This work was supported by NIDDK grants DK098143 and DK101530 from the NIH (JPA), Stanford's Spectrum Child Health Research Institute (CHRI) and SPARK (UL1 TR001085, JPA).

이 프로토콜은 의학 스탠포드 대학의 기관 동물 보호 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 수행 하였다. 섬 세포 복제 평가를위한 384 웰 플레이트 228 우물을 생성하기에 충분하다 - (9 주 이전 8) 남성 스프 라그 돌리 쥐, 300g - 기술 된 프로토콜은 여섯 250 섬의 격리를 위해 조정됩니다. 1. 재료 준비 <ol><li> 15cm 조직 배양 접시 (28)에서 3 일간 합류 유지 804G 래트 방광 종양 세포의 조절 매체 (RPMI1640 20 mL)을 수집하여 아일렛 분리를 개시하기 전에 피복 매체를 준비한다. 살균 필터 저장소 (-20 ° C) 나중에 사용하기 위해 조정 배지. </li><li> 수술 도구를 소독 (한 12cm 톱니 조직 포셉, 하나 11.5 cm 미세 가위, 하나 14.5 cm 수술 가위, 두 개의 16 cm 곡선 집게, 한 12cm 곡선 지혈, 하나의 12cm 메스 핸들) 및 초기화하기 전에 한 30 메쉬 조직 체섬 격리를 iating. </li><li> 60 %를 용해하여 췌장 소화 솔루션을 준비 : 정제 클래스 I의 40 % 혼합물 : 클래스 II 콜라게나 (300,000의 총 콜라게나 제 활성 - 40 단위) 칼슘, 마그네슘 보충 1X 행크스 &#39;균형 소금 솔루션 (HBSS) 60 ㎖에. 로드 얼음에 1 &quot;22 G 바늘과 장소 10 ml의 주사기 (육)으로 췌장 소화 버퍼 10 ㎖. 주 : 소화 용액 10 ml를 래트 당 주입된다. 이에 따라 확장 할 수 있습니다. </li><li> 케타민 1.3 ㎖ (100 ㎎ / ㎖), 자일 라진, 0.2 ㎖ (100 ㎎ / ㎖) 및 3 ㎖의 PBS를 혼합하여 환기 후드 마취 칵테일 4.5 ml의 준비. 섬 격리를 개시 1 시간 이내에 마취 칵테일을 준비합니다. </li><li> 500ml의 HBSS에 신생 송아지 혈청을 25 ㎖를 첨가하여 세척 완충액을 준비한다. 나중에 사용하기 위해 얼음에 세척 버퍼를 놓습니다. </li><li> 낮은 혈당 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM), (5)의 500 ml의 인 섬 매체의 1 병을 준비합니다0 ㎖의 소 태아 혈청 (FBS), 페니실린의 5000 단위 / ml의 스트렙토 마이신 및 5000 ㎍ / ㎖의. </li><li> 2 % FBS, 2 mM의 글루타민, 5 mM의 포도당 페니실린의 5000 단위 / ㎖ 및 스트렙토 마이신 5,000 ㎍ / mL를 기능 / 생존력 용액 (500 ㎖)에서 췌장 기능 매체를 준비한다. 나중에 사용하기 위해 섬의 기능 매체 (4 °에 C)를 저장합니다. </li><li> 1X 인산 완충 식염수의 37.38 ㎖ (PBS)에 2.5 ml의 당나귀 혈청 및 0.12 ml의 트리톤 X-100을 추가하여 버퍼를 차단 40 ml의를 준비합니다. 나중에 사용하기 위해 저장 차단 버퍼 (4 °의 C). </li><li> 프로토콜을 시작하기 전에 필요한 항체를 얻습니다. 참고 : PDX-1 (TRITC)와 기-67 (FITC) 공동 염색은 기본 β 세포 복제 검사에 사용됩니다. 핵 (DAPI), PDX (Cy5에) 및 기-67 (FITC) 염색과 함께, 혈통 특정 복제 분석을 위해 추가 셀 식별 마커 (TRITC 인슐린, 글루카곤, 멘틴 또는 소마토스타틴 (somatostatin))에 대한 면역 형광 염색을 수행합니다. 대체 담당자lication 마커, 예, PCNA도 사용될 수있다. </li><li> 4 번씩 수행 각 처리 조건에 228 웰 치료 계획을 준비한다. (: 666 희석 DMSO 1) 웰 포지티브 (5 Iodotubercidin [1 μM] 또는 디피 리다 몰 [15 μM]) 및 차량 컨트롤을 포함합니다. </li></ol> 췌장의 2 관류 <ol><li> 희석 마취 칵테일 용액 (0.30 ㎖ / 100g 체중)의 IP 주사에 의해 래트를 마취. 쥐가 완전히 마취 및 유해 자극에 응답하지되면, 자궁 경부 전위를 수행합니다. </li><li> 종이 타월의 스택에 앙와위 (두개골 - 꼬리 방향)에서 안락사 쥐를 넣고 70 % 에탄올로 복부 영역을 스프레이. </li><li> U 자 절개 (음부에서베이스)로 복강을 열고 복강을 노출하는 가슴을 통해 주동이의 방향으로 피부를 철회. </li><li> 조심 곡선 포셉 두 쌍을 사용 십이지장 잡아 공통 B의 십이지장 항목을 찾아ILE 덕트 (오디 괄약근) 및 곡선 지혈과 유두에서 십이지장 개방 클램프. </li><li> 담관 유두 클램프 및 곡선 집게를 사용하여 간 부근 담관 잡아 사용 만곡 지혈 리프트. 분리 및 담관을 노출 곡선 집게와 무딘 절개를 사용합니다. </li><li> 헤드 근위 및 원위 다리에 쥐 위치를 조정합니다. </li><li> 췌장 소화 용액으로 낭성 일반적인 간 덕트의 교차점에 일반적인 담즙의 덕트 (CBD)하거나 말단을 Cannulate 10 ML의 주사기를 -loaded 천천히 췌장 소화 용액 10 ㎖를 주입. 주입하는 동안, 메스 핸들과 CBD를 지원합니다. 덕트 및 췌장 팽창하지 않을 경우 바늘 위치를 조정합니다. </li><li> 하행 결장, 창자, 위장과 비장에서 분리하기 위해 곡선 포셉 및 고급 가위를 사용하여 팽창 췌장을 제거합니다. 5 ㎖를 함유하는 50 ㎖ 튜브에 얼음 팽창 된 췌장을 배치 <em&gt; 췌장 소화 솔루션입니다. 참고 : 최대 섬 수율은 각 50 ㎖ 소화 관에서 30 분 장소 만 1 또는 2 pancreata 내의 모든 pancreata를 수집합니다. </li></ol> 췌장 3 해리 <ol><li> 일단 모든 pancreata는 수집 된 15 분 동안 37 ° C를 물 목욕으로 소화 튜브를 배치하고 있습니다. 부드럽게 튜브 매 3 분 소용돌이 친다. </li><li> 15 분 후, 적극적으로 튜브를 (수직) 10 회 흔들어 차가운 세척 버퍼 10 ㎖를 추가합니다. 적극적으로 튜브를 추가로 5 번 흔들어 얼음에 배치합니다. </li><li> 튜브 5 번 반전 차가운 세척 버퍼와 믹스 50ml로 소화 튜브를 입력합니다. </li><li> 1 분 동안 4 ° C에서 97 XG에 튜브를 원심 분리기 상층 액을 붓는다. 펠렛 조직을 제거하지 않도록주의하십시오. </li><li> 25 ml의 세척 버퍼를 추가하고 부드럽게 텍싱하여 조직을 다시 일시 중지합니다. 반복 두 번 더 3.4 및 3.5 단계를 반복합니다. </li><li> 보안 목표 명세서를 통해 30 메쉬 조직 체를 배치250 ml의 비이커를 erile하고 체에 조직 현탁액을 붓는다. 세척 버퍼의 추가 20 ㎖로 소화 튜브를 씻어 메시에 붓는다. 소화되지 않은 췌장과 지방 조직은이 단계에서 제거된다. </li><li> 두 신선한 50 ㎖ 튜브에 여과 재료를 붓고 4 ° C에서 1 분 97 XG에서 회전하여 조직 펠렛. 가만히 따르다 뜨는 및 반전 튜브 초과 버퍼를 배출합니다. </li></ol> 독도 4. 정제 <ol><li> 펠렛 췌장 조직 감기 polysucrose / diatrizoate 나트륨 수용액 20 ㎖ (1.119 g / mL의 농도)를 추가한다. 균일 부드럽게 피펫 팅하여 5 배 아래 각 튜브의 내용물을 다시 일시. </li><li> 조심스럽게 10 ㎖의 HBSS로 polysucrose / 나트륨 용액 diatrizoate 오버레이. 천천히 튜브 벽을 따라 HBSS를 첨가하여 날카로운 액체 계면을 유지한다. </li><li> 천천히 가속없이 브레이크와 15 분 (4 ° C)에 대한 560 XG에 소화 pancreata을 원심 분리기. </li><li> 공동신선한 50 ㎖ 튜브에서 10 ㎖ 피펫 장소 아일렛을 사용하여 인터페이스에서 섬 층 llect. 이 단계에서 독도를 풀하지 마십시오. </li><li> 4 ° C에서 140 XG에 1 분 동안 각각 50 ㎖ 튜브와 스핀에 세척 버퍼의 40 ML을 추가합니다. </li><li> 상층 액을 붓고 튜브를 여러 번 반전 세척 버퍼의 50 ㎖에서 풀링 된 섬을 다시 일시 중지합니다. 펠렛에 독도를 수집하기 위해 4 ° C에서 97 XG에서 1 분 튜브를 원심 분리기. </li><li> 세척 버퍼를 붓고 세척을 반복합니다. 조직 문화 후드에 독도를 가져오고 뜨는을 대기음. </li><li> 아일렛 배지 6 ㎖에 섬의 각 튜브를 다시 일시. </li><li> 여섯 잘 조직 배양 접시의 우물에 각 50 ML 튜브에서 독도를 전송합니다. 잘의 중앙으로 독도를 수집하고 현미경으로 섬의 품질과 순도를 관찰하기 위해 6 잘 접시를 소용돌이 친다. </li><li> 수동으로 1 ml를 피펫을 사용하여 독도를 수집하고 이웃에 집어 독도를 전송또한 섬 미디어 6 ml를 함유. 반복 섬의 소용돌이 90&gt;까지 %의 순도를 따기가 달성된다. </li><li> 아일렛 배지 20 ㎖를 포함하는 10cm 조직 배양 접시로 정제 아일렛 전송. </li><li> 조직 문화 인큐베이터에 배치 섬 (37 ° C, 5 % CO 2) 하룻밤 (그림 1A). </li><li> 섬 세포, 코트 당 잘 804G 에어컨 미디어의 40 μL와 384 웰 플레이트 도금의 준비를합니다. 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션. </li></ol> 5. 분산과 작은 섬 세포의 도금 <ol><li> 다음 날, 부드럽게 세포 스크레이퍼와 10cm 접시에서 독도를 분리하고 50 ㎖ 튜브에 독도를 전송합니다. </li><li> 실온에서 22 XG에서 1 분 동안 원심 분리에 의해 펠렛 아일렛. 뜨는을 대기음. </li><li> 따뜻한 PBS의 20 ㎖로 독도를 씻고 위와 같이 가만히 따르다. </li><li> 0.25 % 트립신의 섬 (쥐의 췌장 당 150 μl를 다시 일시 중지10 분 동안 37 ℃에서) 및 부화. 피펫 최대 섬 아래로 10 시간 배양의 5, 10 분 후 1 ml를 피펫을 사용하여. </li><li> 10 분 후, 완전 소화를 보장하고 혈구를 이용한 섬세포를 계산하기 위해 현미경 트립신 아일렛의 20 μl의 샘플을 평가한다. 5 분 피펫 위아래로 10 회 이상 - 소화되지 않은 섬이 남아있는 경우, 추가로 3 배양을 계속합니다. 필요한만큼 반복합니다. 참고 : 일반적인 수율은 ~ 125,000이다 - 쥐 당 15 만 섬 세포. </li><li> 인큐베이터에서 804G 에어컨 미디어 코팅 된 384 웰 플레이트를 제거하고 12 웰 매니 폴드 흡입기를 사용하여 용지를 제거합니다. </li><li> 아일렛 함수 매체 용액 당 45,000 세포의 밀도로 섬 세포를 중단하고 멀티 채널 피펫 (도 1b)를 웰 당 70 μL (3150 셀) 접시. 참고 : 외부 우물에있는 β 세포가 N과 열 4 판을 사용 행 C의 주변으로 마이그레이션하는 경향이 있기 때문에(21)에 6 쥐에서 고립 된 섬 세포와 228 우물을 판입니다. </li><li> 세포 부착을 허용하기 위해 48 시간 동안 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 놓는다. </li></ol> 6. 작은 섬 세포 문화 치료, 고정 및 염색 <ol><li> 작은 섬 기능 매체의 2 배 농도 (처리 조건을 4 번씩 수행) 차량 및 화합물의 200 μl를 준비합니다. 멀티 웰에 피펫 팅을 용이하게 멸균 96- 웰 플레이트에서 화합물을 배열. </li><li> 조심스럽게 12도 매니 폴드 흡입기와 섬 매체를 제거하고 12 웰 피펫을 사용하여 섬의 기능 매체 (35 μL / 웰)로 교체합니다. 제거하고 (도 1C)를 건조시키는 위험을 제한하기 위해 한 번에 하나의 행에서 미디어를 교체한다. </li><li> 35 μL / 전송 웰의 2 배 화합물 솔루션에 의해 치료를 시작합니다. 48 시간 치료 기간 동안 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다. </li><li> 처리 48 시간 후, 플레이트를 반전하여 처리 매체를 가만히 따르다. &lt;/ 리&gt; <li> 부드럽게 1X PBS (1 분)을 잘 당 50 μL와 섬 세포를 씻는다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 PBS를 추가합니다. </li><li> PBS를 경사 분리하고 1X PBS에 희석 차가운 4 % 파라 포름 알데히드의 웰 당 50 μL 첨가하여 세포를 고정한다. 4 ℃에서 15 분 동안 세포를 품어. </li><li> 재정법을 제거 판을 반전 부드럽게 이상으로 잘 당 PBS의 60 μl를 추가하여 세포를 세 번 (5 분마다)를 씻으십시오. </li><li> 포름 아미드 14.25 mL 및 0.75 ml의 0.15 M 구연산 나트륨 (산도 6)을 혼합하여 15 ml의 항원 검색 솔루션을 준비합니다. 사용하기 전에 즉시 항원 검색 솔루션을합니다. </li><li> 접시를 반전 우물에서 PBS를 제거하고 각 웰에 60 μl의 항원 검색 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 45 분 동안 70 ℃로 물을 욕조에 접시를 가열한다. 멀티 웰 플레이트의 휘어짐을 방지하기 위해이 배양 중에 플레이트의 상단에 가열 블록을 배치합니다. 참고 : 물이 반까지 잘 판 스커트해야한다; 플레이트는 침수되지 않아야한다. </li><l난&gt; 수조에서 플레이트를 제거하고 실온에서 20 분 동안 냉각 할 수 있습니다. 플레이트는 육안 검사에 의해 뒤틀린되지 않았는지 확인합니다. </li><li> 1X PBS 3 회 잘 당 60 μL (5 분 각각)로 세포를 씻으십시오. 멀티 채널 피펫 PBS를 첨가하고, 플레이트를 PBS 반전 캔트. </li><li> 블로킹 완충액 웰 당 40 ㎕를 추가하고 실온에서 30 분 동안 배양하여 멀티 채널 피펫을 사용한다. 반전 판과 경사에 의해 차단 버퍼를 제거합니다. </li><li> 염소 항 - 인간 PDX-1 (1 : 100) : 마우스 기-67 (200 1) 항 - 인간의 40 μl를 추가 각 웰에 버퍼를 차단에 희석 항체를 밤새 4 ° C에서 품어. </li><li> 그 다음날, 상기와 같이 세 번 (5 분마다)을 방지 체 용액을 디 캔트 및 1X PBS로 세포를 세척 하였다. PBS를을 가만히 따르다. </li><li> 버퍼를 차단에 : (200 일) 바이오틴 당나귀 항 - 마우스 IgG와 로다 민 - 복합 당나귀 방지 염소 IgG의 희석을 잘 당 40 μl를 추가합니다. 1 시간 동안 품어실온에서 첨가 하였다. </li><li> 1X PBS로 세 번 5 분 각각의 세포를 씻으십시오. 각 웰에 형광 접합 된 스트렙 타비 딘 (버퍼를 차단 400 1) 희석 40 μl를 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션. </li><li> 1X PBS로 세 번 5 분 각각의 세포를 씻으십시오. DAPI의 웰 (블로킹 완충액 300 ㎚) 40 μl를 첨가하고 실온에서 15 분 동안 배양한다. </li><li> 1X PBS로 두 번 세포를 씻고 PBS 1X 40 μl의 세포를 둡니다. 판은 분석 준비가 완료된다. </li></ol> 7. β - 세포 복제 분석 주 : 분석 프로토콜 β 세포 복제를 측정하기 위해 사용 된 고 함량 검사 현미경 확립되어야한다. 가장 간단한 구성에서,이 프로토콜은 식별 마커 β 세포를 정의하는데 사용되는 2 색 분석은 (PDX-1 + β- 세포) 및 복제 마커 (기-67) 세포 분열 이벤트를 정의하는 데 사용된다. <ol><li> 결과 평균에 기반하여 객체 (β 세포)를 식별β 세포 ​​핵 (도 2a)의 예상되는 화소 영역 내 (폭 &lt;1.6 길이)의 대략 원 안에 PDX-1 염색 (549 nm 인 필터)의 예를 형광 강도. </li><li> 다음으로, PDX-1 + 영역 (그림 2B) 내에서 평균 형광 강도 (485 나노 필터)에 따라 복제 이벤트 (기-67 양성)를 식별하는 설정을 설정합니다. 주 : 노출 시간에 걸쳐 이미지 픽셀 강도 비교를 허용하도록 수정되어야한다. 분석 프로토콜 파라미터는 시스템 호출 지속적 데이터 품질에 부정적인 영향을 미칠 수있는 비특이적 염색, 파편 및 세포 응집물을 배제되도록 조정된다. </li><li> 정확도 한계 다양성을 최대화하기 웰당 500 β 세포의 최소 분석. 참고 : 마우스 아일렛 배양 기저 β 세포 복제 인덱스가 0.5이 될 것으로 예상된다 - 3 %. 일반적으로,도 40의 이미지는 500 β 세포를 식별하기에 충분한 것보다 더 많은 것이다. </li><li> 를 분석하기 전에전체 플레이트, 네거티브 선택 (DMSO - 처리) 및 양성 통제를 분석 (5- iodotubercidin [1 μM] 또는 디피 리다 몰 [15 μM]를) 분석 프로토콜의 유효성을 평가하기 위해 처리 한 웰. 분석이 정확하게 설정되는 경우, 양성 대조군 화합물은 β 세포 복제의 비율에서 적어도 두 배 증가를 유도한다. </li><li> 분석 프로토콜이 확인되면 전체 판을 읽어보십시오. </li></ol>

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(64), (2012).</li><li>Walpita, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+islet+cell+culture+system+for+high-throughput+screening.">A human islet cell culture system for high-throughput screening.</a> J Biomol Screen. 17 (4), 509-518 (2012).</li><li>Miyazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+pancreatic+beta+cell+line+that+retains+glucose-inducible+insulin+secretion:+special+reference+to+expression+of+glucose+transporter+isoforms.">Establishment of a pancreatic beta cell line that retains glucose-inducible insulin secretion: special reference to expression of glucose transporter isoforms.</a> Endocrinology. 127 (1), 126-132 (1990).</li><li>Song, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+and+inactivation+of+glycogen+synthase+kinase+3beta+(GSK3beta)+by+dual-specificity+tyrosine+phosphorylation-regulated+kinase+1A+(Dyrk1A).">Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta) by dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A (Dyrk1A).</a> J Biol Chem. 290 (4), 2321-2333 (2015).</li><li>Hohmeier, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+INS-1-derived+cell+lines+with+robust+ATP-sensitive+K++channel-dependent+and+-independent+glucose-stimulated+insulin+secretion.">Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion.</a> Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).</li><li>Cozar-Castellano, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+the+first+comprehensive+molecular+characterization+of+cell+cycle+control+in+rodent+insulinoma+cell+lines.">Lessons from the first comprehensive molecular characterization of cell cycle control in rodent insulinoma cell lines.</a> Diabetes. 57 (11), 3056-3068 (2008).</li><li>Efrat, S., Fusco-DeMane, D., Lemberg, H., aL Emran, O., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+transformation+of+a+pancreatic+beta-cell+line+derived+from+transgenic+mice+expressing+a+tetracycline-regulated+oncogene.">Conditional transformation of a pancreatic beta-cell line derived from transgenic mice expressing a tetracycline-regulated oncogene.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3576-3580 (1995).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small-molecule+inducers+of+pancreatic+beta-cell+expansion.">Identification of small-molecule inducers of pancreatic beta-cell expansion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (5), 1427-1432 (2009).</li><li>Annes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+kinase+inhibition+selectively+promotes+rodent+and+porcine+islet+beta-cell+replication.">Adenosine kinase inhibition selectively promotes rodent and porcine islet beta-cell replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3915-3920 (2012).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+cAMP-modulating+medications+to+promote+beta-cell+replication.">Repurposing cAMP-modulating medications to promote beta-cell replication.</a> Mol Endocrinol. 28 (10), 1682-1697 (2014).</li><li>Chen, C. A., Carolan, P. J., Annes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+screening+for+secreted+proteins+that+modulate+glucose+handling+identifies+interleukin-6+family+members+as+potent+hypoglycemic+agents.">In vivo screening for secreted proteins that modulate glucose handling identifies interleukin-6 family members as potent hypoglycemic agents.</a> PLoS One. 7 (9), e44600 (2012).</li><li>Izumi, K., Hirao, Y., Hopp, L., Oyasu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+induction+of+ornithine+decarboxylase+in+urinary+bladder+carcinoma+cells.">In vitro induction of ornithine decarboxylase in urinary bladder carcinoma cells.</a> Cancer Res. 41 (2), 405-409 (1981).</li><li>Serup, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeodomain+protein+IPF-1/STF-1+is+expressed+in+a+subset+of+islet+cells+and+promotes+rat+insulin+1+gene+expression+dependent+on+an+intact+E1+helix-loop-helix+factor+binding+site.">The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site.</a> Biochem J. 310, 997-1003 (1995).</li><li>Szabat, M., Luciani, D. S., Piret, J. M., Johnson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+adult+beta-cells+revealed+using+a+Pdx1/insulin+dual-reporter+lentivirus.">Maturation of adult beta-cells revealed using a Pdx1/insulin dual-reporter lentivirus.</a> Endocrinology. 150 (4), 1627-1635 (2009).</li><li>Rieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+hepatocyte+nuclear+factor-4alpha+initiates+cell+cycle+entry,+but+is+not+sufficient+to+promote+beta-cell+expansion+in+human+islets.">Overexpression of hepatocyte nuclear factor-4alpha initiates cell cycle entry, but is not sufficient to promote beta-cell expansion in human islets.</a> Mol Endocrinol. 26 (9), 1590-1602 (2012).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus--advances+and+challenges+in+human+beta-cell+proliferation.">Diabetes mellitus--advances and challenges in human beta-cell proliferation.</a> Nat Rev Endocrinol. 11 (4), 201-212 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

β 세포의 성장과 재생을 제어하는​​ 분자 경로를 연구하기위한 실험 방법은 당뇨병 연구를위한 중요한 도구입니다. 여기서, 쥐 작은 섬 기반 스크리닝 플랫폼을 제시 β 세포 복제의 작은 분자 자극을 식별하고 특성화합니다. 이 프로토콜의 대부분의 측면 쉽게 경험이 풍부한 연구자들에 의해 수행되는 동안, 몇 가지 단계가 특정 기술을 필요로한다. 첫째, 섬 격리하는 동?...

당뇨병은 포도당 항상성 교란의 공통 종점 공유 질환의 컬렉션을 포함한다. 당뇨병 아형의 병원성 메카니즘은 구별이기는하지만 감소 β 세포 질량, 즉 인슐린 생산 능력 1,2- 손실의 결과를 공유한다. 현재 당뇨병 치료 전략은 외인성 인슐린, 인슐린 생산, 인슐린 감수성 증강 약물 자극 만성 투여에 의존하고, 거의, 췌장 또는 전부를 3,4- 췌장 이식. 유감스럽게도, 이러한 전략의 성공은 짧은 수명 및 / 또는 충분히 내인성 인슐린 생산 기능을 요점을 되풀이하는 데 실패합니다. β 세포의 재생을 촉진하는 방법을 개발의 유용성에도 불구하고, 이러한 접근 방식은 존재하지 않는다. 따라서, 당뇨병의 주요 연구의 목표는 새로운 β 세포를 생성하거나 내인성 β 세포 5 질량 확장 방법을 개발하는 것이다 </sup&gt;. 이러한 배아 줄기 세포와 같은 재생 에너지 원 β - 세포 재생이 진행되고 있지만, 안전과 효율 우려가 성숙 β 세포의 확장, 우선 순위 6,7를 포함하여 다른 전략을 추구합니다. 중요한 생체 내에서 새로운 β 세포의 주된 소스는 기존의 β 세포보다는 특수 전구 세포 8,9이다. β 세포가 제한된 복제 능력 β 세포 질량의 작은 증가를 갖는 것처럼 보이지만 (~ 30 %)이 많은 당뇨 환자의 혈당 항상성을 복원하기에 충분할 수있다. 또한, β 세포 질량의 동일계 약물 자극 잠재적 인 저렴하고 확장 치료 전략이다. 여기서 β 세포의 성장을 자극하는 작은 분자를 확인하고 특성화하기위한 고급 컨텐츠 스크리닝 방법이 제공된다. 시험 관내 실험 방법의 다양한 유전자 생성물 및 / 또는 분자 그쪽을 식별하기 위해 사용될 수있다t 차 β 세포 복제를 추진하고 있습니다. β 세포 ​​복제 유도를 측정하기위한 초기의 노력은, 특정 처리 조건 (10)에 응답하여 알데히드 - 티오 닌 또는 인슐린 염색 모집단 내에서 [3 H] 티미 딘 혼입 BrdU의 혼입 또는 유사 분열 체를 측정하는 태아 설치류 pancreata 배양 또는 그대로 고립 섬 배양 물을 사용하여 11. 이 체외 접근법과 유사 검색어는 그 몇 가지 제한이 있습니다. 눈에 띄는 결함 성숙한 β 세포와 달리, 높은 기저 β 세포 복제 속도를 표시하고 명료하게 12 규제 증가하고, 태아 세포 (1)의 사용을 포함한다; (2) β 세포 복제 이벤트의 실험자에 의존 판결의 주관적 성격 (3) β 세포 복제 이벤트의 실험자에 의존하는 계산의 노동과 시간 집약적 인 특성은 실험 처리량을 지연시킨다; 핵 혼입 / 얼룩 / 외관 (4)를 사용하더라도 복제 식별TS 및 β 세포를 식별하기 위해 비 중복 세포질 염색-β 세포에 근접한 비 β 세포 복제 사건 misattribution 리드. 보다 최근 성숙한 차 β 세포가 β 세포 복제 13-16의 과발현 유전자의 영향뿐만 아니라 유전자 생성물 또는 화합물을 치료를 평가하기 위해 사용되었다. 그러나, 이들 연구는 또한 복제 이벤트, β 세포의 식별 및 / 또는 처리량을 제한하는 노동 집약적 인 단계, 예를 들어, 세포 또는 본래 췌장의 개별 슬라이드 웰 도금 세포질 staining- 또는 비특이적 방법 주관적 계수에 의존 파라핀 매립 및 처리 17. 특히, 본 명세서에서 비슷한 이미지 기반 인간의 β 세포 복제 심사 방법론은, 18 게시 된; FEA 그러나 이러한 분석의 성공적인 사용은 입증되지 않은 일차 스크리닝 인간의 아일렛의 사용은 광범위하지 않을sible. 복제 - 증진 물질을 식별하기위한 다른 전략은 β 세포주의 성장 유도를 평가하는 것이다. 초기 노력은 형질 전환 된 β 세포 라인을 같은 MIN6 세포 또는 INS 13분의 832 세포 14,19-21을 사용했다. 그러나, 이러한 세포 라인은 무제한 성장을 보여 주 잘 차별화 된 β 세포 (22)에 약간의 유사성. 따라서, 성장 유도 용량은 최소 불분명 관련성 및 요점을 되풀이하는 것이 때로는 곤란하다. 세포주 기반 스크리닝 개선 전략은 테트라 사이클린 (독시사이클린)의 부재하에 성장 체포 의존적 SV40 T 항원의 발현 23,24있는 세포 &quot;가역적으로 변환&quot;이용한다. 그러나, 이러한 세포가 독시 싸이클린 제거시 &quot;일반적인&quot;β 세포와 같은 상태로 되돌아 여부를 명확하지 않다. 불행하게도,이 세포의 사용은 즉시 유틸리티가 표시되지 않는 일반화 된 성장 촉진 화합물을 수득했다24. 전반적으로, 최소한의 자발적인 복제 작업을 표시하는 세포 유형의 성장 조절을 연구 세포 라인의 사용은 제한된 적용 가능성을 가질 수도있다. 여기에 제시된 β 세포 복제 심사 플랫폼은 가능한 한, 혈통 제한 성장 촉진 활동의 식별을 가능하게 혼합 세포 형 조성물의 섬 - 세포 배양, 멀티에게 생체 내 성장 조절에 유지하는 성숙한 기본 쥐의 β 세포를 활용 - 음 처리량 및 자동 분석을 최대화하기 위해 포맷하면 바이어스를 제거하고 처리량을 용이. 이 플랫폼의 성공적인 사용은 β 세포 복제 25, 26을 촉진 몇 가지 화합물을 식별 할 수있게되었습니다. 또한, 분석은 β 세포 복제 분자 조절 기전에 대한 통찰력을 제공하는 구조 - 활성 관계 연구 및 화학 상위 성 실험을 위해 사용되었다. 제시된 플랫폼이 성공적으로 fo를 적응했다β 세포 ​​복제 연구 렌티 바이러스의 RNAi 기반 조사 (25) 경로. 분석의 한계 (일차 전지의 사용) 확장 성을 제한 포함, 오히려 항체 기반 이미징 및 주요 섬의 사용, 사용과 관련된 (분석 인간 섬의 연구에 적용 할 수 있지만) 인간의 섬 세포, 비용보다 설치류의 사용 이미지 획득 및 분석 기능을 가진 자동 현미경의 가용성에 따라 자동화 된 이미지 획득 및 의존성을 용이하게 분산 된 섬 (파쇄 섬 구조)의. 유전자 제품이나 현장에서의 β 세포 재생을 자극하는 화합물을 식별하기위한 손쉬운 생체 검사 방법이 이상적 일 것이다하지만, 이러한 플랫폼은 아직 27 사용할 수 없습니다. 따라서, 설명 된 플랫폼은 β 세포 복제의 대부분의 측면을 조사 연구에 관심이 적합하다.

<table><tbody><tr><td>250 g male Male Sprague Dawly Rat</td><td>Charles River</td><td>Stain # 400</td><td></td></tr><tr><td>12 cm teeth tisuue forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11021-12</td><td></td></tr><tr><td>11.5 cm fine scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>14.5 cm surgical scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-14</td><td></td></tr><tr><td>16 cm curved forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-16</td><td></td></tr><tr><td>12 cm curved hepostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13011-12</td><td></td></tr><tr><td>12 cm scalpel handle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Tissue sieve-30 mesh</td><td>Bellco Glass</td><td>1985-85000</td><td></td></tr><tr><td>Cizyme RI, 375,000 CDA units</td><td>VitaCyte</td><td>005-1030</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt solution (Ca&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;)</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine HCl (200 mg/20 ml)</td><td>JHP Pharmaceuticals</td><td>NDC# 42023-113-10</td><td>to make anesthetic cocktail&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Xylazine (5 g/50 ml)</td><td>LLOYD</td><td>NADA# 139-236</td><td>to make anesthetic cocktail&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>H-1077</td><td>to make histopaque 1100</td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>H-1119</td><td>to make histopaque 1100</td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum 500 ml</td><td>Hyclone</td><td>SH30118.03</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30268.01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium/Low Glucose&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>Functionality/Viability Solution&amp;nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>99-768-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 media&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td>to make conditioned medium</td></tr><tr><td>804G rat bladder carcinoma cell-line</td><td>Available upon request</td><td></td><td>to make conditioned medium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td><td>Gibco</td><td>26160</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml)&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670049</td><td></td></tr><tr><td>Formamide 500 ml</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP227-500</td><td></td></tr><tr><td>Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3300</td><td>to make 0.15 M Sodium Sitrate solution</td></tr><tr><td>Dextrose, Anhydrous</td><td>EMD Chemicals</td><td>DX0145-1</td><td>to make 1 M glucose solution</td></tr><tr><td>Nomal Donkey Serum (Powder)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-human Ki67 antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>556003</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-human PDX-1 antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF2419</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody</td><td>Dako</td><td>2016-08</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody</td><td>Dako</td><td>2014-06</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody</td><td>Dako</td><td>2011-08</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal chicken anti-vimentin antibody</td><td>abcam</td><td>ab24525</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-065-150</td><td></td></tr><tr><td>StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S32354</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-025-147</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-025-148</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-025-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-175-147</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-175-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-175-155</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Millipore</td><td>S7113</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Reagent Reservoir 25 ml</td><td>Sorenson BioScience</td><td>39900</td><td></td></tr><tr><td>384 well, black/clear, tissue culture treated plate</td><td>BD Falcon</td><td>353962</td><td></td></tr><tr><td>96 well, black/clear, tissue culture treated plate</td><td>Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Multi-channel pipettor</td><td>Costar</td><td>4880</td><td></td></tr><tr><td>12-channel vaccume aspirator</td><td>Drummond</td><td>3-000-096</td><td></td></tr><tr><td>Cell Scraper</td><td>Falcon</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Water Bath Model 2223&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>High-content screening instrument: ArrayScan VTI</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a high-content in vitro pancreatic islet &#946;-cell replication discovery platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

β-α 세포 또는 세포 복제를 평가하기 위해, 4 색 분석 프로토콜이 요구된다. 첫째, 객체는 DAPI 염색 (채널 1, 386 ㎚)로 식별됩니다. 다음으로, β 세포 (이벤트 1) 계산됩니다 : 개체 PDX-1 + (채널 2, 650 ㎚) 및 근교 핵 인슐린 (채널 3, 549 nm의) 협력을-표현한다. 그 후, 복제 β 세포 (이벤트 2) 계산됩니다 : (이벤트 1)이 공동 명시 기-67 (채널 4, 485 ㎚) (그림 3) 세?...

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A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

당뇨병 연구 분야에 중요한 도전은 섬 β 세포 복제를 조절하고 β - 세포 재생을 자극하는 방법을 개발하는 분자 메커니즘을 이해한다. 여기서 높은 콘텐츠 스크리닝 방법 식별 및 작은 분자의 β 세포의 복제를 촉진 활성을 평가하기 제시된다.

높은 콘텐츠<em&gt; 체외</em&gt; 췌장 작은 섬의 β 세포 복제 디스커버리 플랫폼

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

a-high-content-vitro-pancreatic-islet-cell-replication-discovery

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

11.1K 조회수.  Stanford University School of Medicine.  당뇨병 연구 분야에 중요한 도전은 섬 β 세포 복제를 조절하고 β - 세포 재생을 자극하는 방법을 개발하는 분자 메커니즘을 이해한다. 여기서 높은 콘텐츠 스크리닝 방법 식별 및 작은 분자의 β 세포의 복제를 촉진 활성을 평가하기 제시된다. 

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In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

체외 식민지 분석 실험에서 트라이 강력한 전구 세포를 특성화를위한 성인 쥐 췌장에서 분리

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

연구

발생학

Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets

Glucose homeostasis is primarily controlled by the endocrine hormones insulin and glucagon, secreted from the pancreatic beta and alpha cells, respectively. Functional beta cell mass is determined by the anatomical beta cell mass as well as the ability of the beta cells to respond to a nutrient load. A loss of functional beta cell mass is central to both major forms of diabetes 1-3. Whereas the declining functional beta cell mass results from an autoimmune attack in type 1 diabetes, in type 2 diabetes, this decrement develops from both an inability of beta cells to secrete insulin appropriately and the destruction of beta cells from a cadre of mechanisms. Thus, efforts to restore functional beta cell mass are paramount to the better treatment of and potential cures for diabetes.
Efforts are underway to identify molecular pathways that can be exploited to stimulate the replication and enhance the function of beta cells. Ideally, therapeutic targets would improve both beta cell growth and function. Perhaps more important though is to identify whether a strategy that stimulates beta cell growth comes at the cost of impairing beta cell function (such as with some oncogenes) and vice versa.
By systematically suppressing or overexpressing the expression of target genes in isolated rat islets, one can identify potential therapeutic targets for increasing functional beta cell mass 4-6. Adenoviral vectors can be employed to efficiently overexpress or knockdown proteins in isolated rat islets 4,7-15. Here, we present a method to manipulate gene expression utilizing adenoviral transduction and assess islet replication and beta cell function in isolated rat islets (Figure 1). This method has been used previously to identify novel targets that modulate beta cell replication or function 5,6,8,9,16,17.

This protocol allows one to identify factors that modulate functional beta cell mass to find potential therapeutic targets for the treatment of diabetes. The protocol consists of a streamlined method to assess islet replication and beta cell function in isolated rat islets following manipulation of gene expression with adenoviruses.

에서 복제와 베타 세포 기능을 평가 Adenovirally-transduced 절연 쥐 Islets

Glucose homeostasis is primarily controlled by the endocrine hormones insulin and glucagon, secreted from the pancreatic beta and alpha cells, ...

의학

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within pancreatic islets and act in a coordinated fashion to maintain glucose homeostasis. It is becoming increasingly clear that interactions between transmembrane proteins on the surfaces of adjacent beta cells are important determinants of beta-cell function.
Elucidation of the roles of particular transcellular interactions by knockdown, knockout or overexpression studies in cultured beta cells or in vivo necessitates direct perturbation of mRNA and protein expression, potentially affecting beta-cell health and/or function in ways that could confound analyses of the effects of specific interactions. These approaches also alter levels of the intracellular domains of the targeted proteins and may prevent effects due to interactions between proteins within the same cell membrane to be distinguished from the effects of transcellular interactions.
Here a method for determining the effect of specific transcellular interactions on the insulin secreting capacity and responsiveness of beta cells is presented. This method is applicable to beta-cell lines, such as INS-1 cells, and to dissociated primary beta cells. It is based on coculture models developed by neurobiologists, who found that exposure of cultured neurons to specific neuronal proteins expressed on HEK293 (or COS) cell layers identified proteins important for driving synapse formation. Given the parallels between the secretory machinery of neuronal synapses and of beta cells, we reasoned that beta-cell functional maturation might be driven by similar transcellular interactions. We developed a system where beta cells are cultured on a layer of HEK293 cells expressing a protein of interest. In this model, the beta-cell cytoplasm is untouched while extracellular protein-protein interactions are manipulated. Although we focus here primarily on studies of glucose-stimulated insulin secretion, other processes can be analyzed; for example, changes in gene expression as determined by immunoblotting or qPCR.

Transcellular protein interactions are important determinants of pancreatic beta-cell function. Detailed here is a method&#x2014;adapted from a coculture model of synaptogenesis&#x2014;for investigating how specific transmembrane proteins influence insulin secretion. Transfected HEK293 cells express proteins of interest; beta cells do not need to be transfected or otherwise directly perturbed.

췌장의 베타 세포가 인슐린 분비에 영향을 미치는 세포 외 단백질 상호 작용의 배양 분석

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

마우스 췌 장 내 분 비 세포의 단일 셀 Transcriptomic 분석

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

본래 마우스 독도에 β 세포 분열 촉진 물질의 지속적인 관리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 생분해 성 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) 마이크로 스피어를 사용하여

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

생체공학

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to diabetes. hPSC-derived insulin-secreting cells can be generated for cell therapy and disease modeling,&#160;however,&#160;with limited efficiency and functional properties. hPSC-derived pancreatic progenitors that are precursors to beta cells and other endocrine cells, when co-express the two transcription factors PDX1 and NKX6.1, specify the progenitors to functional, insulin-secreting beta cells both in vitro and in vivo. hPSC-derived pancreatic progenitors are currently used for cell therapy in type 1 diabetes patients as part of clinical trials. However, current procedures do not generate a high proportion of NKX6.1 and pancreatic progenitors, leading to co-generation of non-functional endocrine cells and few glucose-responsive, insulin-secreting cells. This work thus developed an enhanced protocol for generating hPSC-derived pancreatic progenitors that maximize the co-expression of PDX1 and NKX6.1 in a 2D monolayer. The factors such as cell density, availability of fresh matrix, and dissociation of hPSC-derived endodermal cells are modulated that augmented PDX1 and NKX6.1 levels in the generated pancreatic progenitors and minimized commitment to alternate hepatic lineage. The study highlights that manipulating the cell&#39;s physical environment during in vitro differentiation can impact lineage specification and gene expression. Therefore, the current optimized protocol facilitates the scalable generation of PDX1 and NKX6.1 co-expressing progenitors for cell therapy and disease modeling.

The present protocol describes an enhanced method to increase the co-expression of PDX1 and NKX6.1 transcription factors in pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) in planar monolayers. This is achieved by replenishing the fresh matrix, manipulating cell density, and dissociating the endodermal cells.

2D 배양 시스템에서 인간 만능줄기세포를 췌장 베타세포 전구체로 분화

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to ...

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and diabetes treatment. However, challenges remain in obtaining stem cell-derived beta cells that adequately mimic native human beta cells. Building upon previous studies, hPSC-derived islet cells have been generated to create a protocol with improved differentiation outcomes and consistency. The protocol described here utilizes a pancreatic progenitor kit during Stages 1-4, followed by a protocol modified from a paper previously published in 2014 (termed "R-protocol" hereafter) during Stages 5-7. Detailed procedures for using the pancreatic progenitor kit and 400 &#181;m diameter microwell plates to generate pancreatic progenitor clusters, R-protocol for endocrine differentiation in a 96-well static suspension format, and in vitro characterization and functional evaluation of hPSC-derived islets, are included. The complete protocol takes 1 week for initial hPSC expansion followed by ~5 weeks to obtain insulin-producing hPSC islets. Personnel with basic stem cell culture techniques and training in biological assays can reproduce this protocol.

The differentiation of stem cells into islet cells provides an alternative solution to conventional diabetes treatment and disease modeling. We describe a detailed stem cell culture protocol that combines a commercial differentiation kit with a previously validated method to aid in producing insulin-secreting, stem cell-derived islets in a dish.

인간 만능 줄기세포를 인슐린 생산 섬 클러스터로 분화(Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-producing Islet Clusters)

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

생물학

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a mixed cell population in a structured architecture that impacts function, and human islets are widely variable in cell type composition. Current frequently used methods to study cultured islets include molecular studies performed on whole islets, lumping disparate islet cell types together, or microscopy or molecular studies on dispersed islet cells, disrupting islet architecture. For in vivo islet studies, paraffin-embedded pancreas sectioning is a powerful technique to assess cell-specific outcomes in the native pancreatic environment. Studying post-culture islets by paraffin sectioning would offer several advantages: detection of multiple outcomes on the same islets (potentially even the exact-same islets, using serial sections), cell-type-specific measurements, and maintaining native islet cell-cell and cell-substratum interactions both during experimental exposure and for analysis. However, existing techniques for embedding isolated islets post-culture are inefficient, time consuming, prone to loss of material, and generally produce sections with inadequate islet numbers to be useful for quantifying outcomes. Clinical pathology laboratory cell block preparation facilities are inaccessible and impractical for basic research laboratories. We have developed an improved, simplified bench-top method that generates sections with robust yield and distribution of islets. Fixed islets are resuspended in warm histological agarose gel and pipetted into a flat disc on a standard glass slide, such that the islets are distributed in a plane. After standard dehydration and embedding, multiple (10+) 4 - 5 &#181;m sections can be cut from the same islet block. Using this method, histological&#160;and immunofluorescent analyses can be performed on mouse, rat, and human islets. This is an effective, inexpensive, time-saving approach to assess cell-type-specific, intact-architecture outcomes from cultured islets.

Ex vivo pancreatic islet studies are important for diabetes research. Existing techniques to study cultured islets in their native 3-dimensional architecture are time consuming, inefficient, and infrequently used. This work describes a new, simple, and efficient method for generating high-quality paraffin sections of whole cultured islets.

췌 장 섬 파라핀 섹션에 대 한 포함

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Intracellular Signaling Events and Hormone Secretion in Human Pseudoislets(인간 가성섬에서 세포내 신호전달 사건과 호르몬 분비)

Human Pseudoislet System for Synchronous Assessment of Fluorescent Biosensor Dynamics and Hormone Secretory Profiles

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, have a central role in the control of glucose homeostasis through the secretion of insulin by beta cells, which lowers blood glucose, and glucagon by alpha cells, which raises blood glucose. Intracellular signaling pathways, including those mediated by cAMP, are key for regulated alpha and beta cell hormone secretion. The 3D islet structure, while essential for coordinated islet function, presents experimental challenges for mechanistic studies of the intracellular signaling pathways in primary human islet cells. To overcome these challenges and limitations, this protocol describes an integrated live-cell imaging and microfluidic platform using primary human pseudoislets generated from donors without diabetes that resemble native islets in their morphology, composition, and function. These pseudoislets are size-controlled through the dispersion and reaggregation process of primary human islet cells. In the dispersed state, islet cell gene expression can be manipulated; for example, biosensors such as the genetically encoded cAMP biosensor, cADDis, can be introduced. Once formed, pseudoislets expressing a genetically encoded biosensor, in combination with confocal microscopy and a microperifusion platform, allow for the synchronous assessment of fluorescent biosensor dynamics and alpha and beta cell hormone secretory profiles to provide more insight into cellular processes and function.

저자 스포트라이트: Investigating Islet Abnormalities and Function with a Pseudoislet Protocol (유사섬 프로토콜로 섬 이상 및 기능 조사) 

This protocol describes a method for the synchronous acquisition and co-registration of intracellular signaling events and the secretion of insulin and glucagon by primary human pseudoislets using the adenoviral delivery of a cyclic adenosine monophosphate (cAMP) biosensor, a cAMP difference detector in situ (cADDis), and a microperifusion system.

형광 바이오센서 역학 및 호르몬 분비 프로파일의 동기 평가를 위한 인간 유사섬 시스템

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, ...

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