The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.

모든 절차가 승인 밴더빌트 기관 동물 관리 및 사용위원회에 따라 수행 하였다. 형광 1. 레이블 COI (선택 사항) <ol><li> 미세화물을 시각화와 같은 숙신 이미 딜 에스테르 또는 플루오 레세 인 유도체 (단백질에서 예) 자유 급 아민과 반응하여 형광 염료를 선택. 디메틸 술폭 시드 200 ㎕의 (DMSO)에 형광 물질 (COI의 몰에 대해) 8 배 몰 과량을 녹인다. </li><li> 재현 탁 차량 용액 800 μL의 최종 부피 (62.5 NG / μL의 최종 농도)까지 COI 50mg을. 차량 용액 COI의 소스에 따라 달라진다. 참고 : 일반 차량 솔루션은 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 또는 DMSO를 포함한다. </li><li> 단계 1.1에서 형광 / DMSO 용액을 모두 추가하고 COI를 재현 탁. 소용돌이 밤새 4 ° C에서. 대안 적으로, 반응 혼합물에 실온에서 와동4 시간 동안 (RT). </li><li> 라벨 반응에 따라, 탈염 컬럼을 사용하여 여분의 형광을 제거합니다. <ol><li> 탈염 칼럼으로부터 축적 버퍼 드레인 증류수 16 ㎖로 헹군다. 를 통해 모든 흐름을 폐기하십시오. </li><li> 탈염 컬럼에 형광 표지 된 COI를 추가합니다. 탈 이온수 120 ㎖로 용출하고 통한 흐름을 수집한다. </li><li> 용출 단계를 반복하여 추가로 네 번마다 탈 이온수 1.2 ㎖에 첨가하고, 별도의 샘플 등을 통해 유동을 수집. </li><li> -80 ° C에서 샘플을 통해 수집 된 모든 흐름을 정지하고 24 시간 동안 제조업체의 지침에 따라 동결 건조. </li></ol></li></ol> 2. 물 -에 - 중유 에멀젼 용매 증발 방법을 통해 마이크로 스피어 준비 COI로드 <ol><li> 제 수상 (W1)을 형성 증류수 100 ㎕의 1 mg의 형광 표지 COI 추가. </li><li> 폴리 65 mg을 용해 (락트산 - 코 - 글리콜 ACI라) (50 : 50 락 티드 : 글리콜, 분자량 54,000 - 미세 원심 관에 디클로로 메탄 750 μL에서 69,000). 10 초음파 처리 - (160 W에서) 30 초 완전히 PLGA를 용해한다. 이 유상 (O)를 형성한다. </li><li> 드롭 현명한 방식으로 O 단계로 단계 2.1에서 생성 된 W1 단계의 모든를 추가합니다. W1 / O 상을 형성하기 위해 30 초 동안 20,000 rpm에서 휴대용 균질기를 사용하여 유화시킨다. </li><li> 30 초 동안 20,000 rpm에서 1 %의 15 ㎖ (중량 / 부피) 수성 폴리 (비닐 알콜) (PVA) 용액에 적가 방식으로 W1 / O상의 모든 추가 휴대용 균질화기를 사용하여 유화 . </li><li> 용매를 제거하고, 수성 상을 생성하기 위해 1 시간 동안 회전 증발기를 사용하여 635 mmHg의 진공을 200 ml의 둥근 바닥 플라스크 피사체 단계 2.4에서 생성 된 에멀젼의 모든 전송. </li><li> 수성 단계의 나누어지는 1 ml의 단계 2.5 열네에의 microcentrifuge 튜브에서 발생. 7500에서 마이크로 원심 튜브의 수용액을 원심8 분 XG. 주 :이 단계에서, 미소 나머지 수용액에 존재하고 microcentrifuge 관의 바닥에 집중된다. </li><li> microcentrifuge 관의 바닥에 미소를 방해하지 않도록 조심스럽게, 마이크로 피펫으로의 microcentrifuge 튜브에서 피펫을 수용액 900 μl를 제거합니다. <ol><li> 각 microcentrifuge 관에 물을 탈 1ml를 추가하여 초과 PVA의 미소를 씻으십시오. microcentrifuge 관의 바닥에 미소를 방해하지 않도록 8 분 동안 7,500 XG에 원심 분리기, 다시 조심스럽게, 마이크로 피펫으로의 microcentrifuge 튜브에서 피펫을 수용액 900 μl를 제거합니다. 참고 : 나머지 100 ㎕의 수용액이 생성 된 마이크로 스피어가 포함되어 있습니다. </li></ol></li><li> -80 ° C에서 270 단계에서 생성 된 미세 수성 용액을 동결. </li><li> 에 따른 동결 건조기를 사용하여 동결 건조 된 마이크로 스피어의 제조-20 ° C에서 지침 및 저장. 주 : 완전히 PLGA 미립자를 용해시키고 유리 단백질 (7)의 표준 곡선의 단백질 농도를 상대적으로 판단하여 COI의 적재 효율을 측정한다. </li><li> 네거티브 대조군으로서, (이하 제어 미립자라고도 함) &quot;빈&quot;미소의 배치를 생성한다. 주 : 제어 미립자의 생성 단계 1.2 비히클 용액 800 μL없이 COI 첨가 친수성 COI로드 미립자의 생성과 동일하다. β 세포 미토 겐 분석을위한 COI 로딩 된 PLGA 미립자에 PLGA의 질량 농도 대전 조정 입자. </li></ol> 작은 섬 문화 미디어와 사전 분석 미디어 3. 준비 <ol><li> 본래 마우스 아일렛의 배양에 200㎖의 용지를 준비 : RPMI 11 mM의 글루코오스, 10 % 말 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린 G, 100 μg의 보충 1640 미디어 것은 ml의 스트렙토 마이신 (이하이다라고 /) 문화 미디어를 할 수 있습니다. 주 1 : 소 태아 혈청 (FBS)과 달리, 말 혈청 태반 락토 겐, 증식 분석에서 분석을 교란 β 세포 증식의 유도 없다. 주 2 : PLGA 미립자가 사용 전에 멸균되어 있지 않으므로, 배양액을 항생제 첨가가 미생물 오염을 방지하기 위해 중요하다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브의 전자 피펫과 장소와 섬 문화 매체의 25ml를 제거합니다. 예비 분석 미디어를 생성하기 위해 0.2 mM의 EGTA의 최종 농도로 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 섬 배양 배지의 25 ㎖를 보완. 주 : EGTA의 추가는 약간 섬 아키텍처를 변경하지 않고 섬에서 세포 - 세포 연락처를 풀어. 이 섬의 내부 세포에 도달 할 수 COI을 보장하고 중앙 섬의 괴사를 방지하는 데 도움이됩니다. </li></ol> 본래 마우스 독도 4. 배양 <ol><li> 미리 선택된 균주, 성별, AG에 그대로 섬 격리췌장의 8,9의 일상 콜라게나 소화 다음 마우스의 전자 및 유전자형. 풀 함께 샘플 등으로부터 섬. </li><li> 분취 아일렛 배양액 200 μL의 96 웰 조직 배양 플레이트의 한 웰에 40 아일렛. 물론 당 시각적으로 크기 일치 섬 (샘플 사이의 섬 상당 (IEQ)의 정확한 평가는 필요하지 않습니다). 증발 버퍼를 제공하는 200 ㎕의 멸균 수와 섬에 우물 바로 옆에 빈 우물을 입력합니다. 배양은 95 % 공기 및 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 하룻밤 미디어 아일렛. </li></ol> COI로드 및 제어 PLGA 미소 구의 제 다시 현탁 <ol><li> 밤새 섬 복구 후 동결 건조 COI 로딩 된 PLGA 미립자의 하나의 분취 량을 사전에 분석 배지를 첨가하여 재현 탁 미립자 등의 microcentrifuge 튜브 COI의 최종 농도가 10 ng의 / μL (주어진 양 COI 존재 량이라고 생성 된 마이크로pheres 단계 2.9)에서 산출 된 것입니다. 4 ℃에서 10 초의 긴 펄스를 W (160)에서 10 분 동안 빙수 욕에서 재현 탁 COI로드 미세 초음파 처리. </li><li> 동결 건조 제어 PLGA 미립자의 동일한 질량을 사전에 분석 배지의 동일한 양을 첨가함으로써 재현 탁 제어 PLGA 미립자. 4 ℃에서 10 초의 긴 펄스를 W (160)에서 10 분 동안 빙수 욕에서 재 부유 제어 PLGA 미립자 초음파 처리. </li><li> 시각 미소가 두 커버 글라스 사이에 재현 탁 미소의 2 μl를 피펫 팅에 의해 분산 확인합니다. 표면 형광 또는 시야 현미경에 40X 목표를 사용하여 미소를 시각화합니다. </li><li> 미소 구체의 현저한 응집이 여전히 보이면 4 ° C에서 10 초의 긴 펄스 및 재 부유 미립자의 반복 시각화 W (160)에서 추가로 10 분 동안 빙수 조에서 초음파 처리. </li></ol> COI로드 또는 제어 PLGA 마이크로 스피어와 독도 6. 치료 &lt;/ P&gt; <ol><li> 각 웰은 COI로드 미세 처리 될 때까지 100 ㎕의 최종 부피 및 소정의 최종 농도 미리 분석 미디어 재현 탁 COI 미소 구의 10 NG / μL 희석 분석 매체를 준비한다. 참고 : 단백질의 최적의 최종 농도는이 분석에 사용되는 각각의 COI에 따라 다를 것입니다. 이상적으로는, 최종 농도 범위는 시험된다. </li><li> 웰 각각은 대조군으로 사용되기 위해서는, 단계 6.1에서 COI로드 미립자를 희석하기 위해 사용한 것과 동일한 희석 부피 단계 5.2에서 생성 된 재 부유 제어 PLGA 미립자를 희석하여 제어 분석 매체를 준비한다. 참고 : 제어 분석 매체로 처리 독도는 빈 미소가 실험 결과에 미칠 수있는 영향의 탐지를 가능하게하는 음성 대조군 될 것입니다. </li><li> 조심스럽게에는 독도가 우물에서 빠질 수없는되도록 마이크로 피펫으로 각 우물에서 섬 배양 배지 100 μl를 제거합니다. 조심스럽게 100 μ를 추가분석 매체 또는 각 웰에 제어 분석 배지 100 ㎕의 L. </li><li> 사흘 동안 95 % 공기 및 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 인큐베이션을 섬. </li></ol> 7. 현미경 슬라이드 상에 본래 독도 분산제 <ol><li> 삼일 후, 섬을 제거하지 않도록주의 깊게 우물에서 분석 미디어를 제거하고 폐기 마이크로 피펫을 사용합니다. 조심스럽게 분석 미디어 그들을 씻어 독도에 PBS μL (200)를 추가합니다. 조심스럽게 제거하고 마이크로 피펫으로 PBS를 무시하고 부드럽게 추가 200 μl의 PBS 다시 섬을 씻는다. </li><li> 제거하고 마이크로 피펫으로 PBS를 버리고 0.025 % 트립신 100 ㎕, 2 mM의 EDTA 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 3 분 동안 실온에서 품어. 피펫은 트립신 EDTA 용액 위로 독도가 육안으로 단일 세포로 분산 확인 될 때까지 아래로 매 2 분에 독도 광학 현미경을 사용하여 (세포의 일부 작은 덩어리가 여전히 존재할 수 있습니다). 각각의 웰에 개개의 전체 볼륨을 전송LY labeled-의 microcentrifuge 튜브로. </li><li> 트립신 매개 세포 분리를 중지 각 microcentrifuge 관에 섬 문화 매체의 400 μl를 추가합니다. </li><li> 4 ° C에서 100 XG에 5 분 원심 분리기 샘플의 microcentrifuge 튜브의 바닥에 작은 섬 세포 펠렛합니다. </li><li> 부드럽게 200 μL 신선한 섬 문화 매체에 마이크로 피펫을 이용하여 상층 액과에 resuspend 펠렛을 제거합니다. </li><li> 사이토 원심 분리기를 사용하여, 원심 분리기 청구 현미경 슬라이드에 3 분 140 XG에 독도 해리. </li><li> 실온에서 공기 건조 슬라이드는 10 분 동안, 다음 소수성 마킹 펜으로 해리 섬 주위에 상자를 그립니다. </li><li> 실온에서 10 분 동안 75 ㎕의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 세포를 고정한다. 4 % PFA를 제거하고 부드럽게 PBS 75 μL에 두 번 세포를 씻으십시오. 세정 후, 75 ㎕의 0.2 % 트리톤 X-100의 PBS에서 10 분간 세포와 Permeabilize 하시려면. 그런 다음, 75 μl의 PBS로 세포를 씻어. 주의 : PFA는 알레르기 발암 및 독성 것으로 알려져있다. </li></올&gt; 8. 면역 형광 인슐린에 대한 해리 독도 라벨링 및 세포 증식 마커, 사료된다 <ol><li> 100 슬라이드 용량 현미경 슬라이드 상자의 바닥이 젖은 종이 타월을 배치하여 습기 챔버를 준비합니다. </li><li> 장소는 습기 챔버에서 아래로 평면 (위를 향 세포)를 슬라이드. 마이크로 피펫을 이용하여 이전의 세척 단계에서 PBS를 흡입 및 차단 용액 75 μl를 첨가하여 표지 용 시료 준비 (5 % 정상 당나귀 혈청 PBS에서 (NDS)) 시료에 대한 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위해 각 슬라이드. RT에서 1 시간 동안 차단 용액에 슬라이드를 부화. </li><li> 부드럽게 흡 마이크로 피펫을 사용하여 기니아 피그 인슐린과 항 토끼 항 사료된다 항체를 포함하는 차 항체 용액 75 μL를 추가 차단 용액, PBS에서 5 % 1 μg의 NDS / mL로 희석 하였다. 1 시간 동안 실온에서 품어. 참고 : 세포 증식의 대안 마커는 세포 핵 항원 (PCNA)과 phosph 증식 포함ohistone H3 (PH3), </li><li> 부드럽게 마이크로 피펫 차 항체 용액을 흡인하고 75 ㎕의 PBS로 세포를 헹군다. 대기음 PBS는 마이크로 피펫을 사용하여 세포를 두 번 이상, 75 μL PBS와 각 시간을 씻어. 실온에서 1 시간 동안 차단 솔루션 2 μg의 / ㎖로 희석 75 μl를 방지 기니 돼지 Cy5에 차 항체 및 항 - 토끼를 Cy3 차 항체와 각 샘플을 품어. 참고 : 이미 미소를 라벨에 사용 된 동일하거나 스펙트럼 중복 형광으로 표지 된 이차 항체를 사용하지 마십시오. </li><li> 마이크로 피펫을 사용하여 실온에서 3 분 동안 PBS에서 300 nm의 DAPI의 75 μL에 품어 대기음 이차 항체 솔루션입니다. 대기음 DAPI는 마이크로 피펫을 사용하여 5 분 동안 탈 이온수로 헹군다. </li><li> 조심스럽게 마이크로 피펫을 사용하여 샘플에서 물을 대기음. 드롭 유리 커버 슬립에 antifade 시약을 포함하는 빠른 건조 장착 용액 (약 100 μl를) 발견. 오, 아래 현미경 슬라이드 샘플 측 전환장착 솔루션 NTO. 부드럽게 거품을 제거하고 부드럽고 깨끗한 티슈로 물기를 닦아 피펫 팁을 사용하여 슬라이드에 대해 커버 슬립을 누릅니다. 커버 슬립 실온에서 하룻밤 건조하도록 허용합니다. </li></ol> 9. 이미지 수집 및 분석 <ol><li> 이미지 획득을위한 부착 된 카메라와 함께 표면 형광 현미경을 사용합니다. 각 형광의 경우, 최적의 노출 시간 (- 사료된다 인슐린 80 밀리, 250 밀리 초 DAPI에 대한 일반적으로 20 밀리 초 40)을 결정한다. 이미지 수집 매개 변수를 모든 샘플에 대해 동일해야합니다. </li><li> 각 샘플의 경우, 수동으로 3,000 인슐린 양성 세포 수를 계산하고 그의 또한 사료된다 양성 얼마나 많은 계산합니다. 만 잘 정의하고 명확하게 보이는 핵이 인슐린 양성 세포를 계산합니다. 인슐린 양성 세포의 총 수에 의해 사료된다 양성 / 인슐린 양성 세포의 수를 나누고 100을 곱하여 샘플마다 β 세포 증식의 비율을 계산한다. </li><li> D 후,β 세포의 증식에 유의 한 차이는 제어 및 일방향 ANOVA 시판 통계 소프트웨어를 사용과 결과를 분석함으로써 실험 샘플 사이에 존재하는 경우, 각 샘플은 β 세포 증식의 비율 etermining 결정. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-based+technologies+for+osteoarthritis+detection+and+therapy.">Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy.</a> Drug Deliv Transl Res. , (2015).</li><li>Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+pH-+and+temperature-responsive+microparticles+for+protein+delivery+to+ischemic+tissues.">Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues.</a> Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).</li><li>Poole, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS-responsive+microspheres+for+on+demand+antioxidant+therapy+in+a+model+of+diabetic+peripheral+arterial+disease.">ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease.</a> Biomaterials. 41, 166-175 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

문화의 β 세포 증식의 연구는 일반적으로 여러 가지 어려움에 의해 방해된다. 우선, β 불멸화 세포주 라이브 아일렛 내인성 β 세포에서 발견 된 것보다 더 높은 정도의 증식을 특징으로한다. 또한 이러한 불멸화 세포주 정상 β 세포 기능에 중요한 일반 아키텍처 부족하다. 이 두 가지 사실이 결과는 생체 내에서 또는 전체 섬에서 시험했을 때 성립됩니다 불후의 β 세포 라인을 사용하여 얻...

췌장 β 세포는 몸의 유일한 인슐린 생산 세포이며 혈당 항상성을 유지하는 것이 중요하다. 건강한 사람이 충분한 β 세포 질량을 적절히 혈당을 조절하는 역할을하지만, 당뇨병을 가진 개인이 불충분 β 세포 질량 및 / 또는 1,2- 기능을 특징으로한다. 이 β 세포 증식을 유도하여 궁극적으로 β 세포 질량을 증가시키고 당뇨병 3 개인 글루코스 항상성을 복원 할 수 있도록 제안되어있다. 효과적인 치료법이 개발되기 전에 그러나, 평가, 그대로 섬에 잠재적 인 β 세포 증식 화합물의 확인이 필요합니다. 당뇨병을 가진 개인에 사체 인간의 독도의 이식은 몇 시간 동안 혈당 항상성을 복원되지만 가용성이 실험 절차의 성공은 섬의 후방에 이식 가능한 인간 섬의 부족에 의해 베타 세포 사멸에 의해 방해된다어 이식 4. 에도 인슐린 생성 세포의 증식을 유도하는 인자를 발견하여, 주요 문제는 여전히 생체 관련 사이트에 이들 인자를 전달 존재한다. β 세포 증식 화합물의 지속 로컬 배달을 위해 하나의 전략은 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜) 산 (PLGA)입니다. PLGA는 FDA에서 사용의 역사는 높은 안전성, 생분해 성 및 확장 릴리스 역학 5 때문에 약물 전달 제품을 승인했다. 즉, PLGA는 생체 내에서 자연적으로 또는 체내에서 대사를 발생하는 젖산 및 글리콜 산으로 배양 중 물로 가수 분해를 통해 락 타이드와 글리콜 라이드의 공중 합체이다. 캡슐화 된 약물 화합물의 확산 및 / 또는 변형 - 방출 조절기구 모두 주위 환경에 방출 될 수있다. COI의 캡슐화 unencapsula 비교 시약의 생체 이용률을 개선 효소 분해에 대한 보호를 제공테드 COI 5. 우리는 PLGA 미세 문화에 그대로 섬에 후보 화합물을 관리하는 데 사용 될 수 있으며, 궁극적으로 생체 내에서하는 것이 좋습니다. 이식 프로토콜을 탐험하기 전에 생체을 섬에 β 세포 분열 촉진 물질을 관리하는 PLGA의 효능을 테스트하는 것은 매우 중요하다. 현재 살아있는 동물의 β 세포 증식을 측정하는 기술도 없다. 실험 따라서 immunolabeling에 대한 pancreata의 다음 해부 및 가공과, 동물을 사는 이들 화합물의 투여를 필요로 생체 내에서 잠재적 인 증식 성 화합물의 효과를 평가합니다. 이러한 프로토콜은 비싸고 힘들고, 그리고 그들이 아일렛 도달 할 어떤 보장없이 전신적으로 투여되는 화합물을 필요로한다. 반대로, 여러 β 불멸화 세포주 배양 인슐린 생성 세포의 연구에 사용할 수 있지만, 이들 세포주는 섬 구조와 environmen 부족t는 유기체 (6) 생활에서 발견. β 불멸화 세포주는, 따라서, 생체 내에서 내인성 β 세포 복제보다 훨씬 높은 수준을 갖는 증식을 유도하는 화합물의 분석이 복잡 특징으로한다. 이 연구에서 우리는 성인 쥐에서 분리 된 그대로 독도를 사용하는 프로토콜을 설명합니다. β 세포주 달리 그대로 섬 정상 섬 구조를 유지한다. 마찬가지로, 직접 배양 그대로 섬에 증식 화합물을 투여하는, 생체 내에서 실시한 실험 달리 상당히 정확하게 β 세포 증식을 측정하기 위해 필요한 시약의 양을 감소시킨다. 현재의 연구는이 예에서는, COI를 관리 할 PLGA를 활용, 재조합 인간의 결합 조직 성장 인자 (rhCTGF). 이 일에 화합물의 지속적인 방출을 허용 여기에 기술 된 방법은 배양 섬에 원료 화합물의 관리를 통해 상당한 이점을 부여E 매질. 특히,이 시험은 단백질이 그대로 섬에 관심 항체의 다양한 관리하도록 변형 될 수있다. α 세포를 포함하는 다른 내분비 세포 유형에 효과가 또한 분석 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6149</td><td>For labeling COI with fluorophore</td></tr><tr><td>DMSO Dimethyl Sulfoxide</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>For dissolving fluorophore in step 1</td></tr><tr><td>Disposable PD-10 Desalting Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td>Desalting column used in step 1</td></tr><tr><td>Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>739960</td><td>Used in generation of microspheres in step 2</td></tr><tr><td>Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341584</td><td>Used in generation of microspheres in step 2</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Scientific</td><td>11879-020</td><td>For culturing islets</td></tr><tr><td>Dextrose Anhydrous</td><td>Fisher BioReagents</td><td>200-075-1</td><td>Supplement for islet media</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>Antibiotics for islet media</td></tr><tr><td>Normal horse serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>008-000-121</td><td>Supplement for islet media</td></tr><tr><td>96-well tissue culture plate</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>For culturing islets</td></tr><tr><td>Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-&lt;em&gt;N,N,N&#039;,N&#039;&lt;/em&gt;-tetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>Supplement for pre-assay islet media</td></tr><tr><td>Cytospin 4 Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>For spinning cells onto microscope slides</td></tr><tr><td>EZ Single Cytofunnel</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710020</td><td>For spinning cells onto microscope slides</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP118-500</td><td>Used in dissociating islets</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>For fixing cells</td></tr><tr><td>Triton&amp;nbsp; X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151</td><td>For permeabilizing cells</td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>Blocking reagents for immunofluorescence</td></tr><tr><td>Anti-Ki67 antibody</td><td>abcam</td><td>ab15580</td><td>For Ki67 immunofluorescence</td></tr><tr><td>Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>For insulin immunofluorescence</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>For Ki67 immunofluorescence</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td>For insulin immunofluorescence</td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>For nuclei visualization in immunofluorescence</td></tr><tr><td>Aqua-Mount</td><td>Lerner Laboratories</td><td>13800</td><td>Fast drying mounting media</td></tr><tr><td>FreeZone -105 &amp;deg;C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System</td><td>Labconco</td><td>7382020</td><td>For lyophilization of microspheres</td></tr></tbody></table>

sustained administration of &#946;-cell mitogens to intact mouse islets ex vivo using biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres

생체 재료의 개발은 췌장 β 세포를 포함한 세포 및 조직 유형의 다양한 표적 약물 전달의 가능성을 증가 현저했다. 또한, 생체 재료 입자, 하이드로 겔 및 비계는 독특한 기회를 제공하는 것은 유지 관리하려면 제어 약물 전달은 β 세포를하는 문화와 이식 조직 모델에서. 이러한 기술은 본래 섬과 병진 관련 시스템을 이용하여 후보 β 세포 증식 인자에 대한 연구를 허용한다. 또한, 배양 시스템에서 β 세포 증식을 자극 후보 인자의 효과 및 타당성을 결정하는 것은 생체 내 모델 전진 전에 중요하다. 여기서 우리가 관심있는 생분해 성 화합물 (COI) -loaded 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) 인 시츄 이형 O에서 유지의 효과를 평가하기위한 목적으로 (PLGA) 마이크로 스피어와 본래 마우스 아일렛 배양 공동하는 방법을 서술β 세포 증식에 ​​F 분열 촉진 인자. 이 기술은 상업적으로 입수 가능한 시약을 사용하여 원하는화물을 함유하는 PLGA 미립자를 생성하는 방법에 대해 상세히 설명한다. 설명 된 기술은 예를 들어 재조합 인간 결합 조직 성장 인자 (rhCTGF)를 사용하지만, COI 다양한 용이하게 사용될 수있다. 또한,이 방법은 β 세포 증식을 평가하는 데 필요한 시약의 양을 최소화하기 위하여 96 웰 플레이트를 사용한다. 이 프로토콜은 용이하게 다른 생체 물질 및 세포 생존 및 분화 상태와 같은 다른 내분비 세포의 특성을 이용하도록 구성 될 수있다.

도 1은 위의 프로토콜을 사용하여 생성 된 마이크로 스피어의 시각적 표현이다. 여기에 설명 된 프로토콜은 다양한 크기의 rhCTGF로드 미소를 산출한다. 약간의 미소가 더 큰 (그림 2)있을 수 있지만 마이크로의 가장 큰 부분은 직경이 1 ㎛ 내지 10이됩니다. 원하는 경우, 미세 크기 조정 및 균질화 속도 및 시간, 사용되는 계면 활성제의 ?...

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Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

본래 마우스 독도에 β 세포 분열 촉진 물질의 지속적인 관리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 생분해 성 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) 마이크로 스피어를 사용하여

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

sustained-administration-cell-mitogens-to-intact-mouse-islets-ex-vivo

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.2K 조회수.  Vanderbilt University Medical Center. Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.

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Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and physical architecture. Applications include cell encapsulation, drug delivery, stem cell culture, and tissue engineering scaffolds. In fact, clinical trials are currently being performed in which islets are encapsulated in PLO coated alginate microbeads as a treatment of type I diabetes. However, large numbers of islets are required for efficacy due to poor survival following transplantation. The ability to locally stimulate microvascular network formation around the encapsulated cells may increase their viability through improved transport of oxygen, glucose and other vital nutrients. Fibroblast growth factor-1 (FGF-1) is a naturally occurring growth factor that is able to stimulate blood vessel formation and improve oxygen levels in ischemic tissues. The efficacy of FGF-1 is enhanced when it is delivered in a sustained fashion rather than a single large-bolus administration. The local long-term release of growth factors from islet encapsulation systems could stimulate the growth of blood vessels directly towards the transplanted cells, potentially improving functional graft outcomes. In this article, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. In addition, we describe a method we developed for generating multilayered alginate microbeads. Cells can be encapsulated in the inner alginate core, and angiogenic proteins in the outer alginate layer. The release of proteins from this outer layer would stimulate the formation of local microvascular networks directly towards the transplanted islets.

In the following sections, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. We specifically illustrate a technique for creating multilayered alginate microspheres for the dual purpose of cell and protein encapsulation as a potential treatment for type 1 diabetes.

바이오 메디컬 응용 프로그램을위한 알긴산 Microspheres의 생성

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

연구

의학

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

당뇨병 쥐의 부고환 지방 세포에 이식 된 지지체 지지대 지지대

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

생체공학

Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and survival post-transplantation. This protocol aims to achieve surface engineering of pancreatic islets using an ultrathin heparin-incorporated starPEG (Hep-PEG) nanocoating. To generate the Hep-PEG nanocoating for pancreatic islet surface engineering, heparin succinimidyl succinate (Heparin-NHS) was first synthesized by modification of its carboxylate groups using N-(3-dimethylamino propyl)-N'-ethyl carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). The Hep-PEG mixture was then formed by crosslinking of the amino end-functionalized eight-armed starPEG (starPEG-(NH2)8) and Heparin-NHS. For islet surface coating, mouse islets were isolated via collagenase digestion and gradient purification using Histopaque. Isolated islets were then treated with ice cold Hep-PEG solution for 10 min to allow covalent binding between NHS and the amine groups of islet cell membrane. Nanocoating with the Hep-PEG incurs minimal alteration to islet size and volume and heparinization of the islets with Hep-PEG may also reduce instant blood-mediated inflammatory reaction during islet transplantation. This "easy-to-adopt" approach is mild enough for surface engineering of living cells without compromising cell viability. Considering that heparin has shown binding affinity to multiple cytokines, the Hep-PEG nanocoating also provides an open platform that enables incorporation of unlimited functional biological mediators and multi-layered surfaces for living cell surface bioengineering.

This protocol aims to achieve surface engineering of pancreatic islets using a heparin-incorporated starPEG nanocoating via pseudo-bioorthogonal chemistry between the N-hydroxysuccinimide groups of the nanocoating and the amine groups of islet cell membrane.

Heparinized StarPEG Nanocoating와 췌 장 독도의 표면 공학

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

높은 콘텐츠<em&gt; 체외</em&gt; 췌장 작은 섬의 β 세포 복제 디스커버리 플랫폼

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

Intraportal 이식 마우스 모델에서 췌 장 독도의

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

생물학

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The three-dimensional culture method described in this protocol recapitulates pancreas development from dispersed embryonic mouse pancreas progenitors, including their substantial expansion, differentiation and morphogenesis into a branched organ. This method is amenable to imaging, functional interference and manipulation of the niche.

분산 된 마우스 배아 전구 세포에서 생체 췌장 기관 형성에

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the kidney capsule in most rodent preclinical islet transplantation studies. This model is commonly used because murine intrahepatic islet transplantation is technically challenging, and a high percentage of mice could die from surgical complications, especially bleeding from the injection site post-transplantation. In this study, two procedures that can minimize the incidence of post-infusion portal vein bleeding are demonstrated. The first method applies an absorbable hemostatic gelatin sponge to the injection site, and the second method involves penetrating the islet injection needle through the fat tissue first and then into the portal vein by using the fat tissue as a physical barrier to stop bleeding. Both methods could effectively prevent bleeding-induced mouse death. The whole liver section showing islet distribution and evidence of islet thrombosis post-transplantation, a typical feature for intrahepatic islet transplantation, were presented. These improved protocols refine the intrahepatic islet transplantation procedures and may help laboratories set up the procedure to study islet survival and function in pre-clinical settings.

Here we present refined surgical procedures on successfully performing intraportal islet transplantation, a clinically relevant but technically challenging surgical procedure, in mice.

마우스에서 간내 섬 이식 중 주입 후 포털 정맥 출혈 최소화

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

마우스에서 췌장 췌도 격리를 위한 간단한 고효율 프로토콜

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet infusion is far from ideal and therefore, the omentum is re-emerging as a potentially valuable site for islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and the implantation of the islets to the diabetic recipients. Transplantation to the omentum requires surgical steps that can be better demonstrated visually. Here, the detailed steps for this procedure are presented. Two methods of mixing the isolated islets with hydrogel before placing the mixture into the omental pouch of diabetic mice are described here. Different hydrogels are used for the different conditions. Blood glucose levels of diabetic mouse recipients of syngeneic islets in the omentum were monitored for up to 35 days. Some animals were sacrificed after 14 days to perform immuno-histochemical analysis. This pre-clinical transplantation approach can be used as preliminary data leading up to translation to clinical transplantation.

A method for the omental transplantation of islets in a mouse is introduced. The isolated islets are mixed with hydrogel and the mixture is placed into the omental pouch of a diabetic mouse. Then, the blood glucose is monitored, and immuno-histochemical analysis is performed.

마우스에 Omentum 작은 섬 이식 하는 방법

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본래 마우스 독도에 β 세포 분열 촉진 물질의 지속적인 관리

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