This research was funded by the Office of Naval Research through Core funds provided to the Naval Research Laboratory.

플라스미드 1. 준비 <ol><li> A (앵커-ST로서이 프로토콜 함) biorthogonal 결합 도메인 융합 플라스미드 (예, pET22) 앵커 단백질 함유 (하는 OmpA), 에피토프 태그 (예 : 정제 및 식별 6xHis, myc의 또는 FLAG 태그)를 준비 세포질 파악 태그 항생제 내성, 선택된 균주 7에 기초하여 적절한 복제 원점. <ol><li> 제조 업체의 프로토콜 다음 시중에서 판매하는 DNA 분리 키트를 사용하여 야간 문화의 플라스미드 DNA를 추출합니다. </li></ol></li><li> 플라스미드 (예, pACYC184) (효소 SC 등이 프로토콜에 언급) (PTE)를 앵커 단백질의 상보 bioorthogonal 결합 도메인에 융합 OMV 내에 패키징 될 수있는 효소 / 단백질을 함유 준비 에피토프 태그 앵커 단백질 플라스미드와 다른 주변 세포질 현지화 태그, 항생제 내성, 적절한 오리지널복제 선택된 균주 7을 기반으로. <ol><li> 제조 업체의 프로토콜 (7) 다음 시중에서 판매하는 DNA 분리 키트를 사용하여 야간 문화의 플라스미드 DNA를 추출합니다. </li></ol></li></ol> OMV 포장 대장균 문화의 2 세대 <ol><li> 플라스미드 분리 <ol><li> 효소-SC는 구성 및 앵커-ST는 제조 업체의 프로토콜 7에 따라 상업용 플라스미드 격리 키트를 사용하여 별도의 유지 보수 세포주에서 구축 인코딩하는 플라스미드를 정제. 260 nm의 280 nm에서 흡광도를 측정하여 DNA 농도 및 순도를 결정합니다. </li></ol></li><li> 공동 변환 <ol><li> 단백질 발현을 용이하게하기 위해 상업적으로 사용할 수있는 대장균 균주를 선택한다. 주 : BL21 (DE3) 세포를 여기에 사용 하였다. T7의 lysogen는 제자의 T7 프로모터 및 T7 RNA 중합 효소에 의존 앵커-ST 구조의 표현이 필요합니다EIN 식입니다. 다른 박테리아 균주를 사용하면 T7의 lysogen 유전자의 존재 또는 pET22 7 이외의 플라스미드를 사용하는 하나를 요구한다. </li><li> 다음 선택 권한있는 셀의 제조 업체의 프로토콜 다음 열 충격 변환하거나 전기 중 하나를 통해 유능한 박테리아 세포로 변형 동등한 몰 농도 정제 된 플라스미드 DNA를 희석. </li><li> ; 위에 항생제 함유 모두 암피실린 (pET22) 및 클로람페니콜 (pACYC184)와 접시 한천 루리아 - 베르 타니 (LB)를 플레이트 형질 전환 된 세포 모두 25 μg의 / ㎖의 최종 농도로 존재. </li><li> 모두 플라스미드를 포함하는 경우에만 클론을 분리하기 위해 밤새 37 ° C에서 배양 접시를 놓습니다. 참고 : 항생제 선택 살아남을 식민지 이후의 모든 OMV 제제에 사용됩니다. 항생제 (암피실린과 클로람페니콜)을 선택적으로 압력을 유지하고 두 플라스미드의 존재를 확인하기 위해 모든 액체 배양 물에 첨가한다. </li></ol></li></ol> 3. OMV 생산 <ol><li> 식민지 확장 <ol><li> 2.2.4에 설명 된 선택 플레이트의 단일 콜로니로 상기 농도의 항생제를 함유하는 배지 (전형적 굉장 브로 쓰 (TB) 또는 LB) (단계 2.2.3) 5 ㎖를 접종한다. </li><li> 당황 배양 플라스크에 하룻밤 스타터 문화의 100 배 희석 : 1을 수행합니다. 참고 : 250-500 ml의 사이에 미디어의 볼륨을 사용합니다. </li><li> 문화의 충분한 통기가 달성하기 위해 250 rpm으로 흔들어 37 ° C에서 문화를 유지한다. </li></ol></li><li> 각 플라스미드의 유도 <ol><li> 박테리아 문화가 주 성장 플라스크의 접종 후, OD 0.6-0.8의 600 성장의 약 3 시간을 증가 할 수 있습니다. </li><li> PTE-SC로드 소포의 최종 수율을 향상시키기 위해 15 분 동안 7,000 XG에서 전체 문화를 원심 분리기. 예열 신선한 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁. 참고 :이 옵트하는 ional 단계 PTE-SC 유도 전에 배양 배지에 존재하는 빈 OMV를 제거 할 수 있습니다. </li><li> 0.22 μm의 필터를 사용하여 물과 살균 필터 L - 아라비 노스의 20 % 원액을 확인합니다. 2~4주 4 ℃에서 보관 L - 아라비 노스 솔루션입니다. </li><li> PTE-SC 생산을 시작 최종 0.2 %의 농도로 배양 플라스크에 L-아라비 노스 솔루션을 추가합니다. 참고 :이 전에 돌연변이하는 OmpA-ST의 유도를 통해 증가 된 수포를 홍보에 PTE-SC와 주변 세포질 공간을 미리로드하는 데 도움이됩니다. </li><li> 0.22 μm의 필터를 사용하여 물과 살균 필터의 1 M 이소 프로필 β-D-1-D- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG) 솔루션을합니다. 참고 : IPTG 한 번 즉시 사용 수화해야합니다. IPTG의 분취 3-6 개월간 동결 보관하고, 사용 전에 즉시 해동 할 수있다. </li><li> 하는 OmpA-ST의 생산을 시작하는 0.5 mm의 최종 농도에 추가 3 시간의 잠복기 후 IPTG를 추가합니다. </li><li> 막 다른 허용진탕하면서 37 ℃에서 추가로 8 ~ 14 시간 동안 성장 진짜야. </li></ol></li></ol> 4. OMV 정화 <ol><li> 본래 박테리아의 제거 <ol><li> 그대로 박테리아를 펠렛 4 ° C에서 7,000 XG에 15 분 동안 세균 배양 배지를 원심 분리기. </li><li> 세포 펠렛을 방해하지에 캔트, 그리고 조심 세포 펠렛 포스트 원심 분리의 맨 위에 떨어져, 미디어를 저장합니다. </li><li> 하나의 추가 원심 분리 사이클은 모두 그대로 박테리아가 가만히 따르다 미디어를 저장해야되는 문화 미디어에서 제거되도록하는 반복 4.1.1와 4.1.2 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 단백질 응집체를 제거하여 <ol><li> 또한 잔류 세균 원하지 않는 큰 세포 물질을 제거하기 위해 0.45 ㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 세균 배양액을 정제. 주 : (셀룰로오스 아세테이트 (CA) 또는 폴리 비닐 리덴 디 플루오 라이드 등의 높은 회수율 및 낮은 단백질 흡착 생물학적 호환 막 재료를 사용하여PVDF). 100 ㎖ 및 100 ㎖보다 큰 진공 필터 볼륨보다 작은 주사기 필터 볼륨. <ol><li> 주사기 필터, 멸균 10 ~ 50 ML의 주사기에 배지를 그립니다. 주사기의 루어 끝에 0.45 μm의 필터를 연결합니다. 플런저를 우울하게하고 흐름을 통해 새로운 용기를 수집합니다. </li><li> 필터 진공 멸균 여과 장치에 배지를 전송합니다. 펌프를 진공 또는 흡입을 생성하는 흡입기를 싱크 장치를 연결합니다. 새로운 용기에 여과 매체를 전송합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 초 원심 분리를 통해 OMV의 분리 <ol><li> 원심 분리기에 반대 튜브의 균형을주의하면서 원심 분리 튜브에 필터링 된 배양 배지를 추가합니다. </li><li> 악기 및 튜브 모두 일치하는 해당 로터를 사용하여 초 원심 분리기에서 4 ° C에서 3 시간 동안 ~ 150,000 XG에 펠렛 사용된다. </li><li> 즉시 완료 오에서의 OMV 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 OMV 펠릿에서 OMV 고갈 문화 매체를 가만히 따르다OMV 복구 저감 펠릿 연화 매체에 남아 있도록 OMV 펠렛을 허용 같은 F 원심. 참고 :이 펠릿은 약간 갈색과 세균 배양의 시작 양에 따라하는 또는 눈으로 볼 수 없습니다 수있을 것입니다. 원심 분리 튜브의 상단에서 직접 미디어를 흡입하는 것은 또한 OMV에서 ​​제거 더 많은 미디어가 최종 OMV 샘플이 될 것입니다 더 순수 펠렛 것을 염두에두고하는 옵션입니다. </li><li> OMV 입자가 완전히 미디어에서 고갈되었는지 확인 나중에 동적 광산란 (DLS) 테스트를위한 원심 분리하여 상층 액을 저장합니다. </li><li> 추가가 RT에서 30 분 동안 배양 허용 OMV 펠릿하여 pH 8.0 멸균 여과하고 인산염 완충 식염수 (PBS) pH 7.4의 100 mM의 N 사이클로 헥실 -2- 아미노 에탄 술폰산 (CHES) 버퍼 0.5 ml의. 펠릿 건조하지 않도록하십시오. 참고 : 솔루션 이온 강도, pH를, 및 온도 극단이 감소 OMV 용해도가 발생하고 aggre 촉진 할 수있다gation. </li><li> 조심스럽게 용해 된 전체 펠릿을 위해 부드럽게 혼합 원심 분리 튜브로부터 정제 OMV 용액을 피펫. </li></ol></li></ol> 5. OMV 특성 <ol><li> OMV 크기 분포 및 입자 농도를 측정하기 위해 각 기기에 고유 제공된 제조사의 프로토콜에 따라 시판 DLS 또는 나노 추적 소프트웨어를 사용한다. 주 : 여기에서, OMV의 크기 분포 및 농도 NanoSight LM10 나노 입자 추적 및 NTA 2.3 분석 소프트웨어를 이용하여 측정 하였다. <ol><li> 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> 현미경을 켜고 현미경과 나노 입자 추적 장치의 모든 표면을 청소합니다. </li><li> ~ 모든 공기를 주입하지 않고 전체 뷰잉 윈도우를 커버해야되는 1 ㎖의 멸균 주사기와 피팅 루어 통해 입자 추적 장치의 뷰잉 윈도우에 직접 OMV 시료 0.5 mL를이 시스템에 거품을 추가한다. </li><li> 장소 t그는 현미경 무대에서 장치를 추적하고 레이저를 켜 나노 입자. </li><li> 소프트웨어에서 &quot;캡처&quot;를 클릭합니다. </li><li> 현미경의 초점을 조절하고 소프트웨어 윈도우의 미리보기 화면에 존재하는 입자를 시각화하는 스테이지. </li><li> 밝은 입자가 명확하게 어두운 배경에 가시화 될 때까지 &quot;카메라 셔터&quot;와 &quot;카메라 이득&quot;을 조정합니다. </li><li> 60 초에 촬영 시간을 조정합니다. </li><li> &quot;기록&quot;을 클릭합니다. </li><li> 입력 샘플 / 소자 온도를 프롬프트 할 때, 샘플을 레이블 및 사용자 지정 폴더에 실행되는 각각의 완료시 상기 비디오 데이터를 저장한다. </li><li> (감지 임계 값은, 흐림, 최소 트랙 길이, 최소 예상 입자 크기) 자동차에이 모드를 감지하고 클릭 모든 분석 매개 변수를 유지 &quot;공정 순서를.&quot; 참고 : 각 매개 변수를 미세 조정 분석 결과를 독립적으로 조절할 수있는 방법에 대한 설명서를 참조하십시오. </li><li> 기록 입도 분포 및 입자 / m소프트웨어에 의해 결정된 L 농도. 참고 : 전형적인 OMV 유체 역학적 크기 범위는 ~ 10 × 10 (8)의 입자 / ml의 농도 30-200 나노 미터 사이이다. </li></ol></li><li> OMV의 단백질 함량을 결정 <ol><li> OMV 순도, 효소 생산 및 SC-ST 가교 효율 7 평가 표준 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 프로토콜을 사용한다. 참고 : 가교 효율이 100 % 7되지 않습니다. </li></ol></li></ol> 효소 포장 6. 확인 <ol><li> PTE 활동 분석 <ol><li> 하나 큐벳에 25 ° C에서 적절한 버퍼와 같은 100 mM의 CHES 완충액 (pH 8) 모든 효소 분석을 수행하거나 384분의 96 웰 플레이트에 다중화. </li><li> 1의 5 μl를 추가 CHES의 90 μl를 정제 OMV의 5 μL에 CHES 버퍼에 paraoxon 1,000 희석 (~ 36 배 배양 배지에 존재하는 OMV 농도에 비해 농축). 주의 : Paraoxon은 독성 농약이다및 제조 업체 및 기관의 지침에 따라 처리해야합니다. </li><li> 405 nm에서 일정한 간격으로 흡광도 측정 (~ 2 시간 총 반응 시간 동안 매 20 초)을 가지고 (ε = 18.1 밀리미터 -1 cm -1) 및 348 nm의 (등 흡수 점의 ε = 5.4 밀리미터 -1 cm -1)에의 발색 paraoxon 고장 제품, P는 니트로 페놀의 반응 진행을 모니터링 할 수 있습니다. 참고 : 8 위의 pH 값에서 P는 니트로 페놀의 지배적 인 탈 양성자 형태로 405 nm에서 정확한 모니터링을 가능하게 존재한다. 다른 복잡한 또는 낮은 pH 용액에서 그것은 P 개의 니트로 페놀의 다양한 형태가 존재할 수있는 바와 같이 348 nm 인 등 흡수 점을 활용하는 것이 필요하다. </li><li> 각 샘플 포장 효율 및 총 PTE 생산 PTE의 상대적인 양을 비교하는 단계 6.1.3에서 진행 곡선의 직선 부분의 기울기를 결정함으로써 초기 반응 속도를 계산한다. </li><li> 표준 효소를 수행분석 프로토콜은 K M, V 최대를 결정하고 OMV에 대한 K 고양이 PTE를 캡슐화. 참고 : 위버 - 버크 분석이이 운동 매개 변수의 결정에 이용 될 수있는 y 절편 = 1 / V 최대 및 기울기 = K M / V 최대 20. </li></ol></li><li> 횡단 기판 / 제품 확산. <ol><li> 체적 단계 0-3%에서 CHES 완충액 트리톤 X-100의 농도 증가를 이용하여 6.1에서 설명한 것과 동일한 역학적 분석 분석을 수행한다. 주 : OMV 가용화 기능에 트리톤 X-100의 첨가는 OMV의 내용이 반응 용액에 자유롭게 접근 할 수 있도록 허용하는 지질 이중층을 방해. </li><li> 계산하고 활성을 I 효소 효소 활성에 비해 최소한의 변화 (초기 속도)에 의해 표시 기판 / 제품의 횡단 통과를 확인하기 위해 각각의 트리톤 X-100 수준에서 초기 속도를 비교할N 트리톤 X-100의 부재. 효소 활성의 상당한 증가는 트리톤 X-100의 존재하에 관찰되는 경우에는, 기판이 자유롭게 OMV에 확산하지 않는 것 같다. </li><li> 이 효소의 활성을 확인하기 트리톤 X-100의 존재하에 분석 자유 효소 활성 (6.1 절에서 설명한 바와 같이) 자체가 계면 활성제에 의해 저해되지 않는다. 참고 : 활동이 크게 트리톤 X-100, 같은 사포닌 또는 다양한 폴리 소르 베이트 등의 다른 첨가제에 의해 영향을 경우 / 트윈 계면 활성제는 OMV 막 파열하는 것이 더 적합 할 수있다. </li></ol></li></ol> 7. OMV 저장 <ol><li> 동결 <ol><li> 직접 액체 질소로 정제 OMV의 장소 ~ 100 μL 씩 스냅인을 확인 완전히 유리 병을 잠수함 또는 샘플 자체에 액체 질소를 접촉하지되는 분취 량을 동결합니다. 주 : 정제 OMV가 버퍼에 직접 고정 할 수있는 스냅 purificat OMV 중에 펠렛을 용해시켰다 선정7 필요한 추가 cryoprotectants와 이온 과정. </li><li> -80 ° C에서 스냅 냉동 분취 량을 저장합니다. </li><li> RT 확실 샘플을 가열하지 않는 것을에서 그들을 배치하여 단계 7.1.1에서 냉동 분취 량을 해동. </li><li> 이러한 방식으로 스토리지의 모든 샘플을 준비하기 전 단계 이전에 초기 속도를 비교 6.1 및 효소 활동 후 동결 융해에 큰 손실이 없음을 확인하기 위해 동결 후 설명 효소 분석을 수행합니다. 참고 : 효소 활성의 감소가 동결로 인해 관찰되는 경우 스토어는 4 ° C에서 OMV를 정제 하였다. </li></ol></li><li> 동결 건조 <ol><li> 시중에서 판매하는 동결 건조 장비 (21)을 이용하여 스냅 냉동 정제 OMV 씩을 동결 건조. </li><li> 상점은 주 또는 여러 달 동안 -80 ° C에서 RT에서 분취 액을 동결 건조. </li><li> 동결 건조 이전과 동결 건조 OMV에 정제수의 동일한 볼륨을 추가하고 t을 재수 할 실온에서 30 분 동안 서 보자그는 샘플. 필요한 확인되는 경우 와동 또는 OMV를 초음파 처리하지 부드럽게 섞는다. </li><li> 이전에 희석 / 가용화가 필요하지 않은 점의 배려하는 응용 프로그램에 대한 직접 동결 건조 OMV 분말을 추가합니다. </li></ol></li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density-based+separation+of+liposomes+by+glycerol+gradient+centrifugation.">Density-based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation.</a> Anal. Biochem. 159, 122-131 (1986).</li><li>Alves, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalized+liposome+purification+via+Liposome+Extruder+Purification+(LEP).">Functionalized liposome purification via Liposome Extruder Purification (LEP).</a> Analyst. 138, 4746-4751 (2013).</li><li>Mayer, L. D., StOnge, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+free+and+liposome-associated+doxorubicin+and+vincristine+levels+in+plasma+under+equilibrium+conditions+employing+ultrafiltration+techniques.">Determination of free and liposome-associated doxorubicin and vincristine levels in plasma under equilibrium conditions employing ultrafiltration techniques.</a> Anal. Biochem. 232, 149-157 (1995).</li><li>Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-superpositive+GFP+reassembly+is+a+fast,+efficient,+and+robust+method+for+detecting+protein-protein+interactions+in+vivo.">Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo.</a> Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).</li><li>De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+the+interacation+of+two-stranded+de+novo+designed+coiled-coils:+effect+of+chain+length+on+the+kinetic+and+thermodynamic+constants+of+binding.">Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding.</a> Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).</li><li>Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-Intein+for+simultaneous+site-specific+conjugation+of+quantum+dots+to+multiple+protein+targets+in+vivo.">Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo.</a> J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).</li><li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+proteomic+profiling+of+native+outer+membrane+vesicles+derived+fromEscherichia+coli.">Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli.</a> Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protecting+enzymatic+function+through+directed+packaging+into+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles.</a> Sci. Rep. 6, 24866 (2016).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapeutic+delivery+capabilities+and+challenges+utilizing+enzyme/protein+packaged+bacterial+vesicles.">Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles.</a> Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

대표적인 방법을 설명하기 위해이 프로토콜 기능은 관심있는 효소를 생산 E. coli에 의해 OMV로 패키징하는 패키징 방법을 지시했다. 많은 복잡한 기술과 같이, 프로토콜은 아래에 설명되는 일부 다른 고유 한 애플리케이션에서 사용하기 위해 수용하도록 변형 될 수있는 복수의 영역이있다. OMV 포장 및 효소 캡슐의 메커니즘은 특정 요구에 적용 할 수있는 반면 성공에 중요한이 프로토콜 내?...

효소 로딩 박테리아 외막 소체 (OMV)의 설계, 생산 및 정제 방법이 여기에서 제시 하였다. OMV는 30-200 nm의 1, 2에서 크기가 다양 테오 주로 단층, 작은 수 있습니다. 현재까지 연구 된 모든 그람 음성 및 그람 양성 박테리아는 표면 3,4에서 OMV 또는 세포 외 소포 (EV) 중 하나의 릴리스를 증명하고있다. OMV가 생산되고있는 정확한 메커니즘은 아직 완전히 때문에 그들뿐만 아니라 그들이 섬기는 다양한 기능을 분비하는 다양한 세균 집단을 규명해야한다. OMV 복잡한 시그널링 유전자 전위 다양한 서빙 유전 물질 소분자, 펩티드, 단백질로부터화물 다양한 수송 도시되어 있고, 독성은 5,6 기능한다. OMV의 생물 발생의 정확한 메커니즘은 잘 특징, 세균 종 사이의 차이 표시되지 않습니다. 생에도 불구하고S 사실, 우리는 목적 단백질과 세균의 외막에 매우 풍부한 단백질 내생 이후 OMV 간의 합성 결합을 만들어 OMV으로하는 재조합 단백질의 포장 효율을 향상시키는 방법을 개발했다. 합성 결합 또는 인위적으로 혼입 친화력의 부재에서, 상기 재조합 발현 된 단백질과 OMV 사이 관찰 포장 효율 7 매우 낮다. 이 결과는 잘 이해되지 않은기구에 의해 하나가 박테리아 표면이나 직접 포장 통해 OMV 형성의 정확한 순간에 우연 밀봉 통해 발생 OMV 내 단백질의 혼입으로 예상 할 수있다. 일 다른 사람에 비해 높은 효율로 포장 일부 단백질과 종속 단백질은 매우 약간의 성공이 우연 캡슐화하지만 효과적인 포장에 의존 주변 세포질 공간 내 표현을 통해 단순히 통해 단백질을 포장에서 관찰 된입니다전혀 8-10에서 포장하지 않습니다. 일반적인 합성 생물학 기술을 이용하여, 우리는 대장균 (E. coli에) 동시에 제조, 포장 및화물을위한 박테리아에 의해 선택되는 방법 OMV가 형성되는 방식에 대한 현재의 기술 한계를 회피 OMV에 목적 활성 효소를 분비을 설계하고자 포장. 선택 합성 링크가 OMV 방향으로 포장을 용이하게하도록 본 출원의 목적을 위해 분리 된 단백질 바이오 콘쥬 게이션 시스템을 선택 하였다. 이름이 암시 하듯이 분할 단백질 바이오 콘쥬 게이션 시스템은 서로 상호 보완적인 두 서브 유니트 도메인으로 구성된다. 이 프로토콜의 목적을 위해 선택한 분할 단백질 도메인은 연쇄상 구균 화농의 피브로넥틴 결합 단백질 (FbaB) (11)에서 파생 된 SpyCatcher (SC) 및 SpyTag (ST) 도메인으로하고라고합니다. 이 분할 단백질 시스템은 w에서 이례적인 일이다암탉 개의 서브 유닛이 근접 내에 isopeptide 결합되어 자발적으로 공유 결합을 생성 산과 라이신 아미노산 잔기 아스파르트 기단 사이에 형성한다. Isopeptide 결합 형성은 샤페론 단백질, 효소, 촉매 또는 보조 인자의 첨가를 필요로하지 않고, 용이하게 실내 온도 (RT)에서 생리 학적으로 관련된 조건 (12)의 넓은 범위에 걸쳐 일어날 수있다. 개념의 증거로, Brevundimonas의 diminuta에서 phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1)는 OMV (13) 파생 대장균으로 포장하기 위해 선택되었다. PTE는 이핵 아연 / 아연 활성 부위를 포함하고 dialkylphosphates 및 아릴 알코올 (14)에 aryldialkylphosphates 변환 가수 분해 반응을 통해 유기 인산 화합물을 분해 할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 유기 인산 화합물에 노출되면 신경 근육 접합부 보는 건에서 아세틸 콜린 에스 테라 제에 의해 아세틸 콜린의 가수 분해를 억제을 통해 적절한 신경 전달 물질의 기능을 손상15 극도로 위험한 g의 유기 인산 화합물 유래 화합물 등을들 수있다. 장기간 또는 유기 인산 화합물에 상당한 노출은 일반적으로 통제 할 수없는 경련을 초래 일반적으로 질식을 통해 죽음을 발생합니다. PTE가 paraoxon 향해 높은 촉매 활성을 나타내는 반면, 매우 강력한 살충, 또한 다른 살충제 및 V / G 형 화학 신경 제제 (16)의 넓은 범위를 가수 분해 할 수있다. OMV 패키징을 용이하게하기 위해, 박테리아 플라스미드는 유도 성 프로모터하는 주변 세포질 위치 파악 시퀀스 및 SC 유전자 서열 상류 짧은 다중 클로닝 부위를 포함하는 유전자 구조를 인코딩되도록 설계 하였다. OMV 포장에 대한 주변 세포질 공간으로 PTE-SC 융합 단백질을 대상으로하는 유전자 스위치의 생성을 허용하는 지도자와 SC 시퀀스 사이의 PTE 유전자의 삽입. 여기서 설명하는 노력이 PTE에 집중하지만, 효소 유전자가 상호 교환 용이 FAC 다른 유전자 서열로 대체 될 수있다다른 효소 또는 단백질의 ilitate 포장. 합성 링크의 두 번째 부분으로 풍부 외막 단백질 (하는 OmpA)는 ST의 단백질 서열을 제공하도록 선택된다. 변할 수 앵커 단백질의 선택은, 단백질은 원형질막 주위 공간에 표시하는 허용 도메인이 세포 독성을 유발하지 않고 융합 구조를 견뎌 것이 중요하면서 재조합 때, OMV에 존재하는 것으로 알려져 있으며, 응집하지 않는다 생산했다. 높게하는 OmpA 박테리아 외막 이후 OMV (17)에 표시 될 것으로 알려진 37.2 kDa의 포린 횡단 단백질이다. 그것은 작은 분자의 운반에 관여하고, 박테리아 막 (18)을 가로 질러 크기가 2 nm의 &lt;. 네이티브하는 OmpA 두 구조적 고유 도메인, 경막 베타 배럴 모티브 및 펩티도 글리 칸 (19)과 상호 작용하는 것으로 알려진 periplasmically 수용성 C 말단 부분을 가진다. 돌연변이하는 OmpA-ST 융합 고안에서D 여기하는 OmpA의 C 말단 부분은 삭제하고, ST는 periplasmically 직면 N- 또는 C 말단에 융합되었다. 하는 OmpA의 주변 세포질 부분을 삭제하면 외막과 하이퍼 수포 7로 이어지는 막 불안정의 결과로 펩티도 글리 사이의 상호 작용의 수를 감소시킨다. 게놈하는 OmpA은 총 멤브레인 불안정을 완화하는 재조합 발현하는 OmpA-ST 구조 이외에 유지 하였다.

<table><tbody><tr><td>IPTG</td><td>Any</td><td></td><td>Always prepare fresh or aliquot and freeze.</td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>Any</td><td></td><td>Can be prepared ahead of time and stored at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Any</td><td></td><td>Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Chloramphenicol&amp;nbsp;</td><td>Any</td><td></td><td>Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TB/LB Culture Media</td><td>Any</td><td></td><td>Other growth medias will likely work similarly.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Any</td><td></td><td>One of many potential suitable surfactants.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Baffled culture flasks</td><td>Any</td><td></td><td>The baffles promote higher levels of aeration.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CHES</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP318-100</td><td>Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH &gt; 8).</td></tr><tr><td>Paraoxon</td><td>Chem Service</td><td>N-12816</td><td>Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Syringe Filter 0.45 &amp;micro;m</td><td>Thermo Scientific</td><td>60183-221 (30 mm)</td><td>Filter diameter will depend on volume of sample. Low protein binding membrane is critical.</td></tr><tr><td>Shaker incubator</td><td>New Brunswick</td><td>Excella E24</td><td>Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall Culture Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>RC 5B PLUS</td><td>Large volume (500 ml) culture centrifuge capable of 7,000 x g.</td></tr><tr><td>Sorvall Ultracentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>WX Ultra 90</td><td>Capable of centrifugal forces &amp;ge;150,000 x g.</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>AH-629</td><td>Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes (25 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td>Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.</td></tr><tr><td>Spectrophotometer&amp;nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Infinite M1000</td><td>Necessary for enzyme kinetic assays.</td></tr><tr><td>DLS/particle tracking</td><td>NanoSight&amp;nbsp;</td><td>LM10</td><td>Necessary for OMV size distribution and concentration determination.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BL21(DE3)</td><td>NEB</td><td></td><td>Suitable bacterial expression strain.</td></tr><tr><td>pET22</td><td>EMD Millipore</td><td>69744-3</td><td>Other plasmids can be used in place of these.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pACYC184</td><td>NEB</td><td></td><td>Other plasmids can be used in place of these.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Example kit.</td></tr></tbody></table>

directed protein packaging within outer membrane vesicles from escherichia coli: design, production and purification

외막 소체 (OMV)를 프로그래밍하는 합성 생물학 기술을 적용 점점 관심은 기존의 나노 입자를 합성하기에 너무 어려운 증명 OMV에 대한 몇 가지 매우 흥미로운 독특한 응용 프로그램을 선도하고 있습니다. 지금까지 모든 그람 음성균은 소분자, 펩티드, 단백질, 및 유전 물질을 포함하는화물의 다양한 OMV 시연 용기를 생산하는 것으로 나타났다. 그들의 다양한화물 바탕 OMV 셀 - 셀 통신에서 유전자 전달과 박테리아 OMV를 생성하는 의존 독성 인자의 전달에 이르기까지 여러 생물학적 과정에 연루되어있다. 최근 세균 OMV 제어하고 OMV 재조합 단백질을 직접 포장 기술의 개발을 통해 다양한 애플리케이션에 걸쳐 사용하기 위해 액세스 될 수있다. overa 개선이 프로토콜은 생산, 정제 방법, 및 효소 패키지 OMV 사용 제공 설명재조합 효소 증가 수포 및 향상된 효소의 안정성 게요 생산. 이 프로토콜의 성공적인 이용은 동시에 재조합 단백질을 생산하고, 재조합 단백질과 외막 사이에 앵커 단백질 합성 결합을 통해 생성 OMV 밀봉 용을 지시하는 균주의 생성한다. 제약 약물 전달, 의료 진단 및 환경 개선 :이 프로토콜은 또한 다른 고유 한 애플리케이션에 사용하기 위해이 프로토콜을 채택 할 때 고려해야 할 박테리아 문화뿐만 아니라 적절한 처리 기술과 일에서 OMV를 분리하기위한 방법을 자세히 설명합니다.

이 프로토콜에 설명 된 OMV 패키징 전략을 필요로 두 가지 재조합 단백질의 동시 발현은 다른 도로의 숫자를 통해 달성 될 수있다. 여기서, 두 벡터 시스템은 복제 분리 유도 유전자 카세트 호환 기원 이용 하였다. PTE-SC의 발현하는 아라비 노스 유도 성 유전자 카세트와 같은 효소 유전자의 클로닝을 용이하게하는 독특한 제한 부위의 시리즈 다음 세포질 파악 리더 서열 아?...

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Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

에서 외부 막 소포 내에서 감독 단백질 포장<em&gt; 대장균</em&gt; : 디자인, 생산 및 정제

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

directed-protein-packaging-within-outer-membrane-vesicles-from

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

13.3K 조회수.  Naval Research Laboratory. A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented. 

비디오: Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

생산, 결정화 및 구조 결정의<em&gt; C. 남과 어울리지 않는</em&gt; PPEP-1 Microseeding 및 아연 SAD를 통해

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

연구

생화학

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, &#945;-helical and &#946;-barrel. While &#945;-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, &#946;-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite &#946;-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target &#946;-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

&#946;-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of &#946;-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

화학

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

대장균의 이종 식에 의한 멤브레인 수송기의 특성화 및 멤브레인 소포 생산

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

설계 및 인공 세포 외 기질의 건설 (aECM) 단백질에서<em&gt; 대장균</em&gt; 피부 조직 공학

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

생체공학

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity of cells within a test tube. By obviating the need to maintain the viability of the cell, and by eliminating the cellular barrier, CFPS has been foundational to emerging applications in biomanufacturing of traditionally challenging proteins, as well as applications in rapid prototyping for metabolic engineering, and functional genomics. Our methods for implementing an E. coli-based CFPS platform allow new users to access many of these applications. Here, we describe methods to prepare extract through the use of enriched media, baffled flasks, and a reproducible method of tunable sonication-based cell lysis. This extract can then be used for protein expression capable of producing 900 &#181;g/mL or more of super folder green fluorescent protein (sfGFP) in just 5 h from experimental setup to data analysis, given that appropriate reagent stocks have been prepared beforehand. The estimated startup cost of obtaining reagents is $4,500 which will sustain thousands of reactions at an estimated cost of $0.021 per &#181;g of protein produced or $0.019 per &#181;L of reaction. Additionally, the protein expression methods mirror the ease of the reaction setup seen in commercially available systems due to optimization of reagent pre-mixes, at a fraction of the cost. In order to enable the user to leverage the flexible nature of the CFPS platform for broad applications, we have identified a variety of aspects of the platform that can be tuned and optimized depending on the resources available and the protein expression outcomes desired.

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

This protocol details the steps, costs, and equipment necessary to generate E. coli-based cell extracts and implement in vitro protein synthesis reactions within 4 days or less. To leverage the flexible nature of this platform for broad applications, we discuss reaction conditions that can be adapted and optimized.

대장균-셀 무료 단백질 합성 기반: 강력 하 고 유연 하며 액세스할 수 있는 플랫폼 기술에 대 한 프로토콜

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery vehicles and enzyme scaffolds. Due to their biocompatibility and tunability on the genetic level, Elastin-like proteins (ELP) are ideal building blocks for biotechnological and biomedical applications. Nevertheless, the assembly of protein based supramolecular structures with distinct physiochemical properties and good encapsulation potential remains challenging.
Here we provide two efficient protocols for guided self-assembly of amphiphilic ELPs into supramolecular protein architectures such as spherical coacervates, fibers and stable vesicles. The presented assembly protocols generate Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) based on ELPs with adaptable physicochemical properties. PMBCs demonstrate phase separation behavior and reveal method dependent membrane fusion and are able to encapsulate chemically diverse fluorescent cargo molecules. The resulting PMBCs have a high application potential as a drug formulation and delivery platform, artificial cell, and compartmentalized reaction space.

At the interface of organic and aqueous solvents, tailored amphiphilic elastin-like proteins assemble into complex supramolecular structures such as vesicles, fibers and coacervates triggered by environmental parameters. The described assembly protocols yield Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) with tunable properties, enabling the encapsulation of various cargo.

엘라스틴과 같은 단백질을 체외에서 정의된 수분자 구조 및 화물 캡슐화로 조립하도록 지시

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

생물학

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of conventional light microscopes. As the resolution for a given microscope cannot be easily enhanced, we present protocols to transform the small rod-shaped gram-negative Escherichia coli (E. coli) and gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) into larger, easily imaged spherical forms called spheroplasts or protoplasts. This transformation allows observers to rapidly and clearly determine whether peptides lodge themselves into the bacterial membrane (i.e., membrane localizing) or cross the membrane to enter the cell (i.e., translocating). With this approach, we also present a systematic method to characterize peptides as membrane localizing or translocating. While this method can be used for a variety of membrane-active peptides and bacterial strains, we demonstrate the utility of this protocol by observing the interaction of Buforin II P11A (BF2 P11A), an antimicrobial peptide (AMP), with E. coli spheroplasts and B. megaterium protoplasts.

Here we present a protocol to produce gram-negative Escherichia coli (E. coli) spheroplasts and gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplasts to clearly visualize and rapidly characterize peptide-bacteria interactions. This provides a systematic method to define membrane localizing and translocating peptides.

생산 및 항균 성 펩 티 드 지역화 특성 세균 Spheroplasts Protoplasts의 시각화

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules derived from the parental cells. EVs function as intra- and inter-species communication vectors while also contributing to the interaction between bacteria and host organisms in the context of infection and colonization. Given the multitude of functions attributed to EVs in health and disease, there is a growing interest in isolating EVs for in vitro and in vivo studies. It was hypothesized that the separation of EVs based on physical properties, namely size, would facilitate the isolation of vesicles from diverse bacterial cultures. 
The isolation workflow consists of centrifugation, filtration, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography (SEC) for the isolation of EVs from bacterial cultures. A pump-driven tangential flow filtration (TFF) step was incorporated to enhance scalability, enabling the isolation of material from liters of starting cell culture. Escherichia coli was used as a model system expressing EV-associated nanoluciferase and non-EV-associated mCherry as reporter proteins. The nanoluciferase was targeted to the EVs by fusing its N-terminus with cytolysin A. Early chromatography fractions containing 20-100 nm EVs with associated cytolysin A - nanoLuc were distinct from the later fractions containing the free proteins. The presence of EV-associated nanoluciferase was confirmed by immunogold labeling and transmission electron microscopy. This EV isolation workflow is applicable to other human gut-associated gram-negative and gram-positive bacterial species. In conclusion, combining centrifugation, filtration, ultrafiltration/TFF, and SEC enables scalable isolation of EVs from diverse bacterial species. Employing a standardized isolation workflow will facilitate comparative studies of microbial EVs across species.

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Bacteria secrete nanometer-sized extracellular vesicles (EVs) carrying bioactive biological molecules. EV research focuses on understanding their biogenesis, role in microbe-microbe and host-microbe interactions and disease, as well as their potential therapeutic applications. A workflow for scalable isolation of EVs from various bacteria is presented to facilitate standardization of EV research.

대장균 및 다른 박테리아로부터의 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

에서 외부 막 소포 내에서 감독 단백질 포장

요약

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생산, 결정화 및 구조 결정의