This work was supported, in part, by NIAID, NIH, DHHS federal research grants R01 AI036525 and U19 AI082655 (CCHI) to MBS and by NIH grant DK048373 to AF. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institute of Allergy And Infectious Diseases or the National Institutes of Health.

윤리 문 : 모든 혈액 표본이 프로토콜 번호 HP-00040025-1에 참여한 자원 봉사자들로부터 수집 하였다. 메릴랜드 임상 시험 심사위원회의 대학은이 프로토콜을 승인하고이 원고에 포함 된 연구를위한 건강한 지원자에서 혈액 표본의 수집을 승인했다. 이 연구의 목적은 자원 봉사자들에게 설명하고, 모든 자원 봉사자는 정보를 준, 혈액 그리기 전에 동의를 체결했다. 주 : 매체 보충 준비를 위해 표 1을 참조하십시오. 3-D 배양 배지의 제조 표 2 참조. 문화 선박 1. 준비 <ol><li> 50 ML-용기의 충전 포트의 뚜껑을 풀고 무균 배지 50 ㎖ (예., RPMI)를 입력합니다. 층류 후드에서 무균 조건 하에서 모든 절차를 수행합니다. </li><li> 뚜껑을 교체하고 70 % 에탄올로 어떤 표면에 어떤 유출 매체를 닦아냅니다. </li><li> 선박이 incub 허용RT에서 O / N에 적어도 15 분 동안 먹었다. </li><li> 배양액을 버리고 3-D 배지 30 ㎖를 추가 충전 포트를 사용한다. </li><li> 70 % 에탄올로 어떤 표면에 어떤 유출 매체를 닦아주십시오. </li></ol> 세포의 제조 2 <ol><li> 인간 상피 세포주 (HCT-8) 24,40. <ol><li> RPMI에서 배양 세포를 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 50 μg의 / ml의 겐타 마이신, 2 mM L- 글루타민이, 1 mM 피루브산 나트륨, 10 mM의 HEPES는 (버퍼 및 10 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 FBS로 보충 ) (보충 1). 70 % 컨 플루 언시, 하나의 비율로 분할 셀 : 5이다. </li></ol></li><li> 인간 대장 섬유 아세포 (CCD-18Co 세포) 24,41. <ol><li> 보충 1 풍부 기저 이글 배지에서 배양 세포 포화 상태에서, 1의 비율로 분할 세포 :. 3. </li></ol></li><li> 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC) 셀 <suP&gt; 24,42. <ol><li> 내피 기저 중간 (EBM)에서 배양 세포를 배지 100 μg의 / ㎖ 헤파린, 3 μg의 / ml의 내피 세포 성장 보충 (심전도)가 풍부하고, 1을 보충 70 % 컨 플루 1의 비율로 분할 세포에서 :. 2. </li></ol></li><li> 림프구 / 단핵구 <ol><li> 표준 기술 (43)을 사용하여 밀도 구배 원심 분리에 의해 혈액으로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 분리. <ol><li> 간략하게, 10 ml의 피펫을 사용하여 조심스럽게 희석 혈액 30 ㎖를 추가 (1 : 1 혈액 : 인산 완충 식염수 (PBS)) 밀도 원심 분리 배지 10ml를 함유 한 50㎖ 원추형 튜브에. 원심 분리 단계 후, 림프구 및 단핵구는 밀도 원심 분리 매체와 플라즈마 층 사이의 &quot;화이트&quot;레이어에있는 것입니다. </li><li> 전송 피펫을 사용하여 백색 층을 수집합니다. 밀도 원심 분리 매체의 수집을 제한하여 과립구 오염을 방지. (43)를 세척 한 후, 유같은 자체 PBMC는 또는 액체 N 2 냉동 보관. 참고 : PBMC 크게 수지상 세포와 다른 세포 유형의 작은 비율로, 림프구 및 단핵구로 구성되어 있음을 강조하는 것이 중요하다. </li></ol></li></ol></li><li> 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 표준 배양 조건에서 모든 셀을 성장한다. </li></ol> 콜라겐 임베디드 세포의 3. 준비 <ol><li> 인서트의 개수를 결정하는 것은 실험 조건의 수에 기초하여 필요가 셋업된다. 6 잘 판의 우물에 삽입 적절한 수를 놓습니다. </li><li> HUVEC 및 섬유 아 세포의 현탁액을 준비합니다 : <ol><li> PBS 두 번 플라스크를 씻고 0.05 % 트립신 테트라 에틸렌 (트립신 - EDTA)와 트립신, 0.25 % (1 배)를 사용하여 세포를 분리. 세포 배양 면적의 전체를 커버하기에 충분한 트립신 용액을 첨가. 분리는 일반적으로 15 분에 5 내에서 발생 </li><li> 수집둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM) -30 % FBS 배지 30 ㎖를 함유하는 50 ㎖ 튜브에서 분리 된 세포. </li><li> 10 분 동안 500 XG에 튜브를 원심 분리기. </li><li> DMEM-30 % FBS 배지 30 ㎖로 세포를 재현 탁. </li><li> 트리 판 블루 염색 20 μL에 재현 탁 된 세포를 20 ㎕의 희석하여 생존 세포의 수를 계산. 세포 혼합물과 혈구를 넣습니다. 유력한 PBMC를 분명 흰색 될 것입니다; 생존 할 PBMC는 염료를 획득하고 파란색이 될 것입니다. <ol><li> 8 × 107 셀 ML - - (5)의 농도로 DMEM-30 % FBS 배지에서 각 세포 유형을 재현 탁 1. </li></ol></li></ol></li><li> 세포 함유 콜라겐 젤을 준비 참고 : 각 선박이 세포 함유 콜라겐 겔 ~ 5 ㎖의 준비가 필요합니다. <ol><li> 한 50㎖ 원추형 튜브를 50㎍ / ml의 겐타 마이신, 2 mM L- 글루타민 및 10 % 열 - inactivat 보충 한 X DMEM 배지를 첨가하여 콜라겐 혼합물을 제조에드 FBS 플러스 3 ㎎ / ㎖ 소 콜라겐 I, 10 μg의 / ㎖ 라미닌, 40 μg의 / ㎖ 콜라겐 IV, 10 μg의 / ㎖ 피브로넥틴, 2 μg의 / ㎖ 헤파린 황산 프로테오글리칸 15 mM의 수산화 나트륨 (생리적 산도에 도달하기 위해). </li><li> 상기 튜브를 닫고, 혼합물을 완전히 균질화 될 때까지 수회 반전시켜 혼합한다. 거품 형성을 피할 것. 중요 : 겔화를 방지하기 위해 얼음에 혼합 보관하십시오. <ol><li> 중요한 단계 : 혼합물을 산성 외관 (노란 색)을 전개하면, 혼합물을 중화 멸균 1 N NaOH를 몇 방울을 추가한다. </li></ol></li><li> 각각 농축 된 콜라겐 혼합물 (전술)에 2.0 × 106 세포 / ml - 1.2 1.5 - 1.0 밀도 농축 HUVEC 및 섬유 아세포를 추가한다. 튜브를 닫고, 혼합물을 완전히 균질화 될 때까지 수회 반전시켜 혼합한다. 거품 형성을 피할 것. 중요 : 겔화를 방지하기 위해 얼음에 혼합 보관하십시오. </li><li> 셀 함유 콜라겐의 5 ml의 - 4 추가각 삽입에 젤, 이전에 6 잘 플레이트에로드하고, 1 시간 동안 거의 또는 전혀 운동과 후드에서 겔화하는 것을 허용했다. </li><li> 2 개의 추가 시간 - 1 시간 후, 1 37 ° C, 5 % CO 2 배양기로 6 웰 플레이트를 전송할 수 있습니다. </li><li> 후드에 6 웰 플레이트를 반환하고, 멸균 집게의 도움으로 무균 차단 메스 막을 막에서 세포 함유 겔을 분리 삽입에서. 작은 사각형으로 분리 된 겔 (~ 5 × 5mm)를 잘라. </li><li> 충진 포트를 사용하여 50 mL의 HARV에 소세포 함유 사각형을 추가한다. </li></ol></li><li> HCT-8 상피 세포의 현탁액을 준비합니다 : <ol><li> PBS 두 번 플라스크를 세척하고 트​​립신 - EDTA 처리와 트립신, 0.25 % (1 배)를 사용하여 세포를 분리. 세포 배양 면적의 전체를 커버하기에 충분한 트립신 용액을 첨가. 분리는 일반적으로 10 ~ 15 분 이내에 발생합니다. </li><li> DMEM-30 % FBS 배지 30 ㎖에서 분리 세포를 수집. </li><li> Centrif10 분 동안 500 XG에 튜브를 함유 UGE DMEM-30 % FBS 배지. </li><li> DMEM-30 % FBS 배지 30 ㎖로 세포를 재현 탁. </li><li> 3.2.5에 기술 된 바와 같이 생존 세포의 총 수를 계산. </li><li> 10 7 세포 ml의 농도로 DMEM-30 % FBS 배지에서 HCT-8 상피 세포를 재현 탁 - 1. </li><li> 충진 포트를 사용하여 50 mL의 HARV로 농축 HCT-8 상피 세포에 1 ml의 추가. </li></ol></li><li> 선박이 거의 가득 찰 때까지 충진 포트를 사용하여 (~ 20 ml)에 추가로 3-D 배양 배지를 추가한다. </li><li> 뚜껑을 교체하고 70 % 에탄올로 충전 포트의 입술을 닦아냅니다. </li><li> RWV 각 주사기 포트 주사기 넣 장소 3 함유하는 5 ㎖ 주사기 - (4) 하나의 포트에서의 3-D 배양 배지 ㎖의 다른 포트에 5 ㎖ 빈 주사기. </li><li> 매체의 거의 같은 볼륨이 다른 주사기 포트를 통해 주입하는 동안 빈 주사기로 당겨 눈에 보이는 거품을 제거합니다. </li><li> VES 배치SELS 생물 반응기에서, 전원을 켜고 분당 약 13 ~ 14 회전에 속도를 설정합니다. 주 : 긴급 단계 : 회전 속도하여 혈관 벽과의 접촉을 피하고, 상기 용기 내에 선회 세포를 유지하기 위해 실험 중에 몇 번 조정될 필요가있다. </li><li> RWV 생물 반응기에서 제공하는 37 ° C, 미세 중력에서 5 % CO 2에서 배양 세포. </li><li> 새로운 3-D 배양 배지에 약 30 mL로 대체하여 4 일 - 매 3 변경 배지. </li><li> 사일 (± 1 일) 후, 생물 반응기에서 혈관을 제거하고 혈관 (× 10 7 / 용기 (2))에 림프구 / 단핵 세포를 추가합니다. </li><li> 추가 오일 (± 1 일), 37 ° C, 5 % CO 2에서 다시 생물 반응기의 용기를 놓습니다. </li><li> 추가 오일 (문화의 날 9) 한 후, 선박 (2 × 10 7 / 용기)에 림프구 / 단핵구를 추가하고 최대 12 개의 추가 일 동안 문화를 계속합니다. </l난&gt; <li> 새로운 3-D 배양 배지에 약 30 mL로 대체하여 4 일 - 매 3 변경 배지. </li></ol> 조직학 4. 수확은 3-D 문화 <ol><li> 10 % 포르말린 버퍼 10 ㎖를 포함하는 여섯 잘 플레이트로 전송 피펫 수확의 도움을 지금라는 각각의 작은 젤 조각, &quot;건설,&quot;와. 실온에서 3 시간 동안 떠나거나 12 - 4 ℃에서 16 시간. </li><li> 라벨링 각 카세트에 생검 폼 패드의 두 부분을 추가함으로써, 조직 처리 및 매립 카세트를 준비한다. </li><li> 10 % 포르말린 버퍼에 카세트를 담가. </li><li> 집게의 도움으로 두 폼 패드 사이의 고정 구조를 배치합니다. </li><li> 10 % 포르말린 버퍼에 카세트를 담가. </li><li> , 내장 절편, 44를 염색에 대한 표준 절차를 진행합니다. </li></ol>

The authors declare that a US Non-Provisional Patent Application has been filed in the U.S.Patent and Trademark Office (Number: 13/360,539).

이 논문에서는 일차 인간 림프구, 섬유 모세포, 및 내피 세포뿐만 아니라 소장 상피 세포주를 포함한 24 배수 종류의 세포로 구성된 인간 장 점막의 생체 공학 모델의 개발을 기술한다. 이 3-D 모델에서 세포는 미세 중력 상태 (24)에서 콜라겐이 풍부한 세포 외 기질 내에서 배양된다. 전술 한 바와 같이,이 모델의 주요 기능은 다음과 같다 : (i) 상피 ...

과학자들은 다른 골격 유형 (예., 라미닌, 콜라겐 타입 I 콜라겐 IV 및 피브로넥틴) 및 개선하는 성장 인자의 칵테일을 조사하기 시작했을 때, 3-D 모델을 구축하는 제 침투는 1980 년대 초에보고 세포 간 및 &quot;정적&quot;3-D 모델 1-7의 ECM 상호 작용. 그 이후로,이 모델의 주요 문제는 매체 및 조직 구조 (8) 내에서 영양소의 전송 및 산소 제한하고있다. 혈관의 네트워크 주변에서 일정한 영양분 및 산소의 흐름을 수용하는 생체 환경에서 세포와 대조적으로,이 모델의 정적 특성은 세포로의 효과적인 분산을 방해한다. 예를 들어, 크기가 몇 mm를 초과 체외 정적 모델에서 생성 된 세포 집합체는 변함없이 저산소, 괴사 코어 (9)을 개발할 것입니다. RWV 생물 반응기는이 문제를 피할 수 있습니다영양분과 산소 10-12의 효율적인 확산을 허용 유체 역학을 제공하여. 그러나, 지금까지 RWV 생물 반응기를 사용하여 작업이 하나 또는 두 종류의 세포 13-17의 포함에 한정되었다. 또한, 대신에 기본 조직과 동일한 공간 배향, 이러한 세포는 세포 응집체를 형성했다. 이러한 제한에 대한 가장 큰 이유는 통합 된 방식으로 세포를 통합 할 수있는 발판의 부족이었다. 현재까지 RWV의 생물 반응기에 사용되는 지지체는 주로 합성 마이크로 비즈, 관 실린더 또는 작은 시트 13-15,19-23의, 몇 가지 예외를 제외하고 16 ~ 18으로 구성되어 있습니다. 이러한 조성 및 유연성 조작 할 수없고, 어떤 셀이 그 표면에 부착 된 강성 물질이다. 따라서, 이러한 모델은 통합 된 방식으로 평가하기 위해서는 시스템을 제공 할 가능성은, 다양한 세포와 같은 간질 세포와 같은 구성 요소 (예., 섬유 아세포, 내피 세포 및 면역) 즉이야hould 밀접하게 인간의 조직을 모방하는 발판 내에 분산 될 수있다. 여기서 우리는 장 상피 세포주 및 일차 인간 림프구, 내피 세포로 구성된 인간 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발을 기술하고, 섬유 아세포 (24). 이 세포는 미세 중력 하에서 RWV 생물 반응기 13,25-30에 의해 제공 배양 하였다. 우리의 3-D 모델에서 ECM 많은 별개 이러한 배지 유사한 삼투압 (예., 배양 중에 무시할 확산 감금) 세포 및 다른 중요한 세포 외 기질 단백질을 포함하는 능력과 같은 특성뿐만 아니라, 같은 보유 적절한 강성 생물 반응기 (24)에 사용될 수있다. 생물학적 시스템은 매우 복잡하고, 지난 몇 년간, isolatio 그들을 공부보다는 주변 환경과 세포의 상호 작용의 시험 향해 점막 연구의 초점의 변화가 있었다엔. 특히, 장 세포 생존 및 분화에 영향을 미치는 세포 - 세포 상호 작용의 중요성을 잘 31-34를 설명되어 있습니다. 구체적으로는, 상피 세포 및 그들의 틈새 사이의 통신은 상피 세포의 확장 및 분화 (35)에 큰 영향을 미친다. 실제로, 널리 사용되는 전용 세포 간뿐만 아니라, 세포 간 상호 작용 ECM 3-D 배양 모델에서 상피 세포의 유지와 분화에 중요하다. 이전의 연구는 콜라겐 I 24,36,37, 라미닌 (38) 및 피브로넥틴 (39)는 원래 점막과 유사한 공간 방향을 취득 장내 상피 세포에 영향을 미치는 수단이되기 때문에 그 직감 ECM 단백질을 증명하고있다. 연구자들은 복잡한 세포 및 구조 아키텍처를 다시하려는 경우 따라서, 새로운 기술의 개발은 우리의 3-D 모델 (24)처럼, 그 창자의 표현형의 다양성이 요구되는 모방 할 수그리고 장내 미세 환경의 기능. 이러한 모델은 새로운 경구 용 약물과 백신 후보들의 평가 및 개발에 중요한 수단을 나타낸다.

<table><tbody><tr><td>Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor&amp;nbsp;</td><td>Synthecon</td><td>RCCs-4DQ</td><td>For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available.</td></tr><tr><td>Disposable 50 ml-vessel</td><td>Synthecon</td><td>D-405</td><td>Box with 4 vessels</td></tr><tr><td>HCT-8 epithelial cells&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-244</td><td></td></tr><tr><td>CCD-18Co Fibroblasts&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1459</td><td></td></tr><tr><td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1730</td><td>HUVEC</td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor-Basic&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>bFGF</td></tr><tr><td>Stem Cell Factor&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7901</td><td>SCF</td></tr><tr><td>Hepatocyte Growth Factor&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H1404</td><td>HGF</td></tr><tr><td>Endothelin 3</td><td>Sigma</td><td>E9137</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td>Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor</td></tr><tr><td>Vascular Endothelial Growth Factor&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>V7259</td><td>VEGF</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-4377</td><td>(LIF</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A2786</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>3,3&#039;,5-triiodo-L-thyronine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T-6397</td><td>T3</td></tr><tr><td>Cholera Toxin</td><td>Sigma</td><td>C-8052</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>BD</td><td>354008</td><td>Isolated from human plasma</td></tr><tr><td>apo-Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T-1147</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Heparan sulfate&amp;nbsp; proteoglycan</td><td>Sigma</td><td>H4777</td><td>Isolated from basement membrane of mouse&amp;nbsp; Engelbreth-Holm-Swarm tumor</td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>Isolated from human placenta</td></tr><tr><td>Heat-inactivated fetal bovine serum&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM, powder</td><td>Invitrogen</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>10% formalin&amp;ndash;PBS&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>Bovine type I collagen&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Invitrogen</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomincin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Ham&#039;s F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>Basal Medium Eagle</td><td>Invitrogen</td><td>21010-046</td><td>BME</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Basal Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td>EBM-2</td></tr><tr><td>Endothelial cell growth supplement</td><td>Millipore</td><td>02-102</td><td>ECGS</td></tr></tbody></table>

development of a multicellular three-dimensional organotypic model of the human intestinal mucosa grown under microgravity

3 차원 (3-D) 환경에서 성장하는 세포는 다수의 2 차원 환경에서 세포 배양 간격 (예., 플라스크 또는 요리)을 해소 할 가능성이 있기 때문이다. 사실, 널리 접시 또는 플라스크에서 배양 세포 분화 디 그들이 유래 된 조​​직에서의 특화된 기능을 상실하는 경향이 인정된다. (a) 정적 모델 생물을 이용하여 (b) 모델 : 현재 원시 세포 외 기질 (ECM)을 흉내 낸 세포를 지지체로 시딩 3-D 배양 시스템의 두 종류가 주로 존재한다. 제 획기적인 정적 3-D 모델이었다. 이러한 회전 벽 혈관 등의 생물을 이용하여 3-D 모델 (RWV) 생물 반응기는 더 최근의 개발이다. RWV 생물 반응기의 원래 개념은 1990 년대 초에 NASA의 존슨 우주 센터에서 개발 및 저산소, 괴사 코어의 개발로 정적 모델의 한계를 극복 할 것으로 생각된다. RWV의 생물 반응기는 일을 피할 수 있습니다영양분과 산소의 효율적인 확산을 허용 유체 역학을 제공하여 문제가된다. 이 생물 반응 장치 지원 및 폭기 소스 유형에 따라 다릅니다 문화 선박의 두 가지 형식을 회전시키는 역할을 회 전자의 기본 구성 : 공동 축 중앙에 형산, 또는 (1) 느린 켜기 측면 용기 (STLVs) (2 평평한 실리콘 고무 가스 이송 멤브레인을 통해 산소와) 높은 화면 비율 용기 (HARVs). 거품 형성과 그에 따른 혼란을 피하면서이 선박은 효율적인 가스 전송을 할 수 있습니다. 이러한 조건은 모델 배양 용기 중의 중력 (무중력)를 감소 층류 최소 전단력 초래한다. 여기서 우리는 RWV 바이오 리액터에 의해 제공된 소장 상피 세포주 및 일차 인간 림프구 무중력 하에서 배양 된 내피 세포 및 섬유 아세포 이루어지는 인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발을 기술한다. &lt;/ P&gt;

<html> 이전에, 우리는 장 상피 세포주 및 일차 인간 림프구 무중력 상태 (24) (도 1)에서 배양 내피 세포 및 섬유 아세포 이루어진 인간 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델을 설계했다. 섬유 아 세포와 내피 세포는 내가 추가 장내 지하 막 단백질 45 (예., 라미닌, 콜라겐 IV, 피브로넥틴 및 헤파린 황산 프로테오글리칸) 풍부 행렬 콜라겐...

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Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

3 차원 (3-D) 환경에서 성장하는 세포는 2-D 환경 (예 : 플라스크 또는 종) 세포 배양에 비해 현저한 개선을 나타낸다. 여기에서 우리는 회전 벽 혈관 (RWV) 생물 반응기에서 제공하는 미세 중력에서 배양 인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발을 설명합니다.

인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발은 미세 중력 하에서 성장

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.8K 조회수.  University of Maryland School of Medicine.  3 차원 (3-D) 환경에서 성장하는 세포는 2-D 환경 (예 : 플라스크 또는 종) 세포 배양에 비해 현저한 개선을 나타낸다. 여기에서 우리는 회전 벽 혈관 (RWV) 생물 반응기에서 제공하는 미세 중력에서 배양 인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발을 설명합니다. 

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Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to preoperative weights within 40 days.1 In humans, massive small bowel resection can result in short bowel syndrome, a functional malabsorptive state that confers significant morbidity, mortality, and healthcare costs including parenteral nutrition dependence, liver failure and cirrhosis, and the need for multivisceral organ transplantation.2 In this paper, we describe and document our protocol for creating tissue-engineered intestine in a mouse model with a multicellular organoid units-on-scaffold approach. Organoid units are multicellular aggregates derived from the intestine that contain both mucosal and mesenchymal elements,3 the relationship between which preserves the intestinal stem cell niche.4 In ongoing and future research, the transition of our technique into the mouse will allow for investigation of the processes involved during TESI formation by utilizing the transgenic tools available in this species.5The availability of immunocompromised mouse strains will also permit us to apply the technique to human intestinal tissue and optimize the formation of human TESI as a mouse xenograft before its transition into humans. Our method employs good manufacturing practice (GMP) reagents and materials that have already been approved for use in human patients, and therefore offers a significant advantage over approaches that rely upon decellularized animal tissues. The ultimate goal of this method is its translation to humans as a regenerative medicine therapeutic strategy for short bowel syndrome.

This article and the accompanying video present our protocol for generating tissue-engineered intestine in the mouse, using an organoid units-on-scaffold approach.

손쥐 모델에서 창자의 조직 공학

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

연구

생체공학

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of the crypt region. IESCs include active stem cells, which self-renew and differentiate into various epithelial cell types, and quiescent stem cells, which serve as the reserve stem cells in the case of injury. Regeneration of the intestinal epithelium is controlled by the self-renewing and differentiating capabilities of these active IESCs. In addition, the balance of the crypt stem cell population and maintenance of the stem cell niche are essential for intestinal regeneration. Organoid culture is an important and attractive approach to studying proteins, signaling molecules, and environmental cues that regulate stem cell survival and functions. This model is less expensive, less time-consuming, and more manipulatable than animal models. Organoids also mimic the tissue microenvironment, providing in vivo relevance. The present protocol describes the isolation of colonic crypts, embedding these isolated crypt cells into a three-dimensional gel matrix system and culturing crypt cells to form colonic organoids capable of self-organization, proliferation, self-renewal, and differentiation. This model allows one to manipulate the environment-knocking out specific proteins such as claudin-7, activating/deactivating signaling pathways, etc.-to study how these effects influence the functioning of colonic stem cells. Specifically, the role of tight junction protein claudin-7 in colonic stem cell function was examined. Claudin-7 is vital for maintaining intestinal homeostasis and barrier function and integrity. Knockout of claudin-7 in mice induces an inflammatory bowel disease-like phenotype exhibiting intestinal inflammation, epithelial hyperplasia, weight loss, mucosal ulcerations, epithelial cell sloughing, and adenomas. Previously, it was reported that claudin-7 is required for intestinal epithelial stem cell functions in the small intestine. In this protocol, a colonic organoid culture system is established to study the role of claudin-7 in the large intestine.

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The present protocol describes establishing a murine colonic organoid system to study the activity and functioning of colonic stem cells in a claudin-7 knockout model.

생체 외 장내 줄기세포 기능을 연구하기 위한 쥐 결장 음와의 3차원 배양

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

암 연구학

Innervation of Human Intestinal Organoids

The complexity of intestinal cytoarchitecture and function poses significant challenges for the creation of the bioengineered small intestine. Techniques for generating human intestinal organoids (HIOs) resembling human small intestine have been previously reported. HIOs contain epithelium and mesenchyme but lack other critical components of functional intestine such as the enteric nervous system (ENS), immune cells, vasculature, and microbiome. Two independent research groups have published distinct methods to innervate HIOs with an ENS. Here we discuss a unique method of incorporating the ENS into an HIO-derived bioengineered small intestine, which utilizes components of these prior reports to optimize progenitor cell identity as well as developmental timing.
Human pluripotent stem cells (hPSCs) are differentiated to independently generate HIOs and enteric neural crest cells (ENCCs) by temporal regulation of differentiation markers over a period of several days per published protocols. Once HIOs reach the mid-hindgut spheroid stage (approximately day 8), day 15-21 ENCC spheroids are dissociated, co-cultured with HIOs, and suspended within clear three-dimensional (3D) basement membrane matrix droplets. HIO + ENCC co-cultures are maintained in vitro for 28-40 days before transplantation into &#62;9-week-old immunodeficient mice for further development and maturation. Transplanted HIOs (tHIOs) with ENS can be harvested 4-20 weeks later. This method integrates elements from two previously published techniques by utilizing ENCCs generated from hPSCs and co-culturing them with HIOs at an early stage of development to maximize exposure to early developmental cues that likely contribute to the formation of a more mature intestinal morphology.

Human intestinal organoids must be innervated to better recapitulate the structure and function of the native human intestine. Here, we present one method for incorporating an enteric nervous system into these constructs.

인간 장내 오가노이드(Intestinal Organoids)의 신경 분포(Nervation of Human Intestinal Organoids)

The complexity of intestinal cytoarchitecture and function poses significant challenges for the creation of the bioengineered small intestine. Techniques ...

발생학

Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, and metabolism of nutrients and xenobiotics while facilitating a symbiotic relationship with microbiota and restricting the invasion of microorganisms. Functional interaction between various cell types and their physical and biochemical environment is vital to establish and maintain intestinal tissue homeostasis. Modeling these complex interactions and integrated intestinal physiology in vitro is a formidable goal with the potential to transform the way new therapeutic targets and drug candidates are discovered and developed.
Organoids and Organ-on-a-Chip technologies have recently been combined to generate human-relevant intestine chips suitable for studying the functional aspects of intestinal physiology and pathophysiology in vitro. Organoids derived from the biopsies of the small (duodenum) and large intestine are seeded into the top compartment of an organ chip and then successfully expand&#160;as monolayers while preserving the distinct cellular, molecular, and functional features of each intestinal region. Human intestine tissue-specific microvascular endothelial cells are incorporated in the bottom compartment of the organ chip to recreate the epithelial-endothelial interface. This novel platform facilitates luminal exposure to nutrients, drugs, and microorganisms, enabling studies of intestinal transport, permeability, and host-microbe interactions.
Here, a detailed protocol is provided for the establishment of intestine chips representing the human duodenum (duodenum chip) and colon (colon chip), and their subsequent culture under continuous flow and peristalsis-like deformations. We demonstrate methods for assessing drug metabolism and CYP3A4 induction in duodenum chip using prototypical inducers and substrates. Lastly, we provide a step-by-step procedure&#160;for the in vitro modeling of interferon gamma (IFN&#947;)-mediated barrier disruption (leaky gut syndrome) in a colon chip, including methods for evaluating the alteration of paracellular permeability, changes in cytokine secretion, and transcriptomic profiling of the cells within the chip.

Biopsy-derived intestinal organoids and organ-on-a-chips technologies are combined into a microphysiological platform to recapitulate region-specific intestinal functionality.

인간 오가노이드와 장기 온 칩 기술을 결합하여 장 영역별 기능 모델링

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

에 대한 마우스 태아의 전체 소장 문화 시스템<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 신호 전달 경로와 융모 개발의 3 차원 라이브 영상의 조작

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

생물학

Canine IBD Gut-on-a-Chip 시스템에서 3D 형태 형성 확립

Three-Dimensional Morphogenesis in Canine Gut-on-a-Chip Using Intestinal Organoids Derived from Inflammatory Bowel Disease Patients

Canine intestines possess similarities in anatomy, microbiology, and physiology to those of humans, and dogs naturally develop spontaneous intestinal disorders similar to humans. Overcoming the inherent limitation of three-dimensional (3D) organoids in accessing the apical surface of the intestinal epithelium has led to the generation of two-dimensional (2D) monolayer cultures, which expose the accessible luminal surface using cells derived from the organoids. The integration of these organoids and organoid-derived monolayer cultures into a microfluidic Gut-on-a-Chip system has further evolved the technology, allowing for the development of more physiologically relevant dynamic in vitro intestinal models.
In this study, we present a protocol for generating 3D morphogenesis of canine intestinal epithelium using primary intestinal tissue samples obtained from dogs affected by inflammatory bowel disease (IBD). We also outline a protocol for generating and maintaining 2D monolayer cultures and intestine-on-a-chip systems using cells derived from the 3D intestinal organoids. The protocols presented in this study serve as a foundational framework for establishing a microfluidic Gut-on-a-Chip system specifically designed for canines. By laying the groundwork for this innovative approach, we aim to expand the application of these techniques in biomedical and translational research, aligning with the principles of the One Health Initiative. By utilizing this approach, we can develop more physiologically relevant dynamic in vitro models for studying intestinal physiology in both dogs and humans. This has significant implications for biomedical and pharmaceutical applications, as it can aid in the development of more effective treatments for intestinal diseases in both species.

저자 스포트라이트: 3D 장 형태 형성 연구를 위한 개 IBD Gut-on-a-Chip 모델의 개발 및 적용 

Integration of canine intestinal organoids and a Gut-on-a-Chip microfluidic system offers relevant translational models for human intestinal diseases. Protocols presented allow for 3D morphogenesis and dynamic in vitro modeling of the gut, aiding in the development of effective treatments for intestinal diseases in dogs and humans with One Health.

염증성 장 질환 환자에서 유래한 장 오가노이드를 사용한 개 장내 칩의 3차원 형태 형성

Canine intestines possess similarities in anatomy, microbiology, and physiology to those of humans, and dogs naturally develop spontaneous intestinal ...

의학

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is compartmentalized into crypts and villi: the stem and proliferating cells are confined to the crypts, whereas the villi epithelium contains only differentiated cells. Hence, the normal intestinal crypts, but not the villi, can give rise to organoids in 3D cultures. The procedure described here is applicable only to villus epithelium undergoing dedifferentiation leading to stemness. The method described uses the Smad4-loss-of-function:&#946;-catenin gain-of-function (Smad4KO:&#946;-cateninGOF) conditional mutant mouse. The mutation causes the intestinal villi to dedifferentiate and generate stem cells in the villi. Intestinal villi undergoing dedifferentiation are scraped off the intestine using glass slides, placed in a 70 &#181;m strainer and washed several times to filter out any loose cells or crypts prior to plating in BME-R1 matrix to determine their organoid-forming potential. Two main criteria were used to ensure that the resulting organoids were developed from the dedifferentiating villus compartment and not from the crypts: 1) microscopically evaluating&#160;the isolated villi to ensure absence of any tethered crypts, both before and after plating in the 3D matrix, and 2) monitoring the time course of organoid development from the villi. Organoid initiation from the villi occurs only two to five days after plating and appears irregularly shaped, whereas the crypt-derived organoids from the same intestinal epithelium are apparent within sixteen hours of plating and appear spherical. The limitation of the method, however, is that the number of organoids formed, and the time required for organoid initiation from the villi vary depending on the degree of dedifferentiation. Hence, depending upon the specificity of the mutation or the insult causing the dedifferentiation, the optimal stage at which villi can be harvested to assay their organoid forming potential, must be determined empirically.

The procedure describes isolation of the villi from the mouse intestinal epithelium undergoing dedifferentiation to determine their organoid forming potential.

장내 빌리 상피에서 오르가노이드의 3D 배양

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Murine Intestinal Crypts 및 Single Stem Cell의 오가노이드 3D 배양

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine small intestinal crypts can form organoids that mimic the intestinal epithelium when cultured in a 3D extracellular matrix. The organoids are composed of all cell types that fulfill various intestinal homeostatic functions. These include Paneth cells, enteroendocrine cells, enterocytes, goblet cells, and tuft cells. Well-characterized molecules are added into the culture medium to enrich the intestinal stem cells (ISCs) labeled with leucine-rich repeats containing G protein-coupled receptor 5 and are used to drive differentiation down specific lineages; these molecules include epidermal growth factor, Noggin (a bone morphogenetic protein), and R-spondin 1. Additionally, a protocol to generate organoids from a single erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2 (EphB2)-positive ISC is also detailed. In this methods article, techniques to isolate small intestinal crypts and a single ISC from tissues and ensure the efficient establishment of organoids are described.

저자 스포트라이트: The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (오가노이드 연구를 위한 쥐 장낭화낭수에서 오가노이드의 3D 배양 및 단일 줄기 세포)  

We describe a protocol to isolate murine small intestinal crypts and culture intestinal 3D organoids from the crypts. Additionally, we describe a method to generate organoids from a single intestinal stem cell in the absence of a sub-epithelial cellular niche.

쥐 장 선와에서 오가노이드와 오가노이드 연구를 위한 단일 줄기 세포의 3D 배양

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발은 미세 중력 하에서 성장

요약

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손쥐 모델에서 창자의 조직 공학

생체 외 장내 줄기세포 기능을 연구하기 위한 쥐 결장 음와의 3차원 배양

인간 장내 오가노이드(Intestinal Organoids)의 신경 분포(Nervation of Human Intestinal Organoids)

인간 오가노이드와 장기 온 칩 기술을 결합하여 장 영역별 기능 모델링

에 대한 마우스 태아의 전체 소장 문화 시스템

염증성 장 질환 환자에서 유래한 장 오가노이드를 사용한 개 장내 칩의 3차원 형태 형성

염증성 장 질환 환자에서 유래한 장 오가노이드를 사용한 개 장내 칩의 3차원 형태 형성

염증성 장 질환 환자에서 유래한 장 오가노이드를 사용한 개 장내 칩의 3차원 형태 형성

장내 빌리 상피에서 오르가노이드의 3D 배양

쥐 장 선와에서 오가노이드와 오가노이드 연구를 위한 단일 줄기 세포의 3D 배양