 수 많은 샘플을 허용 세포의 빠른 밀봉 사용될 수있다 (유리 슬라이드에 비해이러한 세포 계측법 또는 qPCR에 따라 유동 세포의 다수의 요구 실험에 사용할 수있는 (S)). 그 후,이 젤은 그러한 분화 또는 침공으로 원하는 세포 반응을 유도하는 생화학 적 단서로 패턴 화 될 수있다. (30, 31) 생존 및 대사 활성에 대한 분석은 주어진 자료 시스템 셀 패터닝 상태의 생존을 나타낸다. 신진 대사 활동이 세포 기능에 중합 및 패터닝 조건의 초기 효과를 평가하기 위해 비 분해성 젤에서 3 일까지 (RGKGRK 펩티드 가교)를 모니터링 하였다합니다. 또한, 분해 펩타이드 가교 (GPQGIWGQ) 배합 젤의 후 캡슐은 세포 생존과 문화에 1 주 확산 남아 지원 1, 6 일째 중배엽 줄기 세포의 막 무결성 분석 (라이브 / 죽은 생존 / 세포 독성 염색). 추가 세포주의 생존은 32 것과 유사한 포토 패터닝 조건보고되었다여기에 사용되는 실시간 / 죽은 염색 및 대사 활성 분석을 사용하여 설명 된 하이드로 겔 시스템을 평가할 수있다. 우리는이 재료 시스템과 관련된 프로 시저 (4.2 및 4.3)을 사용하여 세포 생존 문제가 관찰되지 않은 반면, 일부 세포 유형은 유리 라디칼 및 / 또는 광 노출에 민감 할 수있다. 이 경우, 사용자는 아 지드 - 알킨 12 FXIII 31 또는 딜스 - 알더 계 하이드로 겔 형성 화학 비 광 개시 물질 시스템을 쓸 수있다. (33) 손쉬운 기술은 감지하고도 (3.1 및 3.2)을 제시 겔 내에서 생화학 적 단서의 패턴을 정량화한다. 시약은 상업적으로 입수 가능하고 별도의 합성 공정 단계 또는 더 비싼 시약 (예를 들어, 형광 표지 된 펩티드)가 필요 없기 때문에 엘만 (Ellman) 분석법이 특히 중요하다. 엘만 (Ellman) 분석을 정확하게 differe 아래 생화학 단서 자유 티올의 변경을 결정하기 위해 사용될 수있다NT 조건을 포토 패터닝뿐만 아니라 신속하게 패턴을 시각화. 펩티드 결합의 양적 측정으로서, 펩티드 결합 전과 후의 패터닝 티올 관능기 농도를 정량화 직접 엘만 (Ellman) 분석법으로 평가된다. 정량이 유형의 형광 표지 된 펩티드를 사용하여 수행 할 수 있지만, 34 촬상 계 정량 이상의 시간이 걸리는 처리 및 분석 단계가 필요 (예를 들어, 검량선의 형광 표지 된 펩티드 및 생성의 합성 펩티드 농도 형광 관계를 맺기 위해서는 ) 이미지 분석을 사용. 촬상 펩티드 혼입, 엘만 (Ellman) 시약에 직접 샘플에 도포하고 즉시 구상 할 수있다. X 축 및 패턴 시각화, Y 평면에 한정되는 반면,이 기술은 유리 티올기를 함유하는 기질이 패터닝되어있는 경우를 결정하기 위해 간단한 통상적 인 방법으로 사용될 수있다. 은 엘만 (Ellman) 분석법 C 아니라는 것을 유의해야onsidered cytocompatible는 photopatterns 관찰하고 정량화하는데 이용 될 수 있도록하면서, 그것은 세포의 존재하에 수행 할 수 없다. 입체적으로 세포의 존재 패턴을 이미징, 하이드로 겔 매트릭스 내의 형광 펩티드의 결합은 강력하고 널리 사용되는 방법 남아있다. 패턴의 해상도는 Y 축, X 축에서 평가 될 수 있고, Z 평면 공 촛점 현미경을 사용하고, 패터닝 된 영역 또는 비 패턴 영역 내의 셀들이 식별 될 수 있도록이 방법 cytocompatible이다. 함께 찍은, 엘만 (Ellman) 분석 및 이미징 기반 기술은 연구자들이 모두 양적 및 질적 자료 시스템 내에서 생화학 적 단서의 포토 패터닝을 평가하기위한 보완적인 도구입니다. Photoclick 또는 더 넓게 광 개시는 세포의 존재 하에서 하이드로 겔의 형성을위한 화학 및 수정이 많다. 여기에 제시된 성형, 캡슐화, 패터닝 기술은 액세스 제한되지 않습니다전술 한 재료 시스템으로 제한없는 및 그러한 티올 알킨 35 지드 - 알킨, 4 및 기타 티올 - 엔 화학 (예, 티올 넨) 10,13뿐만 아니라와 같은 다른 광 - 기반의 화학 물질에 적용 할 수있다 예컨대, 이르가 큐어 2959, 에오신 Y, 및 캄 포르 퀴논 등의 다른 광개시제. 사용자가 프로 시저 매개 변수를 조정해야 할 수도 있습니다 (예를 들어, 배양 시간, 중합 시간, 세포 밀도는) 조건이 다른 시스템에 대한 cytocompatible 남아 있는지 확인합니다. 패터닝 처리는 하이드로 겔 (2.2.3-2.2.5)로 ALLOC 변성 펩티드 (들)의 확산을 필요로하기 때문에,이 프로세스는 인테그린 - 결합 부분 (예를 들면, 펩타이드 또는 세포 외 기질 단백질의 첨가에 가장 유용 할 수있다 네트워크에 대한 리간드의 부착은 셀 전체 인테그린 활성화에 의해 견인력의 생성에 필요한 하이드로 겔에 단편). 36 주, 생체에 대한 그 수도솔루션 또는 고정 (예를 들면, 성장 인자 또는 사이토 카인)에 유사 활성화, 하이드로 겔에 부분 확산 (~ 1 시간)의 배양 단계는 패터닝 결과를 나선상 이벤트를 신호로 이어질 수 있습니다. 다른 방법은 패터닝 성장 인자 고정화 또는 로컬 격리 확립되었다. 37-39는 또한 패턴 해상도는 노광에 대한 제어에 의해 결정된다. 여기서, 포토 마스크 겔 깊이 통과하여 X 및 Y 평면에 패턴 작성을 허용; 그러나, 겔 내의 생화학 큐 패터닝을보다 공간 제어는 X 방향의 패턴, Y- 및 Z- 평면을 생성하기위한 두 개의 광자 공 초점 현미경의 사용과 같은 방사의 다른 방법으로 달성 될 수있다. 34,40 마지막으로,이 과정에서 사용되는 재료 시스템이 초기에만 생화학 단서로 변형되는 동안, 직교 photoclick 화학은 알테를 허용하도록 사용될 수 있음에 유의해야여기에 제시된 시간에 매트릭스 속성에서 식량. (12) 절차와 기술은 잘 정의 및 시공간으로 제어 특성을 가진 합성 매트릭스를 생성하기위한 현재의 접근 방식에 다양성을 추가 할 수 있습니다. 특히,이 과정에서 사용되는 시약 및 물질의 상업적 유용성은 제어 된 세포 배양에서의 애플리케이션을 위해 하이드로 겔 기반 바이오 물질의 이용에 관심이 연구자의 넓은 범위에서 유용 할 것이다.

클릭 화학은 점점 더 자신의 선택, 효율적으로, 그리고 자주 cytocompatible 반응성으로 인해, 약물 전달, 조직 공학, 제어 세포 배양 등 다양한 생물 의학 응용, 재료의 설계에 사용됩니다. 트리거 빛을 활용 1-3 Photoclick 화학 또는 반응을 개시 (예를 들면, 아 지드 - 알킨, 4- 티올 - 엔, 5, 테트라 졸 알켄 6)는 생체 물질의 형성 또는 수정을 위해 특히 중요하다. 그들은 빛을 발생하는 세포의 존재 생체 재료 특성의 사용자가 직접 제어에 적합. 특히 7, 8 이러한 반응을 온화한 조건과 때의 통제하에 빠른 속도는, 티올 - 엔의 photoclick 화학 물질이 사용되어왔다 없는 견고한 기계적 성질 5,9 함께 포함하지만, 세포 유형의 다양한 밀봉 용 겔 - 기반 생체 물질을 생성또한, 이러한 화학이 주요 측면을 모방하는 생화학 적 단서의 공간적 패턴에 사용 된 t 세포 배양 및 전달을위한 약속, 인간 중간 엽 줄기 세포 (중배엽 줄기 세포), 섬유 아세포, 연골 세포, 췌장 세포, 제한. 10, 11 원시 세포 미세 환경 및 부착, 분화 및 침입는 해당 셀 매트릭스 상호 작용을 촉진한다. 3,12 일반적으로 cytocompatible 조건에서 빠른, 광 개시 중합 아크릴 레이트 또는 노보 넨 ( &#39;엔&#39;)으로 작용 중합체와 반응시킨다. 빛 티올 엔 하이드로 겔, 시스테인 (티올)를 포함하는 펩티드의 건설 (13)이 도구 상자를 확장, 우리는 설정하고자 최소한의 합성 처리를 요구 또는 합성 세포 외 매트릭스 그들의 광범위한 사용을 향해 상업적으로 사용할 수 있었던 새로운 다목적 접근 빌딩 블록과 하이드로 겔 형성 방법에 관한 것이다.[비 분해성 또는 세포 분해 가교를 위해 K를 (세포 부착 [K (ALLOC) GWGRGDS = Pep1Alloc] 또는 둘을 촉진하기 펜던트 하나, 인테그린 결합 그룹 : 14 구체적으로는, 펩티드 (Alloc를) 알릴으로 수정 된이 라이신을 -protected ALLOC) RGKGRKGK (ALLOC) G 또는 KK (ALLOC) GGPQGIWGQGK (ALLOC) K = Pep2Alloc, 각각]. 이러한 순서로, 조건은 네 개의 암 티올 - 개질 된 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG4SH) 장파장 자외선 (365 nm에서 10 mW의 / cm 2)의 cytocompatible 용량 사용에 신속한 반응 (1-5 분) 확립 된 광개시제 리튬 페닐 -2,4,6- trimethylbenzoylphosphinate (LAP). 그 결과 하이드로 겔은 주에 대한 세포 배양 조건에서 안정. 셀 기반의 분해 및 리모델링을 활성화하기 위해, 효소 분해성 펩티드 겔 가교 (즉, GPQGIWGQ), (15) 및 모델 차 전지, 인간 중간 엽 줄기 세포 (중배엽 줄기 세포) 내에 설립되어, 두린 캡슐화 및 후 매우 실용적 남아이 행렬에서 g 문화. 또한, 펩티드는 공간적으로 이러한 물질 내에서 패턴 화되어 있고, 중배엽 줄기 세포는 생존과 포토 패터닝 조건에서 대사 활성 상태로 유지됩니다. 다른 펜던트 펩티드 서열이 여기에 도시되지 않은 (예 IKVAV는 YIGSR, GFOGER 등)도 주위의 미세 환경과 추가적인 세포 상호 작용을 조사하기 위해 매트릭스 내에 통합 될 수있다. 이러한 결과는 다양한 종류의 세포에 대한 연구에 3 차원 (3D) 세포 배양 및 전달 이러한 하이드로 겔 계 물질의 도포 직접적인 세포 - 매트릭스 상호 작용을위한 유망한. 여기서, 방법은 세포를 photoencapsulate하고 제안 된 하이드로 겔 시스템 내에서 연속적으로 photopattern 생화학 적 단서 (그림 1)되게됩니다. 관찰하고 이러한 photopatterns을 정량화하는 기술이 입증되어 특히, ⅰ) 엘만 (Ellman) 분석의 양적, 질적 사용이 modifica를 결정하기 위해패턴 화 된 기판과 형광 펩타이드 (AF488Pep1Alloc)의 ⅱ) 보완 질적 사용 내에서 무료 티올의 기 세 가지 차원에서 이러한 패턴을 관찰합니다. 또한, 생존력 분석법 (생균 / 죽은 생존력 / 세포 독성 염색) 및 대사 활성을 측정하기 (MTS 3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) -5- (3- carboxymethoxyphenyl) -2- (4- 설포 페닐) 사용자가 하이드로 겔 매트릭스 내의 다른 세포주 photoencapsulation 및 포토 패터닝 cytocompatibility 조건을 결정할 수 있도록 -2H-졸륨)가 제시된다. 프로토콜이 용이 한 광 기반 photoclick 하이드로 젤 시스템 시연되고 있지만, 기술은 세포의 존재 photoencapsulation 포토 패터닝 및 수많은 다른 라디칼 - 개시 하이드로 시스템에 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Custom Peptides</td><td>Various Vendors</td><td>----</td><td>Peptides may also be synthesized via standard SPPS techniques with materials from vendors including ChemImpex and ChemPep.</td></tr><tr><td>4-arm PEG Thiol, MW 20k</td><td>JenKem USA</td><td>4ARM-SH</td><td>Listed under Multi-arm Homofunctional PEGs. PEG4SH may also be synthesized as previously referenced.</td></tr><tr><td>Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate</td><td>Colorado Photopolymer Solutions</td><td>Li-TPO</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Phenylphosphonite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>149470</td><td>Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td></tr><tr><td>2,4,6-Trimethylbenzoyl Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>682519</td><td>Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td></tr><tr><td>Lithium Bromide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>213225</td><td></td></tr><tr><td>2-Butanone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360473</td><td></td></tr><tr><td>Flask, Round Bottom, 100&amp;nbsp;ml</td><td>Chemglass</td><td>CG-1506-05</td><td></td></tr><tr><td>80 ml Filter Funnel, Buchner, Medium Frit</td><td>Chemglass</td><td>CG-1402-L-02</td><td>Filter paper inside a regular glass funnel may be used if desired.</td></tr><tr><td>Magnetic Stir Bars</td><td>Various Vendors</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stirring and Hot Plate</td><td>Various Vendors</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Dessicator</td><td>Various Vendors</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>Deuterium Oxide</td><td>Acros Organics</td><td>16630</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td>Select appropriate medium and trypsin depending on cell type.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>Various Vendors</td><td>----</td><td>1.5 or 2 ml sizes, sterile.</td></tr><tr><td>BD Syringe with Slip (Luer) Tips (Without Needle)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-16H</td><td>Product number listed here is for a 1 ml syringe (16H), Various sizes are available (14-823-XX).</td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>High-Purity Silicone Rubber, 0.010&quot; Thick, 6&quot; x 8&quot; Sheet, 55A Durometer (Gasket)</td><td>McMaster Carr</td><td>87315K62</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>RainX, Original</td><td>Amazon</td><td>800002243</td><td>May be purchased from other vendors.</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>Photomasks</td><td>Advance Reproductions Corporation</td><td>----</td><td>Photomask Division, different designs may be printed as desired.</td></tr><tr><td>DTNB; Ellman&#039;s Reagent; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PI-22582</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide, Pellets/Certified ACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Orthophosphoric Acid</td><td>Alfa Aesar</td><td>33266</td><td></td></tr><tr><td>Cysteine Hydrochloride Monohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Various Vendors</td><td>----</td><td>Capable of speeds at 90-110 x g.</td></tr><tr><td>Multiwell Plate Reader</td><td>Various Vendors</td><td>----</td><td>Capable of reading absorbance at 405 nm in a 96-well plate.</td></tr><tr><td>Epifluorescent or Confocal Microscope</td><td>Various Vendors</td><td>----</td><td>To visualize peptide patterns and cells within hydrogels.</td></tr><tr><td>Omnicure Exfo Series 2000</td><td>Excelitas Technologies</td><td>----</td><td>Alternate light systems may be used to polymerize hydrogels.</td></tr><tr><td>Zeiss Zen Lite Software</td><td>Zeiss</td><td>----</td><td>Available at zeiss.com; compatible with images taken on Zeiss microscopes</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>----</td><td>Available at imagej.nih.gov; applicable for general image analysis</td></tr></tbody></table>

light-mediated formation and patterning of hydrogels for cell culture applications

클릭 화학은 약물 전달체, 조직 공학, 세포 배양 등 다양한 생체 물질 애플리케이션에 사용하기 위해 연구되었다. 이러한 광 개시 티올 - 엔 - 티올 반응 yne 같은 특정 광 매개 클릭 반응에서는, 소재 특성 통해 시공간 제어 수득 사용자 지향 특성 제어의 높은 수준의 시스템 설계를 허용한다. 제조 및 광 이들 티올 photoclick X의 화학적 성질에 의해 제공되는 기능성에 의해 제공되는 정밀도를 이용하여 겔 - 기반 생체 재료의 변형이 특히 잘 정의 된, 생체 모방 미세 환경 내 세포의 배양을 위해, 관심이 높아지고있다. 여기, 우리는 세포와 티올 엔의 photoclick 반응에 의해 중합 다양한 모듈 형 빌딩 블록을 사용하여 하이드로 겔 매트릭스 내에서 생화학 적 단서 후속 포토 패터닝의 photoencapsulation 방법을 설명합니다. 특히, 방법은 공동으로 제공된다알릴에서 nstructing 하이드로 겔 (Alloc를) -functionalized 펩티드 가교 펜던트 펩티드 잔기 빠르게 리튬 acylphosphinate 광개시제 및 장파장 자외선 (UV) 광의 cytocompatible 투여의 존재 하에서 중합 티올 - 관능 화 된 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG). 손쉬운 기술은 포토 패터닝을 시각화하고 설명하는 추가 된 펩타이드의 농도를 정량화한다. 또한, 방법은, 캡슐화 세포 특이 적 인간 중간 엽 줄기 세포의 확립 및 생존력과 활성을 측정한다. 형성 및 티올 ALLOC 하이드로 겔의 초기 패터닝 여기에 도시되어 있지만, 이들 기술은 크게 패터닝 기판을 생성하기 위해 다른 광 라디칼 개시 재료 시스템 (예를 들어, 티올 넨, 티올 레이트)의 개수에 적용될 수있다.

설치 및 절차는도 1에 도시되어 세포와 캡슐화 된 세포를 포함하는 후속 photopattern 겔 photoencapsulate하고, 스톡 용액을 제조 한 예는 10 중량 % 겔은 표 1에 제공된다 형성 하였다. 표 1을 사용하여, 단량체의 양 (PEG4SH을 , Pep2Alloc, ± Pep1Alloc) 및 하이드로 겔을 중합하는 데 필요한 광개시제 (LAP)을 계산한다. 이러한 계산을 바탕으로, PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc 및 LAP의 재고 솔루션을 준비하고 함께하고 형성하는 각각 (그림 1A)를 젤, 포토 패터닝을위한 Pep1Alloc없이 혼합. 그 후, 세포를 플레이트에서 수집 계산하고, 캡슐화 (그림 1B) 적절한 양으로 원심 분리된다. 세포 펠렛은 겔 형성 용액 (PBS 펩티드 / 폴리머 / LAP)에서 재현 탁하고, 세포 / 단량체 혼합물은 유리 주사기 몰 전사DS. 세포들은 빛의인가시 하이드로 겔 내에서 (도 1C) (10 mW의 / cm 365 nm에서 2 ~ 5 분)으로 캡슐화된다. (도 1D)을 포토 패터닝 들어 겔 중합 매트릭스 내로 펩티드 및 개시제의 확산을 허용하고, 1 시간 30 분, 30 분 Pep1Alloc 및 LAP에 침지된다. 이 펩티드 함유 겔은 원하는 패턴을 포토 마스크로 덮여 매트릭스 내에서 무료 티올에 펩티드 공역 빛 (1 분)의 두 번째 투여 량에 노출되어있다. 펜던트 사슬은 공유 적절한 세포 - 매트릭스 상호 작용을 촉진하고 체외에서 세포 기능과 운명을 프로빙 방향으로 원시 세포 미세 환경의 주요 기계적 및 생화학 적 특성을 흉내 낸, 빛에 노출 된 지역에서 젤에 연결되어 있습니다. 엘만 (Ellman) 분석은 photopatte 내에서 겔 수정 및 펩타이드 결합을 정량화 할 수있는 손쉬운하고 저렴한 방법을 제공rned 기판. 패턴 및 비 패턴 젤 (즉, 또는 펩티드 수정하지 않고 젤) 엘만 (Ellman) 반응 버퍼 후 중합에 배어있다. 다음으로, 시스테인 표준 및 버퍼에 담가 겔 48 웰 플레이트에 넣고 엘만 (Ellman) 시약 (왼쪽 그림 2A)와 함께 배양한다. 1 시간 30 분 후 샘플의 분취 량을 96 웰 플레이트의 각각의 웰에 배치하고, 흡광도를 405 nm에서 기록된다. 시스테인으로부터 표준 검량선 (도 2a, 오른쪽) (흡광도 선형 피팅 농도 VS) 플롯하고, 겔의 자유 티올의 금액은 희석 인자에 기초하여 결정될 수있다. 10 중량 %의 겔의 여러 중합 조건에 포토 패터닝이 유리 티올 농도는도 2b에 도시되어있다. (파란색 막대, I = 1 분, II = 5 분) Pep1Alloc없이 1 또는 5 분 동안 중합 젤은 t을 나타내는 통계적으로 유사한 무료 티올 농도가모자 빠른 반응이 발생하고 겔화 1 분 (양측 t 검정, P&gt; 0.05) 내에 완료됩니다. 따라서, 빛에 추가 노출 (2-5분)는 작용기의 추가 전환 발생하지 않습니다. Pep1Alloc없이 1 분간 중합 젤 (30)과 90 분 (3 ㎎ / ㎖) 및 LAP (2.2 mM)을 (녹색 바, II = 30 분, IV = 90 분) Pep1Alloc 적신 빛의 두 번째 투여 량에 노출 1 분. 무료 티올의 감소 (1 분 조건에 대한 60-80%)는 이러한 조건 하에서 펜던트 단서와 젤의 효율적인 변경을 나타냅니다. 높은 변형이 필요한 경우, Pep1Alloc 용액의 증가 된 농도의 펩티드 용액 전환을 제한 할 수있다 희석 이상의 무연 티올로 Pep1Alloc 접근성로서 사용될 수있다; 예를 들어, 우리는 / ㎖ Pep1Alloc 20 mg의 최대 농도는 무료 티올의&gt; 90 % 변환을 생산하는 것으로 나타났습니다. 유일 펩티드의 패턴은 하이드로 겔에 첨가 할 수있다빠르게 엘만 (Ellman) 시약 (5 분 아래 그림 3A)으로 이미지화 될 수있다. 그러나, 패턴의 시각화 시간 (이상 5 분) 겔을 통해 노란색 TNB 2가 음이온의 확산으로 인해 이상 손실됩니다. 영상 해상도 개선 입체적 (X 축, Y 축, Z 평면)과 세포의 존재의 패턴을 관찰, 형광 펩티드 첨가 (AF488Pep1Alloc)가 이용 될 수있다. 그림 (b)의 x 축에서 y 축과 공 초점 현미경으로 촬영 한 이미지 스택의 Z-돌기 패턴 해상도 (μm의 규모)를 보여주는 표시됩니다. 약 (94 ± 2) %와 분해 젤 (Pep2Alloc = GPQG ↓ WGQ) 내에서 캡슐화 된 중배엽 줄기 세포의 (94 ± 1) %는 빨간색 핵 (몇 죽은 세포로 각각 1, 육일 캡슐화 한 후 실행 가능한 (녹색 세포 기관을) 유지 ) 관찰 (도 4A). 또한, hMSC 포스트 캡슐화 육일 (에서 관찰된다 확산 <st<html> 룽&gt; 그림 4A, 삽입), 세포 개조 및 인테그린 결합 RGDS와 수정이 MMP-분해 행렬과 상호 작용할 수 있음을 나타냅니다. 비 분해성 젤 (Pep2Alloc = RGKGRK)에 캡슐화 된 세포에서 수행 신진 대사 활동 분석 한 3 일 후 캡슐화 (그림 4B) 세포 생존 능력의 두 번째 측정을 제공하고 세포 테스트 다양한 photoencapsulation 및 포토 패터닝 조건에 대한 활성 상태로 유지 있음을 입증 엘만 (Ellman) 분석 (그림 2B). 특히 Pep1Alloc + LAP (상태 III 및 IV)과의 초기 밀봉 (조건 I 및 II)와 함께 30 분 및 90 분 인큐베이션 간 대사 활성의 유의 한 차이는 절차 포토 패터닝의 응용에 적합한 것을 나타내는 없다 캡슐화 된 세포의 존재는 (t 검정, p&gt; 0.05 양측). 2fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 :. 하이드로 겔 내에서 세포를 캡슐화 이후 생화학 큐와 함께 포토 패터닝을위한 설정 (A) 거대 단량체 및 광개시제의 재고 솔루션이 준비되어 혼합 (PEG4SH = 백본, Pep2Alloc = 가교, Pep1Alloc = 펜던트 접착 부분 (RGDS), LAP = 광개시제 ). (B) 세포 캡슐화를 위해 수집됩니다. (C) 세포 (각각 PEG4SH / Pep2Alloc / LAP 또는 PEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / LAP)없이 또는 인테그린 결합 펩티드와 로머 솔루션을 혼합하고, 빛에 노출시 캡슐화됩니다. 겔 형성시에 과잉의 티올기를 함유하는 (D) 겔 (여기서, 2 mM의 과량의 티올 형성 PEG4SH / Pep2Alloc / LAP가) 즉 단일 ALLOC 기 (Pep1Alloc로 기능화 펩티드의 후속 첨가하여 생화학 큐 패터닝 될 수 있고, RGDS, IKVAV 등)에 세포 부착을 촉진하기겔의 특정 지역 내에서. 여기, 형광 표지 RGDS와 젤의 패턴이 표시됩니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54462/54462fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig2.jpg" /> 그림 2. 엘만 (Ellman) 정량 분석법 설정 및 결과 패턴 하이드로 겔의 변형을 평가 (A) 겔 및 시스테인 표준은 엘만 (Ellman) 시약과 함께 48 웰 플레이트에서 배양 하였다. 선형 표준 곡선이 겔 샘플에서 시스테인 농도를 결정하기 위해 도시된다. II = 5 분 중합; III = 30 분 배양 Pep1Alloc와 (B) 초과 무료 티올은 펜던트 ALLOC 펩타이드 (I = 1 분 중합와 패턴에 따라 겔 형성하는 동안 하이드로 겔 내에서 통합되어 소비 IV = 90 분 배양 위스콘신<html> 제 Pep1Alloc; III 및 IV 모두) 중합 1 분 동안 빛 패턴. 표시 데이터 (3 N =) 표준 오차를 나타내는 오차 막대로 평균을 보여줍니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54462/54462fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig3.jpg" /> 도 3. 엘만 (Ellman) 분석 및 형광 이미지 photopatterned 하이드로 겔을 시각화 (A) 엘만 (Ellman) 시약을 신속 X-의 패턴 (라인) 및 Y 평면 (황색 = 비 패턴 영역 눈금 막대 = 1mm)을 탐지하는데 이용 될 수있다. (B) 형광 펩티드 Y 축, X 축에 패턴을 관찰하기 위해 사용될 수있다, Z 평면 (녹색 패턴 영역 = 200 ㎛의 스케일 바, 10X 물 침지 목적, 예 / 엠 525분의 488 ㎚).large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig4.jpg" /> . 그림 4 : 생존 및 비 분해성 photopatterned 하이드로 겔 내에서 세포의 신진 대사 활동 (A) 예 촛점 Z - 스택 (Z 프로젝션, 10 배 물 침지 목적) 실행 가능한 (녹색, 예 / 엠 525분의 488 ㎚) 및 죽은 중배엽 줄기 세포 (빨강, 예 / 엠 580분의 543 nm의)는 하이드로 겔 내에서 캡슐화 24 시간 후 캡슐화 (스케일 바 = 200 μm의). 육일 캡슐화 (삽입 이미지, 스케일 바 = 50 μm의) 후 이러한 하이드로 겔 내에서 확산 세포. (; II = 5 분 중합 I = 1 분 중합) 및 패터닝 조건 (III = Pep1Alloc 30 분 배양 (B) 세포는 1 3 일 (각각 어둠과 빛 바,) 다양한 중합 후 캡슐화는 대사 활성 ; IV = 90 분 incubatioN Pep1Alloc와; 모두) 중합 1 분 동안 빛 패턴. 표시 데이터 (3 N =) 표준 오차를 나타내는 오차 막대로 평균을 보여줍니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54462/54462fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="1 번 테이블" src="/files/ftp_upload/54462/54462tbl1.jpg" /> 표 1 : 예 설정이 하이드로 겔을 만들기위한 재고 솔루션의 볼륨을 계산하는 파란색 강조 스프레드 시트 내에서 셀 사용자 정의 매개 변수를 표시하는 단계;. 다른 수량은 이러한 설정을 기반으로 계산됩니다. 겔을 만들기 위해 각각의 원액에 대한 최종 볼륨이 주황색으로 강조 표시됩니다. 백혈구는 사용자 정의 파라미터들에 기초하여 최종 부피를 계산하는 데 사용되는 화학식을 포함한다. 2.2 MM의 LAP의 농도가 0.067 중량 %에 해당합니다.

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Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

light-mediated-formation-patterning-hydrogels-for-cell-culture

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.9K 조회수.  University of Delaware. We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented. 

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Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

연구

생체공학

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting "2.5D" structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (&lt;200 &mu;m) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

Simple techniques are described for the rapid production of microfabricated neural culture systems using a digital micromirror device for dynamic mask projection lithography on regular cell culture substrates. These culture systems may be more representative of natural biological architecture, and the techniques described could be adapted for numerous applications.

동적 마스크 프로젝션 석판술를 사용하여 신경 문화 시스템의 Micropatterned Hydrogels의 제작

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 Hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

생화학

Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact bioprinting1-4 (extrusion, dip pen and soft lithography), contactless bioprinting5-7 (laser forward transfer, ink-jet deposition) and laser based techniques such as two photon photopolymerization8. It can be used for many applications such as tissue engineering9-13, biosensor microfabrication14-16 and as a tool to answer basic biological questions such as influences of co-culturing of different cell types17. Unlike common photolithographic or soft-lithographic methods, extrusion bioprinting has the advantage that it does not require a separate mask or stamp. Using CAD software, the design of the structure can quickly be changed and adjusted according to the requirements of the operator. This makes bioprinting more flexible than lithography-based approaches.
Here we demonstrate the printing of a sacrificial mold to create a multi-material 3D structure using an array of pillars within a hydrogel as an example. These pillars could represent hollow structures for a vascular network or the tubes within a nerve guide conduit. The material chosen for the sacrificial mold was poloxamer 407, a thermoresponsive polymer with excellent printing properties which is liquid at 4 &deg;C and a solid above its gelation temperature ~20 &deg;C for 24.5% w/v solutions18. This property allows the poloxamer-based sacrificial mold to be eluted on demand and has advantages over the slow dissolution of a solid material especially for narrow geometries. Poloxamer was printed on microscope glass slides to create the sacrificial mold. Agarose was pipetted into the mold and cooled until gelation. After elution of the poloxamer in ice cold water, the voids in the agarose mold were filled with alginate methacrylate spiked with FITC labeled fibrinogen. The filled voids were then cross-linked with UV and the construct was imaged with an epi-fluorescence microscope.

A bioprinter was used to create patterned hydrogels based on a sacrificial mold. The poloxamer mold was backfilled with a second hydrogel and then eluted, leaving voids which were filled with a third hydrogel. This method uses fast elution and good printability of poloxamer to generate complex architectures from biopolymers.

모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact ...

면역학 및 감염병학

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

미세 패턴 매크로 스케일 3D 셀룰러 아키텍처 모듈 형 하이드로 겔 시트의 건설

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development of constructs for tissue engineering. This environment better mimics what cells observe in vivo, compared to standard tissue culture, due to the tissue-like properties and 3D environment. Synthetic polymeric hydrogels are water-swollen networks that can be designed to be stable or to degrade through hydrolysis or proteolysis as new tissue is deposited by encapsulated cells. A wide variety of polymers have been explored for these applications, such as poly(ethylene glycol) and hyaluronic acid. Most commonly, the polymer is functionalized with reactive groups such as methacrylates or acrylates capable of undergoing crosslinking through various mechanisms. In the past decade, much progress has been made in engineering these microenvironments - e.g., via the physical or pendant covalent incorporation of biochemical cues - to improve viability and direct cellular phenotype, including the differentiation of encapsulated stem cells (Burdick et al.).
The following methods for the 3D encapsulation of cells have been optimized in our and other laboratories to maximize cytocompatibility and minimize the number of hydrogel processing steps. In the following protocols (see Figure 1 for an illustration of the procedure), it is assumed that functionalized polymers capable of undergoing crosslinking are already in hand; excellent reviews of polymer chemistry as applied to the field of tissue engineering may be found elsewhere (Burdick et al.) and these methods are compatible with a range of polymer types. Further, the Michael-type addition (see Lutolf et al.) and light-initiated free radical (see Elisseeff et al.) mechanisms focused on here constitute only a small portion of the reported crosslinking techniques. Mixed mode crosslinking, in which a portion of reactive groups is first consumed by addition crosslinking and followed by a radical mechanism, is another commonly used and powerful paradigm for directing the phenotype of encapsulated cells (Khetan et al., Salinas et al.).

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

We present protocols for the 3-dimensional (3D) encapsulation of cells within synthetic hydrogels. The encapsulation procedure is outlined for two commonly used methods of crosslinking (michael-type addition and light-initiated free radical mechanisms), as well as a number of techniques for assessing encapsulated cell behavior.

조직 공학을위한 3D Hydrogels에서 셀룰러 봉지

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

생물학

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

생리 활성 단백질 또는 펩 티 드 히드로 광화학을 사용 하 여 생물 학적 응용에 대 한에 패턴화

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies of endothelial-epithelial bilayers have traditionally relied on permeable support models that enable bilayer culture, but permeable supports are limited in their ability to replicate the diversity of human basement membranes. In contrast, hydrogel models that require chemical synthesis are highly tunable and allow for modifications of both the material stiffness and the biochemical composition via incorporation of biomimetic peptides or proteins. However, traditional hydrogel models are limited in functionality because they lack pores for cell-cell contacts and functional in vitro migration studies. Additionally, due to the thickness of traditional hydrogels, incorporation of pores that span the entire thickness of hydrogels has been challenging. In the present study, we use poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels and a novel zinc oxide templating method to address the previous shortcomings of biomimetic hydrogels. As a result, we present an ultrathin, basement membrane-like hydrogel that permits the culture of confluent cellular bilayers on a customizable scaffold with variable pore architectures, mechanical properties, and biochemical composition.

Current bilayer culture models do not allow for functional in vitro studies that mimic in vivo microenvironments. Using polyethylene glycol and a zinc oxide templating method, this protocol describes the development of an ultrathin biomimetic basement membrane with tunable stiffness, porosity, and biochemical composition that closely mimics in vivo extracellular matrices.

듀얼에 대 한 생체 모방 지하실 멤브레인으로 ultrathin Porated 탄성 Hydrogels 세포 배양

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat soft substrates that deform under cell traction (2D-TFM). TFM relies on the use of linear elastic materials, such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyacrylamide (PA). For 2D-TFM on PA, the difficulty in achieving high throughput results mainly from the large variability of cell shapes and tractions, calling for standardization. We present a protocol to rapidly and efficiently fabricate micropatterned PA hydrogels for 2D-TFM studies. The micropatterns are first created by maskless photolithography using near-UV light where extracellular matrix proteins bind only to the micropatterned regions, while the rest of the surface remains non-adhesive for cells. The micropatterning of extracellular matrix proteins is due to the presence of active aldehyde groups, resulting in adhesive regions of different shapes to accommodate either single cells or groups of cells. For TFM measurements, we use PA hydrogels of different elasticity by varying the amounts of acrylamide and bis-acrylamide and tracking the displacement of embedded fluorescent beads to reconstruct cell traction fields with regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
To further achieve precise recording of cell forces, we describe the use of a controlled dose of patterned light to release cell tractions in defined regions for single cells or groups of cells. We call this method local UV illumination traction force microscopy (LUVI-TFM). With enzymatic treatment, all cells are detached from the sample simultaneously, whereas with LUVI-TFM traction forces of cells in different regions of the sample can be recorded in sequence. We demonstrate the applicability of this protocol (i) to study cell traction forces as a function of controlled adhesion to the substrate, and (ii) to achieve a greater number of experimental observations from the same sample.

Near-UV lithography and traction force microscopy are combined to measure cellular forces on micropatterned hydrogels. The targeted light-induced release of single cells enables a high number of measurements on the same sample.

견인력 현미경 검사법의 응용을 위한 하이드로겔 패터닝 기술을 사용하여 세포 접착 제어

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...