Name: combining intravital fluorescent microscopy (ivfm) with genetic models to study engraftment dynamics of hematopoietic cells to bone marrow niches
Uploaded: 2017-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches at JoVE.com

이미지는 닥터 켄 던 감독 하는 인디애나 대학에서 생물학 현미경에 대 한 인디애나 센터에서 실시 되었다. Stereotaxic 장치 설계 및 마크 Soonpaa, 웰 스 소아 연구 센터에 의해 만들어진 프로토 타입 이다. 이 작품은 NIH/R01DK097837-09 (NC)에 의해 지원 되었다, NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), MPN 연구 재단 (NC)와 CTSI 공동 프로젝트 IUSM/노 틀 담 (NC).

동물의 사용을 포함 하는 모든 절차는 동물 관리 및 사용 위원회의 인디애나 대학의과의 인증 수행 했다. 확인 작업을 수행 하는 국가의 동물 실험에 법안을 준수 합니다.
1. Mx1CreRBPJ-/- 받는 사람 마우스의 준비
<ol><li>Mx1-Cre+ RBPJlox/lox 쥐10 Mx1-Cre를 얻을 마우스를 크로스 RBPJlox/lox 쥐12 양수와 Mx1-Cre 부정적인 RBPJlox/lox littermates 컨트롤로 사용 하. PCR10유전자 형을 확인 합니다.</li>
	<li>6-8 주를 사용 하 여-오래 된 Mx1Cre+/RBPJlox/lox 및 Mx1Cre-/RBPJlox/lox 마우스 polyI:C 유도 수행 하려면.</li>
	<li>
PolyI:C 200 µ g i.p. Cre+ 및 Cre- 마우스에 주사. 한 polyI:C 주사 3 일 첫 주 동안 매일 제공 합니다. 한 polyI:C 주사 두 번째 주, 이전 주입 (총에서 4 개의 주사) 후 7 일 제공 합니다.
	<ol>
<li>RBPJKO를 사용 하 여 (Mx1Cre 유도+/RBPJlox/lox)와 RBPJWT (유도 Mx1Cre-/RBPJlox/lox) 받는 마지막 polyI:C 주입 후 3 주 사람으로 쥐. 참고: 그것은 주입 후 3 주 pI: pC에 의해 유도 된 마우스를 사용 하 여 권장. PolyI:C에 의해 발생 하는 IFNα 응답 BM, HSC의 immunophenotypic 확장 결과에 큰 변화를 유도 하 고 주변 혈액16,17에 성숙한 창시자의 출력을 감소. 조 혈 하위 집합의 표현은 정규화 된 3 주 후 주입 및 쥐 염증의 혼란 효과 없이 이용 될 수 있다. 이 유도 프로토콜은 RBPJ에 대 한 최적화 되었습니다. 유도 프로토콜 구문, 따라 달라질 수 있습니다 다른 유전자를 삭제 하 고 삭제를 확인 합니다. 우리는 총 4 개의 polyI:C 주사 후 RT-PCR에 의해 loxP 사이트 사이 RBPJ 영역의 ~ 100% 삭제 확인.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 리스 EGFP 기증자의 골 수 세포 이식에 대 한 준비
<ol><li>한 리스 EGFP 마우스 (이산화탄소 뒤에 자 궁 경부 전위)를 안락사 1 또는 2에 이식 하기 전에 h.</li>
	<li>70% 에탄올과 동물 몸 표면 스프레이.</li>
	<li>수술가 위를 사용 하 여 두 다리 발목 주위에 피부 절 개 하 고 수술 집게로 당겨 떨어져 피부와 함께 깨끗 한 근육 조직을 노출 하는 모피.</li>
	<li>수술가 위를 사용 하 여 가능한 많은 근육 다리에서 제거. 한가 위를 사용 하 여 (무릎과 발목 관절)에서 뼈를 잘라 하 고 화관에서 tibias 거 즈 스폰지를 사용 하 여 모든 나머지 근육 조직의 청소. (2 개의 화관과 두 tibias) 뼈 포함 된 DMEM 10 %6 잘 플레이트에 배치 FBS.</li>
	<li>10 mL 감기 2 mM EDTA PBS와 피펫으로 박격포에 뼈 골 셀을 단일 셀 서 스 펜 션으로 셀을가지고 크 러시. 또는, 1 mL 주사기 각 측에서 2 mM EDTA PBS 3 시간 뼈를 플러시.</li>
	<li>15 mL 원심 분리기 관으로 70 µ m 필터를 사용 하 여 골 수 세포를 필터링 합니다. 2-3 mL PBS의 필터를 씻어. 460 x g에서 10 분 아래로 셀 회전, resuspend 10 ml 신선한 DMEM의 셀 10 %FBS.</li>
	<li>hemocytometer에 골 셀을 1.5 x 107 셀/mL IMDM에 없이 혈 청 농도 조정 합니다. 200 µ L의 양으로 동물 당 3 x 106 셀을 사용 합니다. 총 BM의 약 1/3 세포는 골수성 GFP + 셀. 주입에 대 한 준비까지 얼음에 셀을 둡니다. 105 셀 x 0.5를 사용 하 여 GFP 식을 FACS9에 의해 결정.</li>
</ol>3. RBPJKO 쥐로 리스 GFP 셀 골 수 이식
<ol><li>받는 사람 마우스 원형에 제 지. 감마 방사선의 치명적인 복용량을 가진 쥐를 비추는 (1200 Rad) Cs 137 irradiator에. 분할 복용 프로토콜을 사용 하 여: 저녁에 900 래 드 300 래 드 뒤 다음날 아침 (16 h 떨어져).</li>
	<li>치명적 방사능된 RBPJWT 및 RBPJKO 받는 사람 마우스 이식 방사선의 두 번째 투여 후 5-6 h. BM 주사 셀 리스 EGFP 쥐 꼬리 정 맥 주입 (수확 제 2에 있는 셀에 대 한 세부 정보 참조) 동물 을 통해 당 3 x 106 세포의 농도에서에서 수확.</li>
	<li>다른 시간 지점에서 IVFM에 의해 이식된 생쥐의 독립적인 동료 이미지: 24 h, 그리고 2, 4, 6, 설명 대로 아래 주 (4 & 5 vivo에서 이미징 절차에 대 한 섹션 참조).</li>
</ol>4. 수술 준비 Intravital 이미징
<ol><li>수술 기구를 소독. 두 집게 (한 직선, 각도 하나), 좋은 좋은 위과 바늘의 한 쌍의 한 쌍. 모든 공급 절차에 필요한 요원 영역을 준비 합니다.</li>
	<li>마우스에 게 케 타 민 칵테일 마 취의 IP 주사 (Xylazine 2.5-5 m g/k g + acepromazine 1.0-2.5 m g/k g + 케 타 민 90-100 mg/kg) 26-28 G 바늘 주사기를 사용 하 여.  동물은 매 15 분 절차 동안 모니터링 될 것 이다 하 고 마 취 원래 복용량의 ¼에 필요에 따라 보완 될 것입니다.</li>
	<li>적절 한 열 소스 (37 ° C가 열 패드가 열 패드와 직접적인 접촉에서 보호 동물)에 마우스를 놓고 시각적으로 호흡 속도 모니터링 합니다.</li>
	<li>발가락을 사용 하 여 반사 꼬집어 응답을 확인 합니다. 동물 인지 확인 완전히 마 취 수술 절차를 시작 하기 전에.</li>
	<li>26-28를 사용 하 여 주고 쥐 형광 혈관 마커 (Dextran, 20 mg/mL 해결책의 100 μ)의 꼬리 정 맥 주입 바늘 주사기 게이지.</li>
	<li>두 눈에 수 의사 눈 연 고를 적용 합니다. 클립을 작은 전기 면도기와 동물의 머리의 등 쪽 표면. 제 모 크림을 제거 하 여 다음 식 염 수로 씻어 5 분 사용 거 즈 스폰지에 크림을 적용 합니다. 70% 알코올 면봉을 사용 하 여 깨끗 한 두 피를 준비.</li>
	<li>기본 등 두개골 표면 노출로 두 피에 작은 중간 피부 절 개 (10-20 m m)을 잘 집게와가 위를 사용 합니다. 5-0 수술 실크를 사용 하 여 피부 절 개를 만드는 영상에 대 한 calvarium를 노출 하는 플랩의 각 측면에 두 개의 숙박 봉합 배치.</li>
	<li>그들의 뒤에 쥐를 놓고 현미경 기름을 가득 유리 하단 접시에 노출 된 두 피를 잠수함. Mutiphoton 룸 이미징에 동물을 전송 합니다.</li>
	<li>동물에 현미경 단계 목표 위에 유리 접시에 위치 하는 calvarium와 놓고는 37 다음 커버° C가 열 패드 (동물 열와 직접적인 접촉에서 보호 되어야 합니다).</li>
</ol>5. Vivo에서 마우스 Calvarium의 고해상도 영상
<ol><li>Multiphoton 이미징에 대 한 수정 하는 거꾸로 confocal 시스템을 사용 하 여 ( 자료 표참조). 다음 제조업체의 지침 조정 830에 2 광자 레이저 nm, 20 장소 X W, 나 0.95 렌즈 현미경 코 조각에 레이저 빔 정렬 확인. 참고: 똑바로 현미경 시스템은 가장 일반적으로 이러한 연구에 대 한 사용 하지만 거꾸로 multiphoton 시스템 또한 활용 될 수 있습니다. 본이 연구에서는 사용자 지정 설계 된 atraumatic stereotaxic 장치 사용 되었다. 똑바로 현미경 시스템에 대 한 몇 가지 상용 stereotaxic 장치 있지만 마우스 두개골 확보 겨냥 하는 거꾸로 한 현미경 시스템에 대 한 아무 상업적으로 이용 가능한 stereotaxic 장치가입니다. 사용자 지정 stereotaxic 장치에 대 안으로, 두개골 위의 안정성에 대 한 다양 한 테이프 또는 접착제 방법을 활용 하 고 목표 위치에 보안 수 있습니다.</li>
	<li>이미지 수집 소프트웨어를 엽니다. "수집 설정"에서 패널 한 방향 스캐닝 모드 선택 됩니다 확인 합니다. 4 μ/픽셀, 512 x 512 픽셀 프레임 속도 스캔 속도를 설정 하 고 1.5로 확대. 20 X W 나 0.95 목표는 nosepiece에서 렌즈에 맞게 사용할 수 있는 렌즈의 목록에서 선택 합니다.</li>
	<li>"이미지 수집" 제어판에서 "염료" 목록에 액세스 하 고 "두 광자"를 선택 합니다. "빛 경로 & 염료" 창 열고 레이저 단위 2에서에서 확인란을 선택 하 여 DM690-980 여기 DM. 2 P 레이저 셔터 열기를 선택 합니다. "현미경 컨트롤러" 창에서 RDM690 미러를 선택 합니다.</li>
	<li>"피 램프"를 선택, B/G 피 필터 큐브를 선택 하 고 목표 혈관 흐름을 사용 하 여 참조로 중앙 정 맥 (a)와 (b) (그림 2A) 관상 봉합의 분기 calvarium 골 틈새를 시각화 하는 표본에 집중.</li>
	<li>
비 descanned 모드를 사용 하 여 이미지를 수집 합니다. 3 외부 감지기 선택: PMT detector1 콜라겐의 SHG 신호 수집 하 (방출 필터-430/100 nm), GaAsP detector2 수집 GFP 신호 (방출 필터-525/50) 및 GaAsP detector3 TRITC-dextran의 신호를 수집 하 (방출 필터-605/90 nm).
	<ol>
<li>스캔 속도 4μs/phototoxicity를 최소화 하기 위해 아무 평균 픽셀에서 이미지를 수행 합니다. 최소한의 채도와 검출기의 전체 동적 범위를 사용 하도록 조정 일정 레이저 파워 및 검출기 이득에서 이미지를 수집 합니다.</li>
		<li>Calvarium 골 수의 6 지역에서 조직 (60 x 1 μ m Z-스택)의 깊이 통해 섹션의 시리즈를 수집 합니다. 1 μ m의 단계 크기 설정을 사용 하 여, 확대/축소 1.5 및 512 x 512 픽셀 프레임 크기 (423 µ m x 423 µ m). 참고: 전체 한 마우스를 이미지 하는 데 필요한 총 시간 1-1.5 h입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6입니다. 정량 분석
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 전용된 3D/4d 이미지 정량 및 시각화 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 정량 및 3D 개조를 수행 ( 자료 표참조). Z-스택 최대 강렬 투 상 (MIP), 활용 하는 차원에서 알파 혼합 또는 그림자 투영 볼륨 렌더링 알고리즘을 대화식으로 시각화.</li>
	<li>사용 하 여 GFP 셀 세그먼트는 "자리 개체 세그먼트화 모듈". 스택 산술 처리 (채널 빼기) 거짓 긍정적인 수 GFP 셀 (녹색 및 빨강 채널에서 강한 형광을 표시 하는 뼈 세포의 신호 제거)를 제거 하기 위해 적용 됩니다.</li>
	<li>맥 관 구조와 뼈 표면 표면 세그먼트화 모듈을 사용 하 여의 세분화를 수행 합니다. 필요한 경우, "표면에 반점의 거리" 라고 하는 X-긴장 알고리즘을 적용 하 여 위의 표면에 세포의 거리를 계산 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Carlesso, N., Cardoso, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+regulatory+niches+and+their+role+in+normal+and+malignant+hematopoiesis.">Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance.">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).</li><li>Calvi, L. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size.">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).</li><li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche.">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).</li><li>Naveiras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone-marrow+adipocytes+as+negative+regulators+of+the+haematopoietic+microenvironment.">Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment.</a> Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).</li><li>Scheiermann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenergic+nerves+govern+circadian+leukocyte+recruitment+to+tissues.">Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues.</a> Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).</li><li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. 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K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow.">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> J Vis Exp. (91), e51683 (2014).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 Intravital 형광 현미경 검사 법에 의해 최적화 engraftment 조 혈 모 세포의 활동을 연구 하는 실험 설계를 설명 합니다. 이 연구에서는 골수성 조상 세포 WT BM 또는 노치 신호 결함이 있는 BM의 확장 했다 추적 뼈 calvarium에서 다음 리스 GFP 긍정적인 골수성 세포 BMT 후 받는 사람 RBPJWT 또는 RBPJKO로. 이 접근은 주소 비슷한 질문에 예를 들면 적용 될 수 있는 모델로 제안: 나) 확장과 다른 계보의 ...

Intravital multiphoton 형광 현미경 검사 법 (IVFM)는 강력한 이미징 기술을 고해상도, 실시간 이미징 조직 깊이의 최대 허용 하는 조직에 따라 1 mm. 마우스 calvarium에 적용 하면, 그것은 60-100 μ m11을 비-침략 적 방법으로 BM 내의 조 혈 모 세포의 행동을 관찰을 허용. 이 방법은 여기 engraftment 정식 노치 신호 부족 BM의 RBPJ 녹아웃 쥐에 있는 정상적인 골수성 창시자의의 활동을 결정 하기 위해 사용 됩니다.
우리 그룹에서 최근 작품 그 결함이 정식 노치 신호 myeloproliferative 같은 질병12BM microenvironment 리드에서 설명 했다. 노치 신호 손실 RBPJ, 하류 신호, 재결합10유도 Mx1-Cre를 사용 하 여 정식 노치의 중요 한 녹음 방송 요인의 DNA 묶는 도메인의 조건부 삭제에 의해 얻은. 이 연구에서는 Mx1-Cre/RBPJlox/lox 마우스 모델 사용 되었다. RBPJ의 DNA 묶는 주제의 조건부 삭제에서 모든 노치 수용 체 신호 손실 발생 합니다. Mx1-Cre 모델, Cre 식 polyI:C 여러 기관의 stromal 구성 요소에서 뿐만 아니라 혈액 세포에서 타겟된 유전자 삭제의 유도에 결과의 관리에 따라 활성화 Mx1 발기인에 의해 구동 됩니다 포함 한 BM, 비장 및 간.
Mx1-Cre+/RBPJlox/lox ,lox/lox 마우스 Mx1-Cre-/RBPJ polyI:C (hereon 표시 된 RBPJKO와 RBPJWT, 각각)와 유도 방사능 치명적 이었고 정상, 야생 타입 조 혈 모 세포 이식. 이식 후 4 주부터 시작 해 서, RBPJKO 받는 사람 상당한 leukocytosis로 선행 개발. RBPJKO 마우스 골수성 창시자의 증가 비율에에서 제시는 BM 주 8에서 이식 후 고 나중 시간 지점에서 비록 4-6 주에 BM의 분석 그들의 골수성 세포 콘텐츠 제어 RBPJWT에 비해 눈에 띄는 차이 공개 하지 않았다 받는 사람. BM microenvironment myeloproliferative 표현 형의 개시에 직접적인 영향을 미쳤다 Mx1-Cre 다른 조 혈 기관, 표현 된다 사실 함께이 관찰, 질문을 발생 합니다.
BM 질병 개발의 중요 한 초기 사이트 였는 지 여부를 확인 하려면 마우스 calvarium의 IVFM와 BM 이식 (BMT), RBPJ 노크 아웃 모델 계보 추적 시스템 조합에 사용 되었다. 유전자 변형 마우스 특정 lysozyme 발기인 (리스-GFP)9 의 통제 EGFP 표현 BM BMT 후 이미징 동안 구상 될 수 있는 기증자 세포를 얻기 위해 사용 되었다. Lysozyme 식이 골수성 세포 특정 고 리스-GFP 성숙한 granulocyte13일반적인 골수성 조상 (CMP)에서 셀을 표시 합니다.
다른 시간 지점에서 BM의 IVFM는 리스 GFP 셀 BM의 RBPJWT 및 RBPJKO 받는 사람에 게 마찬가지로 홈 하지만 확장 및 BM의 RBPJKO 받는 사람에서 빨리 engrafted 시연 했다. 이 차이 이전 시간 시점 (주 2) 극적인 되었고 시간이 지남에 따라 감소 (주 4 및 6). 그러나, 이러한 나중 시간 지점에서 동일한 받는 사람에 조 혈 구획의 평가 골수성 세포는 샌드위치에 순환 수에 꾸준히 증가 보였다 고 셀의 증가 출력을 나타내는 RBPJKO 마우스의 비장에 순환에 BM. 리스-GFP 셀 지역화는 BM에 이식된 생쥐의 6 주에의 분석 컨트롤에서 보다 RBPJKO microenvironment에 골수성 세포는 맥 관 구조에서 거주 했다 밝혔다.
샨 다, 이러한 특정 동물 모델 IVFM의 조합 RBPJKO BM microenvironment 골수성 세포의 engraftment 역학에서 통찰력 제공. 실험 설계 및 여기서 설명 하는 양적 접근 비슷한 질문을 해결 하기 위해 적용할 수 있는 패러다임으로 제시 된다. 예를 들어 모델, RAG1 GFP14 또는 Gata1 GFP15 마우스 추적 다른 셀 특정 계보를 사용 하 여 림프의 동작에 따라 수 또는 erythroid 창시자는 BM에 각각.

<table><tbody><tr><td>Ketamine cocktail</td><td>IU School of Medicine</td><td></td><td>Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg</td></tr><tr><td>TRITC dextran</td><td>Tdb Consultancy</td><td>TD150-100mg</td><td>Other color dextran may be used.</td></tr><tr><td>Andis hair trimmer</td><td>Braintree Scientific</td><td>CLP-323 75</td><td></td></tr><tr><td>Gauze sponge</td><td>Med Vet International</td><td>PK224</td><td>4-ply, 2 x 2</td></tr><tr><td>Nair depilatory cream</td><td>Commercial store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Med Vet International</td><td>RXSAL-POD1LT</td><td>0.9% Sodium Chloride poly bottle</td></tr><tr><td>Insulin syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-79</td><td>28 g, 1/2 cc</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>00108-11, 00109-11</td><td>straight forcep, angled forcep</td></tr><tr><td>Scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-14</td><td></td></tr><tr><td>5-0 silk suture</td><td>Fisher Scientific</td><td>MV-682</td><td>Other non-absorbable suture may be used</td></tr><tr><td>WillCo- glass bottom dish</td><td>WillCo</td><td>GWSt-5040</td><td></td></tr><tr><td>Optical microscope oil</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic stage insert&amp;nbsp;</td><td>IU School of Medicine</td><td>Custom design</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV1000 confocal microscope system&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small heating pad</td><td>Commercial store</td><td></td><td>Zoo Med reptile heating pad</td></tr><tr><td>Imaris 8.1 imaging software</td><td>Bitplane</td><td></td><td>3/4 D Image Visualization and Analysis software</td></tr></tbody></table>

combining intravital fluorescent microscopy (ivfm) with genetic models to study engraftment dynamics of hematopoietic cells to bone marrow niches

증거를 증가 일반 조 전문된 세포 벽 중요 한 조 혈 줄기 세포 (HSC) 기능1,2변조를 포함 하는 BM, 뚜렷한 microenvironmental 신호에 의해 규제 됩니다 나타냅니다. 실제로, 조 혈 microenvironment의 더 상세한 그림은 이제 신흥에 endosteal와 내 피 틈새 형성 정상 HSC와 그들의 자손3,4,5의 규칙에 대 한 기능 단위 . 새로운 연구는 adipocytes, 유지 하 고 HSC 기능6,,78조절에 신경 세포, 혈관 주위 세포의 중요성을 계시 했다. 또한, 다른 계보, 즉 골수성과 림프 성 세포, 가정에서 세포 및 BM microenvironment 내의 특정 틈새에 있는 증거가 있다. 그러나, BM microenvironment 및 그것의 거주자의 완전 한 매핑 진행 중에서입니다.
계보 특정 형광 표식 또는 부족 BM 틈새의 특정 셀에 선택한 분자 유전자 조작 생쥐를 표현 하는 유전자 변형 마우스 긴장 지금 사용할 수 있습니다. 노크 아웃 및 혈통 추적 모델, 이식 방법, 함께에서 제공 기회 "틈새" 특정의 역할에 대 한 지식을 구체화를 세포 HSC, 같은 정의 된 조 혈 인구에 대 한 B-세포, T 세포, 골수성 세포와 erythroid 셀입니다. 이 전략은 calvarium의 2 광자 현미경의 사용을 병합 하 여 더 potentiated 될 수 있습니다. 제공 함으로써 고해상도 이미징 vivo에서 및 BM calvarium의 3 차원 렌더링, 우리가 지금 정확 하 게 위치 특정 조 혈 하위 집합은 BM에 가정과 평가 시간이 지남에 그들의 확장의 활동을 확인할 수 있습니다. 여기, 리스-GFP 유전자 변형 마우스 (골수성 세포 표시)9 , RBPJ (정식 노치 신호 부족 한) 녹아웃 쥐10 사용 됩니다 IVFM와 함께에서 노치 결함이 BM microenvironment 골수성 세포 engraftment 결정 하.

2 RBPJKO 및 2 RBPJWT 받는 사람의 동료 다른 시간 지점에서 개별 이미징 세션에 몇 군데 있었다: 24 h와 2, 4 및 6 주 (워크플로 그림 1A일러스트) BM 리스-GFP 세포의 이식 후.
각 마우스에서 이미지 (그림 2A,)중앙 정 맥 그리고 관상 봉합 (그림 2A, b)의 분기점에 관하여 그들의 위치에 의?...

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Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)는 calvarium의 유도 및 조 혈 모 세포의 골 수 (BM) 틈새로 engraftment 연구 유전 동물 모델에 적용 됩니다.

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

combining-intravital-fluorescent-microscopy-ivfm-with-genetic-models

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

7.9K 조회수.  Indiana University School of Medicine. Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)는 calvarium의 유도 및 조 혈 모 세포의 골 수 (BM) 틈새로 engraftment 연구 유전 동물 모델에 적용 됩니다.

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Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

조혈 세포의 자동화 된 정량화 - Undecalcified 뼈의 조직 학적 이미지에서 기질 세포 상호 작용

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

연구

발생학

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

개발, 확대,<em&gt; 생체 내</em&gt; 인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)에서 인간 NK 세포의 모니터링 및 및 유도 된 pluripotent 줄기 세포 (유도 만능)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

생체공학

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

경쟁 손쥐 골수 이식 모델에서 기증자 세포 Engraftment를 확인하려면 수량 실시간 PCR을 사용하여

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

의학

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that participate in regenerating tissue, tumor formation, or vasculogenesis, we devised a multi-colored cellular transplant model of tumor development in which cell populations originate from different fluorescently colored reporter gene mice and are transplanted, engrafted or injected in and around a developing tumor. These colored cells are then recruited and incorporated into the tumor stroma. In order to quantitatively assess bone marrow derived tumor stromal cells, we transplanted GFP expressing transgenic whole bone marrow into lethally irradiated RFP expressing mice as approved by IACUC. 0ovarian tumors that were orthotopically injected into the transplanted mice were excised 6-8 weeks post engraftment and analyzed for bone marrow marker of origin (GFP) as well as antibody markers to detect tumor associated stroma using multispectral imaging techniques. We then adapted a methodology we call MIMicc- Multispectral Interrogation of Multiplexed cellular compositions, using multispectral unmixing of fluoroprobes to quantitatively assess which labeled cell came from which starting populations (based on original reporter gene labels), and as our ability to unmix 4, 5, 6 or more spectra per slide increases, we&#39;ve added additional immunohistochemistry associated with cell lineages or differentiation to increase precision. Utilizing software to detect co-localized multiplexed-fluorescent signals, tumor stromal populations can be traced, enumerated and characterized based on marker staining.1

Complex tissue masses, from organs to tumors, are composed of various cellular elements. We elucidated the contribution of cellular phenotypes within a tissue utilizing multi-labeled fluorescent transgenic mice in combination with multiparameter immunofluorescent staining followed by spectral unmixing to decipher cell origin as well as cell characteristics based on protein expression.

세포의 기원, 종류, 그리고 상호 작용의 시각화를위한 형광 조직 이식에 따라 정량 멀티 스펙트럼 분석

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

마우스 골수 단핵구를 추적<em&gt; 생체</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

면역학 및 감염병학

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

대한 대퇴골 창 회의소 모델<em&gt; 생체</em쥐의 골수에서&gt; 셀 추적

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

생물학

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

<meta charset="utf8"></head><body>살아있는 쥐의 골수 연구를 위한 대퇴 내 주사

Simplified Intrafemoral Injections Using Live Mice Allow for Continuous Bone Marrow Analysis

Despite the complexity of hematopoietic cell transplantation in humans, researchers commonly perform intravenous or intrafemoral (IF) injections in mice. In murine models, this technique has been adapted to enhance the seeding efficiency of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). This paper describes a detailed step-by-step technical procedure of IF injection and the following bone marrow (BM) aspiration in mice that allows for serial characterization of cells present in the BM. This method enables the transplantation of valuable samples with low cell numbers that are particularly difficult to engraft by intravenous injection. This procedure facilitates the creation of xenografts that are critical for pathological analysis. While it is easier to access peripheral blood (PB), the cellular composition of PB does not reflect the BM, which is the niche for HSPCs. Therefore, procedures providing access to the BM compartment are essential for studying hematopoiesis. IF injection and serial BM aspiration, as described here, allow for the prospective retrieval and characterization of cells enriched in the BM, such as HSPCs, without sacrificing the mice.

<meta charset="utf8"></head><body>살아있는 마우스를 사용한 간소화된 대퇴강 주사로 지속적인 골수 분석 가능

This protocol describes the intrafemoral injection of a few hematopoietic or leukemic stem cells, including gene-edited cells, in murine xenograft models, which will not only enable the quick and safe transplantation of cells but also serial analyses of the bone marrow.

살아있는 마우스를 사용한 간소화된 대퇴강 주사로 지속적인 골수 분석 가능

Despite the complexity of hematopoietic cell transplantation in humans, researchers commonly perform intravenous or intrafemoral (IF) injections in mice. ...

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

요약

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