연구는 국립 연구소의 알레르기와 감염 증 (NIAID NIH) 수상 R15AI079685에 의해 지원 되었다.

1. 솔루션 준비
참고: 대장균 spheroplasts 및 B. megaterium protoplasts를 각각 일으키기 위하여 1.1-1.9, 1.8-1.11 단계에 설명 된 솔루션을 준비 합니다.
<ol><li>1 준비 M Tris-Cl, pH 7.8 10.34 g Tris HCl와 dH2O 125 mL 플라스 크에 50 mL에 트리 스 오의 4.17 g을 용 해 하 여. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.</li>
	<li>0.10 g MgCl2 (95.2 g/mol) 및 25 mL dH2O 125 mL 플라스 크에 11.98 g 자당 (342.3 g/mol)을 용 해 하 여 솔루션 (20 m m MgCl2, 0.7 M 자당, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8)를 준비 합니다. 500 µ L을 추가 1 M Tris-Cl (pH 7.8) 50 mL를 볼륨을 조정. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.</li>
	<li>0.05 g MgCl2 (95.2 g/mol) 및 25 mL dH2125 mL 플라스 크에 O 13.69 g 자당 (342.3 g/mol)을 용 해 하 여 솔루션 B (10 m m MgCl2, 0.8 M 자당, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8)를 준비 합니다. 500 µ L을 추가 1 M Tris-Cl (pH 7.8) 50 mL를 볼륨을 조정. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.</li>
	<li>50 mL dH2125 mL 플라스 크에 O 13.69 g 자당 (342.3 g/mol)을 용 해 하 여 0.8 M 자당을 준비 합니다. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.</li>
	<li>5 mg/mL deoxyribonuclease 준비 나 (DNase 나) 0.015 g DNase를 용 해 하 여 dH2O 50 mL 플라스 크에 3 mL에 나. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독. Aliquot 솔루션 microfuge 관으로-20 ° c.에 게</li>
	<li>0.125 M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 준비, EDTA disodium 0.698 g을 용 해 하 여 pH 8.0으로 15 mL dH2O 125 mL 플라스 크에 (372.2 g/mol)를 탈수. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.</li>
	<li>세 팔 렉 신 하이드 레이트 (365.404 g/mol) dH2O 125 mL 플라스 크에 50 ml에서의 0.03 g을 용 해 하 여 600 µ g/mL 세 팔 렉 신을 준비 합니다. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 및 4 ° c.에 원뿔 튜브에 저장</li>
	<li>5 mg/mL lysozyme 0.015 g lysozyme dH2O 50 mL 플라스 크에 3 mL에 용 해 하 여 준비 합니다. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독. Aliquot 솔루션 microfuge 관으로-20 ° c.에 게</li>
	<li>DH2O 2 L 플라스 크에 1 리터에 TSB의 30 g을 용 해 하 여 3 %w / v Trypticase 간장 국물 (TSB)를 준비 합니다. 약 수 25 mL 100 mL TSB 각각 대장균 spheroplasts 또는 B. megaterium protoplasts, 의 준비에 사용할 수를 포함 하는 플라스 크에 솔루션. 오토 클레이 브 소독 액체 매체를 플라스 크입니다. 살 균 TSB 실내 온도 또는 4 ° C에서 저장 될 수 있다</li>
	<li>34.23 g 자당 (342.3 g/mol), 0.46 g maleic 산 (116.07 g/mol), 그리고 0.38 g MgCl2 (95.21 g/mol) dH2O 250 mL 플라스 크에 100 mL에 용 해 하 여 솔루션 C (1 M 자당, 0.04 M maleate, 0.04 M MgCl2, pH 6.5)를 준비 합니다. PH 6.5 조정 합니다. 0.2 µ m 막으로 25mm 주사기 필터를 통해 필터링 하 여 소독 하 고 실 온에서 원뿔 튜브에 저장 합니다.</li>
	<li>100 mL 3 %w / v TSB와 100 mL 해결책 C 1 리터 유리병에 혼합 하 여 200 mL 원생 동물 매체를 준비 합니다. 오토 클레이 브 소독 솔루션을 상 온에서 저장.</li>
</ol>2입니다. 준비의 숙박 문화
참고: 섹션 2-4 적절 한 무 균 기술을 사용 하 여 수행 합니다. 원하는 경우, 세균성 긴장을 잠재적인 오염 줄이기 위해 항생제 내성에 대 한 플라스 미드를 포함할 수 있습니다. 항생제 저항 긴장을 사용 하 여, 단계 2.1, 3.1-3.2, 그리고 4.1-4.4에에서 필요한 항생제를 추가 합니다.
<ol><li>살 균 피 펫 팁을 사용 하 고 3 %w / v TSB의 2-3 mL를 포함 하는 14 mL 문화 관으로 배치 박테리아에의 한 식민지를 선택 하 여 숙박 문화를 준비 합니다. 16-21 h를 흔들어 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
</ol>3. 그람 음성의 대장균 Spheroplasts의 준비
<ol><li>250 mL 플라스 크에 25 mL 볼륨 3 %w / v TSB의 숙박 문화 1: 100 희석 하 고 37 ° C에서 세균성 솔루션 솔루션 600 0.5-0.8의 광학 밀도 도달 했습니다 때까지 약 2.5 h를 흔들어 동안 품 어 nm. 분 광 광도 계를 사용 하 여 광학 밀도 측정 합니다.</li>
	<li>250 mL 플라스 크에 희석이 문화 1:10 3 %w / v TSB의 30 ml에서 및 2.5 h 60 µ g/mL 세 팔 렉 신 (347.4 g/mol) 단일 셀 필 라 멘 트의 약 생산의 존재를 흔들어 동안 37 ° C에서 품 어 50-150 µ m 길이에서 는 가벼운 현미경 (그림 1B)를 사용 하 여 1000 X 배율에서 관찰.</li>
	<li>1500 x g, 4 분 Decant 4 ° C에서 세균성 솔루션 centrifuging 여는 필 라 멘 트를 수확 하 고 상쾌한, 펠 릿 예약 취소.</li>
	<li>부드럽게 되는 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 하는 0.8 M 자당의 1 mL을 추가 하 여는 필 라 멘 트를 씻어. 1 분 동안 incubate 고은 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>150 µ L 1의 추가 M Tris-Cl (pH 7.8), lysozyme 5 mg/mL의 120 µ L, 5 mg/mL DNase의 30 µ L, 그리고 펠 릿을 주문 하 고 10 분 동안 실내 온도에 솔루션을 품 어는 그들의 각각에서 0.125 M EDTA의 120 µ L.</li>
	<li>추가 솔루션의 1 mL 점차적으로 1 분 이상 3.5 동안 부드럽게 손으로 솔루션을 소용돌이 micropipette를 사용 하 여 준비 하는 솔루션을 합니다. 실 온에서 4 분에 대 한 솔루션을 품 어.</li>
	<li>두 개의 15 mL 원뿔 튜브에 4 ° C 솔루션 B의 7 mL를 넣어. 이 두 튜브의 각 3.6에서 준비 하는 솔루션의 동일 금액을 추가 합니다. 1500 x g, 4 분 4 ° C에서 솔루션 원심</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 조심 스럽게 제거 1-의 2 개 mL 상쾌한 제외 하 고 모두는 펠 렛을 방해 하지 않고. 부드럽게 P1000 micropipette를 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 펠 릿을 resuspend. 시각적으로 확인 spheroplasts 형성 1000 X 확대 가벼운 현미경 (그림 1C)을 사용 하 여 샘플을 관찰 하 여.</li>
	<li>-20 ° C에서 1 주까지 또는 그들은 3 freeze-thaw 주기를 통해 갈 때까지 spheroplasts를 저장 합니다.</li>
</ol>4. 그람 양성 B. megaterium Protoplasts의 준비
<ol><li>250 mL 플라스 크에 희석 3 %w / v TSB의 100 mL에서 하룻밤 문화 1:1,000 하 고 37 ° C에서 세균성 솔루션 솔루션 0.9-의 광학 밀도 도달 했습니다 때까지 약 4.5 h 흔들어 동안 품 어 1.0 600 nm. 분 광 광도 계를 사용 하 여 광학 밀도 측정 합니다.</li>
	<li>2 50 mL 원뿔 튜브와 2000 x g, 10 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기에 액체 문화를 부 어.</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 두 원뿔 튜브에서 상쾌한을 삭제 합니다. 2.5 mL 원생 동물 매체에 각 펠 릿을 resuspend 하 고 resuspended 솔루션을 결합 하 여 단일 원뿔 관으로. 125 mL 플라스 크에 결합 된 resuspended 솔루션 플라스틱</li>
	<li>5 mg/mL lysozyme의 1 mL을 추가 하 고 37 ° C에서 1 시간 흔들어 동안 품 어.</li>
	<li>1000 배 확대 가벼운 현미경, 부정, 분야 (그림 2) 대신 부 봉으로 표시 되는 박테리아와 같은 지적을 사용 하 여 아래 protoplasts의 증가 모니터링 합니다. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 솔루션 15 mL 원뿔 튜브와 2000 x g, 10 분 동안 4 ° C에서 원심 전송.</li>
	<li>가만히 따르다는 상쾌한 고 다시 5 mL 원생 동물 미디어에 펠 릿을 중단. -20 ° C에서 1 주까지 또는 그들은 3 freeze-thaw 주기를 통해 갈 때까지 protoplasts를 저장 합니다.</li>
</ol>5. 펩타이드 솔루션 및 이미징 막 염료의 준비
<ol><li>
펩 티 드 솔루션
	<ol>
<li>알루미늄 호 일에 싸여 microfuge 관, FITC BF2 P11A 800 µ L dH2오 사용 펩 티 드 단백질 농도 측정을 수행 하려면 적어도 하나의 트립토판 잔류물을 포함 표시의 2 밀리 그램을 디졸브.</li>
		<li>280에서 펩 티 드 용액의 흡 광도 측정 하는 spectrophotometrically, 3 중에 nm. 트립토판 (5,700/Mcm)에 대 한 어 금 니 소멸 계수를 사용 하 여 펩 티 드 농도 계산 합니다.</li>
		<li>DH-20 ° C에서 microfuge 관에서 100-200 µ M. 저장소의 최종 농도에2O 빛 으로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일에 싸여 있는 펩 티 드 농도 희석.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
막 염료
	<ol>
<li>Microfuge 관에서 DMSO의 843.3 µ L에 디-8-ANEPPS의 5 mg를 용 해 하 여 디-8-ANEPPS (592.9 g/mol)의 10 m m 재고를 준비 합니다. 빛 으로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일에 싸서 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
		<li>Microfuge 관에서 10 m m 디-8-ANEPPS의 3 µ L 997 µ L DMSO를 추가 하 여 0.03 m m 디-8-ANEPPS의 1 mL를 준비 합니다. 빛 으로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일에 싸서 4 ° C에서 microfuge 관에 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 대장균 Spheroplasts 및 B. megaterium Protoplasts를 사용 하 여 Confocal 현미경 검사 법의 시각화
<ol><li>Spheroplasts 또는 protoplasts 폴 리-L-리 신 코팅된 유리 슬라이드에 5 µ L 플라스틱 FITC 앰프 (100-200 µ M) 슬라이드에 표시 된의 2 µ L을 추가 하 고 빛 으로부터 보호 하는 3 분 동안 품 어.</li>
	<li>슬라이드에는 막 염료 디-8-ANEPPS (0.03 m m)의 1 µ L을 추가 하 고 빛 으로부터 보호 하는 3 분 동안 품 어. 유리 coverslip로 커버 하 고 매니큐어와 함께 인감.</li>
	<li>Confocal 현미경 및 아르곤 레이저를 켭니다. 20% 전원 출력을 20% 전송 아르곤 레이저를 조정 합니다.</li>
	<li>각각 499-532 nm와 FITC 표시 된 펩 티 드 방출 채널 및 디-8-ANEPPS-표시 막 염료 방출 채널, 670-745 nm의 방출 파장 범위를 설정 합니다.</li>
	<li>이미지 protoplasts 또는 spheroplasts (그림 1 및 그림 2) 63 X 목표. 8 비트를 이미징 소프트웨어를 사용 하 여, 512 x 512 복합 z-스택 이미지 구성 0.5 µ m 조각 spheroplast 또는 원생 동물의 전체. 참고: 이미징 spheroplasts 및 protoplasts 동안 피가 통해 방출 감소를 신중 하 게 고려 걸릴. 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오.</li>
</ol>7입니다. 앰프 지역화의 특성
<ol><li>이미징 소프트웨어에 복합 z-스택 이미지를 엽니다. Spheroplast 또는 원생 동물의 센터-대부분 슬라이스를 찾아서 한 원형 지역의 관심 (ROI)을 배치 (직경에서 0.3 μ m) 막 (ROI 1), spheroplast 또는 원생 동물 (ROI 2)의 중심에와 spheroplast 또는 측정 하는 원생 동물에 배경 형광 (ROI 3) (그림 5) 포화 픽셀의 포함을 하지 마십시오. 이미징 소프트웨어에 의해 각 ROI의 형광 강도 계산할 수 있습니다. 참고: 경우에 펩 티 드를 막의 전체를 지역화 하지 않습니다, 그릴 때 투자 수익 1 펩 티 드 지역화는 막의 지역에.</li>
	<li>다음 방정식을 사용 하 여 막 펩 티 드 형광 강도 세포내 펩 티 드 형광 강도의 비율 결정. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57904/57904eq1.jpg"> 참고: 투자 수익 3에서 형광 강도에서 뺍니다 2 투자 수익 및 투자 수익 1 형광 강렬 배경 형광에 대 한 계정을 위해.</li>
</ol>

<ol>
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A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+peptide+translocation+into+large+unilamellar+vesicles.">Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles.</a> J Vis Exp. (59), e3571 (2012).</li><li>van der Kraan, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactoferrampin:+a+novel+antimicrobial+peptide+in+the+N1-domain+of+bovine+lactoferrin.">Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin.</a> Peptides. 25 (2), 177-183 (2004).</li><li>Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+electrophysiology+for+the+study+of+bacterial+ion+channels+in+giant+spheroplasts+of+E.+coli.">Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli.</a> Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).</li><li>Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+proline+position+on+the+antimicrobial+mechanism+of+buforin+II.">Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II.</a> Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).</li><li>Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+the+Novel+Antimicrobial+Peptide+Buforin+2+with+Lipid+Bilayers:+Proline+as+a+Translocation+Promoting+Factor.">Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor.</a> Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).</li><li>Decad, G. M., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+Membrane+of+Gram-Negative+Bacteria+XII.+Molecular-Sieving+Function+of+Cell+Wall.">Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall.</a> J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).</li><li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell,+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+Escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15.">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).</li><li>Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melittin-Induced+Permeabilization,+Re-sealing,+and+Re-permeabilization+of+E.+coli+Membranes.">Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes.</a> Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).</li><li>Ruthe, H. J., Adler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+bacterial+spheroplasts+by+electric+fields.">Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields.</a> Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언 됩니다.

여기에 제시 된 프로토콜 연구자를 더 빠르게 세균 이미지의 더 큰 샘플 크기 확대, 구형 박테리아, 오리엔트, 찾아서 이미지를 훨씬 더 쉽게 하기 때문에 가능 하 게. 이 향상 된 기능은 데이터를 수집 하는 여러 가지 면에서 유용 합니다. 첫째, 펩 티 드 지역화 패턴의 체계적인 정량 분석을 수 있습니다. 동안 질적 동향은 이미지의 작은 세트에서 설명 될 수 있다, 높은-품질의 이미지의 큰 샘플 집...

항균 성 펩 티 드 (암페어)는 기존의 항생제1,2,3,,45대 안으로 그들의 잠재적인 사용 주의 얻고 있다. 앰프는 여 세포 막에 걸쳐 translocating 핵 산 또는 세포내 구성 요소와 상호 작용 하는 셀 내용을6의 누설을 일으키는 막 permeabilizing 여 박테리아를 죽 일. 항생제로 그들의 사용 이외에 앰프를 translocating 수 있습니다 적응 시킬 약물 전달 응용 프로그램에 대 한 그들은 불 침투성 세포 막7,8교차 비 비정상적으로 수 있기 때문에. 우리, 따라서, 약물 디자인에 그들의 사용을 위한 기초를 누워 행동의 근본적인 앰프 메커니즘을 이해 하고자 합니다.
지역화 액션9,10,,1112, 의 자신의 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 하는 세균성 세포에 붙일 라벨의 패턴을 평가 하는 방법을 제공 하는 confocal 현미경 검사 법 13 , 14. 박테리아의 막의 라벨, 하나 붙일 레이블된 펩 티 드 막에 세균성 세포의 세포내 공간 localizes 경우 확인할 수 있습니다. 그러나,이 기술은 기존의 가벼운 현미경의 해상도 한계 및 슬라이드15에 박테리아의 변수 방향 도전 이미징 할 수 있는 박테리아의 작은 크기와 막대 모양에 의해 제한 됩니다.
Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 붙일 레이블된 펩 티 드 지역화 패턴의 향상 된 시각화 수 있도록 제시 방법의 목표가입니다. 시각화는 작고, 얇은, 막대 모양의 그람 음성의 대장균 (대장균) 및 그람 양성 간 균 megaterium (B. megaterium)를 설정 하 여 향상 된 확대, 둥근 형태로 박테리아 라고도 (그람 음성 긴장)에 대 한 spheroplasts 그리고 protoplasts (그람 양성 긴장)에 대 한16,17,18,19,,2021. Spheroplasts와 protoplasts는 그들의 증가 크기와 그 영상에 대 한 관련성이 없는 슬라이드에 박테리아의 방향을 만드는 그들의 대칭 모양 때문에 이미지 하기 쉽습니다. 또한, 우리는 양적 앰프 중 막 지역화 또는 translocating로 성격을 나타내기 위하여 confocal 현미경 검사 법 데이터를 분석 하는 체계적인 접근 방법을 제시. 이러한 방법을 적용 쉽게 구별에 놓여있는지 펩 티 드 지역화 패턴 표시 있습니다. 여기에 제시 된 프로토콜은 다양 한 앰프, 세포 관통 펩 티 드를 포함 하 여 다른 막-활성 에이전트의 지역화를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.
뚜렷한이 기술의 장점은 그것 셀이15, 일반적으로 식별 하는 데 사용 하는 다른 형광 분석에 반대를 공개 수 있습니다 단일 세포 수준에서의 행동의 메커니즘에 통찰력을 제공 하나는 대량 견적9,22,23,,2425만 제공 하는 앰프의 행동의 메커니즘. Spheroplasts 및 protoplasts 앰프 셀 항목을 평가 사용 때문에 지질 소포24등 셀 항목을 평가 하기 위해 사용 되는 다른 모델 보다 더 순수 관련15 특정 유용한26 입니다.

<table><tbody><tr><td>Trizma hydrocloride (Tris HCl)</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base (Tris OH)</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I</td><td>Sigma</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma</td><td>106361</td><td>Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement</td></tr><tr><td>Cephalexin hydrate</td><td>Sigma</td><td>C4895</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td>BBL Trypticase soy broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>B11768</td><td></td></tr><tr><td>BF2 P11A FITC</td><td>NeoScientific</td><td>Custom ordered</td><td></td></tr><tr><td>di-8-ANEPPS</td><td>Biotium</td><td>61012</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>34869</td><td>Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement</td></tr><tr><td>Maleic acid</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 &amp;mu;m HT Tuffryn Membrane</td><td>Pall Corporation</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5 II</td><td>For image acquisition</td></tr><tr><td>Leica Application Suite, Advanced Fluorescence</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>For image processing</td></tr></tbody></table>

production and visualization of bacterial spheroplasts and protoplasts to characterize antimicrobial peptide localization

박테리아 내에서 펩 티 드 지역화 패턴을 평가 하는 방법으로 confocal 현미경 검사 법의 사용은 일반적으로 기존의 가벼운 현미경의 해결책 한계에 의해 억제 됩니다. 선물이 작은 막대 모양의 그람 음성의 대장균 (대장균) 및 그람 양성 간 균 megaterium (B. megaterium) 변환 하는 프로토콜 특정된 현미경에 대 한 해상도 쉽게 향상 될 수 없습니다, 더 큰, 쉽게 군데 둥근 모양으로 spheroplasts 또는 protoplasts 라고합니다. 이 변환 관찰자를 펩 티 드 (즉, 막 지역화) 세균 막으로 자신을 결 사 또는 교차 하는 셀 (예: translocating) 입력을 막 신속 하 고 명확 하 게 결정할 수 있습니다. 이 방법을 우리는 또한 막 지역화 또는 translocating으로 펩 티 드를 특성화 하는 체계적인 방법을 제시. 이 메서드를 사용 하 여 막 활성 펩 티 드 및 세균성 긴장의 다양 한 수, 있지만 우리 Buforin II P11A의 상호 작용을 관찰 하 여이 프로토콜의 유틸리티 설명 (BF2 P11A), 대장균 과 항균 성 펩타이드 (AMP), spheroplasts 및 B. megaterium protoplasts입니다.

박테리아를 확대 하 고 구형, 여 우리가 쉽게 펩 티 드 세균 막에 지역화 또는 세균 막에 걸쳐 이동 쉽게 구분할 수 있습니다. 기존의 가벼운 현미경의 해상도 한계 게 도전 막에 지역화 신호 겹칠 나타납니다 때문에 막 또는 정상적인 박테리아 세포내 공간에서 펩 티 드 신호 발생 여부를 구별 하는 세포내 공간 (그림 3A)입니다. 반면, 확대의 크기 spher...

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Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

여기에 우리가 그람 음성의 대장균 (대장균)를 생산 하는 프로토콜을 현재 spheroplasts 및 그람 양성 간 균 megaterium (B. megaterium) 명확 하 게 시각화 하 고 빠르게 특성 protoplasts 펩 티 드-박테리아의 상호 막 지역화 및 펩 티 드 translocating를 정의 하는 체계적인 방법을 제공 합니다.

생산 및 항균 성 펩 티 드 지역화 특성 세균 Spheroplasts Protoplasts의 시각화

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

production-visualization-bacterial-spheroplasts-protoplasts-to

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K 조회수.  Wellesley College. 여기에 우리가 그람 음성의 대장균 (대장균)를 생산 하는 프로토콜을 현재 spheroplasts 및 그람 양성 간 균 megaterium (B. megaterium) 명확 하 게 시각화 하 고 빠르게 특성 protoplasts 펩 티 드-박테리아의 상호 막 지역화 및 펩 티 드 translocating를 정의 하는 체계적인 방법을 제공 합니다.

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Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in the cytoplasm. Commonly used methods for the display and screening of recombinant antibody libraries do not incorporate intracellular protein folding quality control, and, thus, the antigen-binding capability and cytoplasmic folding and solubility of antibodies engineered using these methods often must be engineered separately. Here, we describe a protocol to screen a recombinant library of single-chain variable fragment (scFv) antibodies for antigen-binding and proper cytoplasmic folding simultaneously. The method harnesses the intrinsic intracellular folding quality control mechanism of the Escherichia coli twin-arginine translocation (Tat) pathway to display an scFv library on the E. coli inner membrane. The Tat pathway ensures that only soluble, well-folded proteins are transported out of the cytoplasm and displayed on the inner membrane, thereby eliminating poorly folded scFvs prior to interrogation for antigen-binding. Following removal of the outer membrane, the scFvs displayed on the inner membrane are panned against a target antigen immobilized on magnetic beads to isolate scFvs that bind to the target antigen. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based secondary screen is used to identify the most promising scFvs for additional characterization. Antigen-binding and cytoplasmic solubility can be improved with subsequent rounds of mutagenesis and screening to engineer antibodies with high affinity and high cytoplasmic solubility for intracellular applications.

We provide a method to simultaneously screen a library of antibody fragments for binding affinity and cytoplasmic solubility by using the Escherichia coli twin-arginine translocation pathway, which has an inherent quality control mechanism for intracellular protein folding, to display the antibody fragments on the inner membrane.

항체 단편의 라이브러리를 스크리닝에 대한 세균 내부 멤브레인 디스플레이

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

연구

생화학

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

라이브 세포 형광 현미경을 사용하여 박테리아 독소 유도 응답의 시각화

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

면역학 및 감염병학

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all variations are based on the 20 canonical amino acids (cAAs). As a way to introduce additional physicochemical properties into polypeptides, the incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) is increasingly used in protein engineering. Due to their relatively short length, the modification of ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides by ncAAs is particularly attractive. New functionalities and chemical handles can be generated by specific modifications of individual residues. The selective pressure incorporation (SPI) method utilizes auxotrophic host strains that are deprived of an essential amino acid in chemically defined growth media. Several structurally and chemically similar amino acid analogs can then be activated by the corresponding aminoacyl-tRNA synthetase and provide residue-specific cAA(s) &#8594; ncAA(s) substitutions in the target peptide or protein sequence. Although, in the context of the SPI method, ncAAs are also incorporated into the host proteome during the phase of recombinant gene expression, the majority of the cell&#39;s resources are assigned to the expression of the target gene. This enables efficient residue-specific incorporation of ncAAs often accompanied with high amounts of modified target. The presented work describes the in vivo incorporation of six proline analogs into the antimicrobial peptide nisin, a lantibiotic naturally produced by Lactococcus lactis. Antimicrobial properties of nisin can be changed and further expanded during its fermentation and expression in auxotrophic Escherichia coli strains in defined growth media. Thereby, the effects of residue-specific replacement of cAAs with ncAAs can deliver changes in antimicrobial activity and specificity. Antimicrobial activity assays and fluorescence microscopy are used to test the new nisin variants for growth inhibition of a Gram-positive Lactococcus lactis indicator strain. Mass spectroscopy is used to confirm ncAA incorporation in bioactive nisin variants.

The protocol presents the Escherichia coli-based selective pressure incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) into the lactococcal antimicrobial peptide nisin. Its properties can be changed during recombinant expression via substitution with desired ncAAs in defined growth media. Resulting changes in bioactivity are mapped by growth inhibition assays and fluorescence microscopy.

정식이 아닌 아미노산의 선택적 압력 관에 의해 생산 하는 항균 성 펩 티 드

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

생체공학

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence microscopy. Super-resolution three-dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) is a promising tool to overcome this hurdle and reveal the molecular details of the process of germination of Bacillus subtilis (B. subtilis) spores. Here, we describe the use of a modified SIMcheck (ImageJ)-assistant 3D imaging process and fluorescent reporter proteins for SIM microscopy of B. subtilis spores&#8217; germinosomes, cluster(s) of germination proteins. We also present a (standard)3D-SIM imaging procedure for FM4-64 staining of B. subtilis spore membranes. By using these procedures, we obtained unsurpassed resolution for germinosome localization and show that &#62;80% of B. subtilis KGB80 dormant spores obtained after sporulation on defined minimal MOPS medium have one or two GerD-GFP and GerKB-mCherry foci. Bright foci were also observed in FM4-64 stained spores&#8217; 3D-SIM images suggesting that inner membrane lipid domains of different fluidity likely exist. Further studies that use double labeling procedures with membrane dyes and germinosome reporter proteins to assess co-localization and thus get an optimal overview of the organization of Bacillus germination proteins in the inner spore membrane are possible.

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinant receptor proteins cluster in &#8216;germinosomes&#8217; in the inner membrane of Bacillus subtilis spores. We describe a protocol using super resolution microscopy and fluorescent reporter proteins to visualize germinosomes. The protocol also identifies spore inner membrane domains that are preferentially stained with the membrane dye FM4-64.

Germinosomes과 새 균의 subtilis 포자에 내부 막의 시각화

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be affected by cell shape. Bacterial cells are three-dimensional (3D) objects, although they are rarely treated as such. Most microscopy techniques result in two-dimensional (2D) images leading to the loss of data pertaining to the actual 3D cell shape and localization of proteins. Certain shape parameters, such as Gaussian curvature (the product of the two principal curvatures), can only be measured in 3D because 2D images do not measure both principal curvatures. Additionally, not all cells lie flat when mounting and 2D imaging of curved cells may not accurately represent the shapes of these cells. Accurately measuring protein localization in 3D can help determine the spatial regulation and function of proteins. A forward convolution technique has been developed that uses the blurring function of the microscope to reconstruct 3D cell shapes and to accurately localize proteins. Here, a protocol for preparing and mounting samples for live cell imaging of bacteria in 3D both to reconstruct an accurate cell shape and to localize proteins is described. The method is based on simple sample preparation, fluorescent image acquisition, and MATLAB-based image processing. Many high-quality fluorescent microscopes can be simply modified to take these measurements. These cell reconstructions are computationally intensive and access to high-throughput computational resources is recommended, although not necessary. This method has been successfully applied to multiple bacterial species and mutants, fluorescent imaging modalities, and microscope manufacturers.

This protocol explains how to prepare and mount bacterial samples for live three-dimensional imaging and how to reconstruct the three-dimensional shape of E. coli from those images.

정확한 세포 표현과 정확한 단백질 국소화를 위한 세균 세포의 3차원 이미징

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be ...

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and mediates the delivery of protein and DNA substrates to target cells, a process generally requiring direct cell-to-cell contact. We have recently solved the structure of the Dot/Icm apparatus by cryo-electron tomography (cryo-ET) and showed that it forms a cell envelope-spanning channel that connects to a cytoplasmic complex. Applying two complementary approaches that preserve the native structure of the specimen, fluorescent microscopy in living cells and cryo-ET, allows in situ visualization of proteins and assimilation of the stoichiometry and timing of production of each machine component relative to other Dot/Icm subunits. To investigate the requirements for polar positioning and to characterize dynamic features associated with T4SS machine biogenesis, we have fused a gene encoding superfolder green fluorescent protein to Dot/Icm ATPase genes at their native positions on the chromosome. The following method integrates quantitative fluorescence microscopy of living cells and cryo-ET to quantify polar localization, dynamics, and structure of these proteins in intact bacterial cells. Applying these approaches for studying the Legionella pneumophila T4SS is useful for characterizing the function of the Dot/Icm system and can be adapted to study a wide variety of bacterial pathogens that utilize the T4SS or other types of bacterial secretion complexes.

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Imaging of bacterial cells is an emerging systems biology approach focused on defining static and dynamic processes that dictate the function of large macromolecular machines. Here, integration of quantitative live cell imaging and cryo-electron tomography is used to study Legionella pneumophila type IV secretion system architecture and functions.

레지오넬라 폐렴 구균 도트/Icm 분비 시스템의 시공간적 특징을 해결하기 위해 라이브 세포 이미징 및 극저온 단층 촬영 적용

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.

형광 항생제 프로브를 사용한 세균 저항성 시각화

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

Fluorescent Reporter 정량화를 통한 전체 장기 병원체 추적

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen cells within this diverse environment significantly affects their stress levels, responses, fate, and contribution to the overall progression of the disease and treatment failure. However, due to the technical difficulties in locating &#181;m-sized pathogen cells within cm-sized host organs, this area of research has been relatively unexplored. Here, we present a method for addressing this challenge. We employ serial two-photon tomography and AI-enhanced image analysis to locate individual Salmonella cells throughout the entire spleen, liver lobes, and whole lymph nodes of infected mice. Using fluorescent reporters and in vivo antibody administration, the replication rate of single Salmonella cells, their local interaction with specific immune cells, and bacterial responses to antibiotics can be determined. These methodologies open avenues for a comprehensive examination of infections, their prevention, and treatment within the three-dimensional tissue context.

저자 스포트라이트: Unraveling Bacterial Responses to Antibiotics and Immune System in Tissues(조직의 항생제 및 면역 체계에 대한 박테리아 반응 규명)

Here, we describe a procedure that enables organ-wide detection of pathogenic bacteria during infection and quantification of fluorescent reporter activities.

고분해능 3차원 전장기 단층촬영(High-resolution three-dimensional whole-organ tomography of microbial infections)

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

생산 및 항균 성 펩 티 드 지역화 특성 세균 Spheroplasts Protoplasts의 시각화

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고분해능 3차원 전장기 단층촬영(High-resolution three-dimensional whole-organ tomography of microbial infections)

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