이 작품은 NHMRC와 스탠 폭스 의료 재단 보조금에 의해 지원되었다. 저자는 고소 맥케이, 릴리 아나 페페, 안나 Deftereos 및 실험 의학의 아만다 Rixon 외과 단위, 성 빈센트 병원, 멜버른의 수술 지원을 인정합니다. 지원은 혁신, 산업의 빅​​토리아 주 정부의 부서 및 지역 개발의 운영 인프라 지원 프로그램에 의해 제공됩니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 세인트 빈센트 병원 멜버른, 호주의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었으며, 호주 국립 보건 의료 연구위원회 가이드 라인을 엄격하게 준수에 따라 실시 하였다. 참고 : 두 개의 챔버 프로토콜이 아래에 설명되어 있습니다. 두 가지 모델과 특정 실 디자인은도 1에 도시된다. 챔버 (1) (래트 동정맥 루프 챔버 모델) 폴리 카보네이트로 제조된다. 그것은 내부 직경 13mm, 높이 4mm 원통형이다. 벽에 한 지점에서의 창은 척추 경에 대한 방해받지 않고 액세스 할 수 있습니다. (쥐 관류 척추 경 챔버 모델) 제 모델에서, 챔버는 폴리 이루어지고, (10 × 8 × 4mm 3 내부 치수) 사각형이다. 그들이 챔버 범으로 대퇴 동맥 및 정맥을 수용하기 위해 양측에 두 개의 1.5 mm의 개구부를 갖는다. 1. 쥐 동정맥 루프 회의소 모델 (한 참BER 당 동물) 참고 : 수술을 시작하기 전에, 모든 악기가 제대로 살균되어 있는지 확인합니다. 마찬가지로, 멸균 수건 악기 받침대를 확인하고 절차를 수행하는 동안 오염을 방지하기 위해 수술 분야에서 적당한 거리에있다. <ol><li> 수술에 대한 동물의 준비 <ol><li> 동정맥 루프의 창조를위한 선박의 그들의 큰 크기에 최소 250g의 무게 쥐를 사용합니다. </li><li> 4 % 이소 플루 란 흡입과 동물을 마취. 발가락 핀치에 응답하지 않는 문제를 평가하여 마취의 적절한 깊이를 확증. 마취 후, 충분히 2 % 이소 플루 란과 절차 전반에 걸쳐 마취 동물을 유지합니다. </li><li> 온난화 패드에 부정사 위치에 동물을 배치하고 수술 중 탈수를 방지하기 위해 눈에 멸균 윤활제를 적용합니다. </li><li> 전기 면도기를 사용하여, 두 사타구니 면도 촉촉한 거즈 조각으로 머리를 제거합니다. </li><li> 클로르헥시딘과 수술 사이트를 준비/ 70 % 에탄올 용액 및 멸균 수건 동물 드레이프. 진통제로 카프로 펜의 단일 용량 (5 ㎎ / ㎏, 피하)를 관리 할 수​​ 있습니다. </li></ol></li><li> 대퇴 정맥 이식의 수확 <ol><li> A # (15) 블레이드를 사용하여, 사타구니 인대에 왼쪽 사타구니 평행에 4cm 길이의 피부 절개를합니다. 이 사타구니 지방 패드를 노출합니다. </li><li> 가위는 상복부의 선박에 따라 혈관 척추 경에 부착 떠나와 원주 지방 패드를 통해 절단. </li><li> 마이크로 가위를 사용하여 복벽 및 하부 대퇴 혈관의 필름 상 결합 조직 유착 해방. </li><li> 복부 벽에 트랙터를 놓고 내측 당깁니다. 이 사타구니 인대와 대퇴 혈관의 전체 길이를 노출합니다. </li><li> 마이크로 집게를 사용하여 곡선 가위 부드럽게 당겨 및 절단하여 상복부 정맥을 해부와 그 주변 지방에서 격리. 루프를 구성 할 때이 정맥은 밧줄 역할을합니다. </li><li> 날기g 마이크로 집게 곡선 마이크로 가위는 대퇴 혈관과 신경 상복부 분기에 그 분기의 말단에 사타구니 인대에서 모든 방법을 포함하는 혈관 주위 덮개를 엽니 다. </li><li> 마이크로 집게를 사용하여 외막에 의해 대퇴 정맥을 선택하고 조심스럽게 주위 조직에서 분리하고 동맥을 동반. 마이크로 집게와 떨어져 조직을 당겨 그것을 통해 절단에 의해 곡선 라운드 지적 마이크로 가위로이 작업을 수행합니다. 참고 :이 혈전증에이 경향이 만드는 내막에 외상이 발생할 수 있습니다 정맥 벽의 전체 두께를 잡아하지 마십시오. </li><li> 결찰 측 분기 10/0 나일론 봉합사와 절개 중에 발견 또는 바이폴라 coagulator로 응고. </li><li> 대퇴 정맥 완전 무료로, 4/0 실크 봉합사와의 근위 및 원위 끝을 결찰. 적어도 10mm 길이의 정맥 이식을 얻을 수 있는지 확인하고 약 상복부 분기의 0.5 cm 길이가 남자 로프 밧줄로 사용할 수 포함챔버의 개방 루프를 개최합니다. </li><li> 마이크로 집게 똑바로 마이크로 가위를 사용하여 부드럽게 당겨 절단하여 이식의 끝에서 외막 트림. 이것은 또한 미세 수술 문합 전에 나중에 수행 될 수있다. </li><li> 헤파린 생리 식염수 (헤파린의 10 U / ㎖)와 정맥 이식을 세척하고, 용액에서 휴식을 둡니다. 지속적인 실행을 4/0 실크 봉합사 플러스 두 개 또는 세 개의 추가 간단한 중단 바늘을 사용하여 상처를 닫습니다. </li></ol></li><li> 상공 회의소의 동정맥 루프 및 주입의 창조 <ol><li> 반복 반대쪽 다리에 동일한 방식으로 1.2.4에 1.2.1 단계를 반복합니다. </li><li> 마이크로 집게를 사용하여, 해부 및 상복부 동맥을 모두 분리하고 주변의 지방 패드를 형성 정 맥. 부드럽게 혈관에서 떨어져 조직을 당겨이 작업을 수행 </li><li> 마이크로 집게를 사용하여 주변 조직에서 대퇴의 외막에 의해 동맥과 무료 픽업. 마이크로 집게 및 곡선 라운드 지적 마이크와 함께이 작업을 수행떨어져 조직을 당겨 그것을 통해 절단에 의해 RO 위입니다. 결찰 또는 옆으로 가지를 응고. </li><li> 대퇴부 동맥을 결찰 및 4/0 실크 봉합사를 이용하여 상복부 혈관의 출현 말초 정맥. </li><li> 대퇴 동맥과 정맥의 각 근위 하나의 클램프를 놓습니다. 날카로운 직선 마이크로 가위를 사용하여, 상복부 가지의 출현에 각 혈관 원위부 절단 깨끗한 가로을합니다. 선박에서 멸균 플라스틱 대비 배경을 놓습니다. </li><li> 모든 혈액이 루멘에서 제거 될 때까지 헤파린 생리 식염수의 관대 한 양 적극적으로 혈관을 플래시합니다. </li><li> 수술 필드에 정맥 이식을 가져와 필요한 경우, 단계 1.2.10에 따라 선박 &#39;끝에서 어떤 여분의 외막을 제거합니다. </li><li> 10/0 나일론 봉합사와 두 미세 수술 문합을 수행합니다. 대퇴 정맥과 대퇴 동맥에 선단 정맥 이식편의 기단부를 문합. 이 F 피가 흐를 수 있습니다정맥 이식 내 밸브에서 저항없이 정맥 측에 동맥을 ROM. 참고 : 어떤 왜곡없이 대퇴 혈관과 자연 위치에있는 정맥 이식의 나머지 부분을 확인합니다. </li><li> 문합 부위 모두에서 누수가 있는지 확인합니다. , 상단에 지방의 작은 조각을 배치하고 부드럽게 5 ~ 10 분 동안 압축하여 혈액이 문합 부위에서 나오는 비 맥동​​처럼 작은 누수를 해결합니다. 빠르게 전체 필드 홍수 큰 맥동 누수 추가 바늘이 필요합니다. </li><li> 동정맥 루프의 개통을 확인합니다. 대퇴 동맥의 부드러운 폐색은 대퇴 정맥에서 같은 그것을 충혈해야하면서 축소해야한다. </li><li> 왜곡 또는 꼬임이없는 자연 위치에 후자의 휴식과 동정맥 루프 아래의 조직 공학 챔버의 기초를 놓으십시오. </li><li> 6/0 나일론 봉합사와 사타구니 인대 및 기본 근육의 근막에 챔버의베이스를 고정합니다. </li><li> 오버 덮개를 놓습니다기본 대퇴 혈관 (챔버의 측면에 창) 노치 (notch)를 통해 챔버를 입력 있도록. 뚜껑을 닫을 때, 테더가 위치로 동정맥 루프를 유지하는 역할을 챔버 기지와 뚜껑 사이 상복부 지점을 포착해야합니다. </li><li> 지속적인 실행을 4/0 실크 봉합사 플러스 두 개 또는 세 개의 추가 간단한 중단 바늘을 사용하여 상처를 닫습니다. </li><li> 동물이 온난 패드에 마취에서 회복 할 수 있습니다. </li><li> 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 마찬가지로, 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다. 24 시간 후, 진통제 등의 카프로 펜의 또 다른 하나의 용량 (5 ㎎ / ㎏, 피하)를 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 5 일간 국소 항생제 연고와 상처 치료. 상처가 개방되는 경우, 단계별 1.1.5 1.1.2 에서처럼 동물을 마취 및 1.3과 상처습니다0.14. 매일 동물의 상태를 모니터링합니다. 동물 inacitivity, 식욕 부진, 체중 감소 및 색의 손실 이상의 적당한 흔적이있는 경우 (23 G 바늘 0.25 ㎖에 163 ㎎ / ㎏)을 복강 lethabarb 분사의 치사량을 사용하여 동물을 안락사. </li></ol></li></ol> 2. 플로우를 통해 척추 경 회의소 (동물 당 2 개의 챔버) <ol><li> 수술에 대한 동물의 준비 <ol><li> 반복 1.1.4을 통해 1.1.1 단계를 반복합니다. 두 개의 챔버는 단일 래트 모두 서혜부 영역에 주입 할 수있다. </li></ol></li><li> 대퇴 선박의 분리 및 상공 회의소의 삽입 <ol><li> 반복 1.2.8을 통해 1.2.1 단계를 반복합니다. </li><li> 동맥 완전히 조직을 둘러싼 및 분기 결찰의 해제 정맥 모두, 수술 필드에 실을 가지고. </li><li> 챔버베이스가 더 왜곡 또는 꼬임이 없는지 확인하고의 대응하는 슬릿에 그대로 대퇴 혈관의 각 놓습니다. </li><li> attachi에 의해 챔버를 닫습니다베이스에 뚜껑을 ng를. 지속적인 실행을 4/0 실크 봉합사 플러스 두 개 또는 세 개의 추가 간단한 중단 바늘을 사용하여 상처를 닫고 동물이 앞서 설명한 복구 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 챔버 및 조직 처리 3. 수확 <ol><li> 실험의 시점 (4~6주 후 주입)에 도달하면, 단계 1.1.2에서와 같이 동물을 마취와 1.1.5 단계를 1.1.3를 반복합니다. </li><li> A # 15 블레이드를 사용하여 상처를 열고 챔버가 완전히 노출 될 때까지 가위로 조직을 잘라. </li><li> 다음 원위 방향으로 피를 우유, 부드럽게 두 microforceps과 용기를 폐색 마지막 근위 집게를 해제 : 혈관 개통의 구조 및 시험에 근위 대퇴 혈관을 노출. 선박이 다시 혈액으로 채워지면,이 개통을 확인합니다. 일 경우에 모두 근위 및 원위 동정맥 루프의 경우 근위 대퇴부 혈관을 결찰전자의 흐름을 통해 구성 및 블록 엉 포함하는 조직으로 챔버를 제거합니다. </li><li> 실험의 끝에서, (23 G 바늘 0.25 ㎖ 중의 163 ㎎ / ㎏)을 복강 내 주사 lethobarb의 치사량을 사용하여 동물을 안락사. </li><li> 24 시간, 실온에서 4 % 파라 포름 알데히드에서 조직을 고정한다. (1-2 mm 두께) 각각 파라핀 왁스 또는 최적의 절단 온도 화합물 파라핀 섹션 (5 μm의) 또는 동결 절편 (10 μm의)에 포함 된 여러 가로 섹션으로 나눈다 조직. 3,4,8,17,22, (24) </li><li> 조직의 일반적인 형태를 조사하는 등의 헤 마톡 실린 및 에오신으로 일상적인 조직 학적 염색을 수행합니다. 심근 예를 들어 심장 트로포 닌 T의 면역 염색에 대한 관심의 세포 유형, 3,4,8,17,22,24,29을 식별하기 위해 특정 항체와 면역 조직 화학 염색을 수행합니다. </li></ol>

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<li>Lesman, A., Koffler, J., Atlas, R., Blinder, Y. J., Kam, Z., Levenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vessel-like+networks+within+multicellular+fibrin-based+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs.</a> Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).</li>
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<li>Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+keratinocytes+by+simple+transfection+of+episomal+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors.</a> Stem Cells Transl Med. 3 (7), 787-791 (2014).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 이익을 선언합니다.

미세 순환 공학은 현재 두 가지 방법을 통해 본질적으로 조사되고있다. 주입 된 때 상기 제 1 호스트 혈관 층에서 모세관의 것과 연결 체외 구조물 내의 높은 상호 혈관 네트워크 개발을 포함 이와 영양분의 전달을 보장하는 처리라고 inosculation 통해 구축 이식뿐만 아니라 주변뿐만 또한 핵심. 21,32,33에이 사전 혈관라고합니다. 그 모세관 발아 전 또는 병용 이식 세포 분화 및 조직 성...

재생 의학의 새로운 패러다임은 조직 공학 방법을 사용하여 기능 혈관 조직입니다 제조. 1,2 많은 방법을 손상된 조직이나 결함이있는 장기의 교체를 위해 새롭고 건강한 조직을 설계하는 것은, 3-6 실험적으로 작은 동물 모델을 개발되었다 유망한 임상 잠재력. 7,8 그러나, 혈관이 임상 적 크기의 조직을 성장 잠재력을 제한하는 조직 공학에 대한 큰 과제 중 하나 남아있다. (9) 현재 접근 방식은 새로운 혈관이받는 혈관 침대에서 성장 곳 외인성 경로를 따라 조직을 vascularize와 이식 된 조직이 10 혈관이 성장하고 새로 개발 조직과 한마음으로 확장 고유 혈관 통로를 구축을 통해 침입합니다. (11)를 외부 접근 전통적으로 지지체 상에 파종 세포를 포함시험관과 영양분은 이전 배지에 의해 공급되는 기대와 살아있는 동물에 완전한 구조를 주입에 혈관 내 증식이 너무 느리고 매우 얇은 임플란트 (AS 12,13 개념은 단순하다. 순환로부터 공급 &lt;될 1-2mm 두께는) 가능한 유지됩니다. 충분한 신속한 혈관을 통해 영양분과 산소를 제공하는 것은 뼈, 근육, 지방, 고체 기관으로 더 복잡하고 더 큰 조직 공학적 대체를 성장하는 성공적인 시도의 핵심입니다. 14, 15 내장 혈관이의 가능성을 제공합니다 더 큰 구조는 확대 혈액 공급에 상응하는 진보적 조직 성장에 의해 개발. 하나의 디자인 또는 셀 시드 발판없이 혈관 유경의 챔버에 생체 주입입니다.이 두꺼운 본질적으로 혈관 조직의 생성을위한 새로운 절차에 도로를 포장하고있다 5,6. 16, 17 &lt;/ P&gt; 최근 전략 이식하기 전에 조직 이식, - vascularize 미리 개발되었다. 이러한 통합 혈관 네트워크는 이식 두꺼운 조직 이식편의 모든 부분의 생존을 향상시키기 위해 전체 혈액 공급의 신속한 공급을 허용 주입시에 호스트 용기에 접합하다보고자한다. 18 우리는 관류 척추 경 혈관 세포 함유 생체 물질을 함유하는 피하 주입 된 반 강성 밀폐 챔버를 포함 작은 동물에서 생체 내 혈관 조직 공학 모델을 개척했다. 챔버는 이식 된 혈관에서 혈관 신생 발아를 자극 허혈성 환경을 만듭니다. 3 혈관 척추 경을 재구성 동정맥 루프 또는 손상 흐름을 통해 동맥과 정맥이 될 수 있습니다. 3-6,19이 혈관 척추 경 콩나물 기능과 광범위한 동맥의를 모두 예술에 연결 -capillary 정맥 네트워크eriole 정맥의 혈관 척추 경으로 끝난다. 3,20를 또한 둘러싸는 중공지지 챔버 혈관 생성을 향상시키기 위해. 3,21,22을 혈관 척추 경 간단히 주입되면 잠재적으로 기계적 힘을 변형되는 현상 조직을 보호하고 허혈성 드라이브 길어 정상 조직이 아닌 상기 챔버의 내부 공간에 보호, 혈관 발아는 정상 상처 척추 경 주위에 축적한다 새로운 조직과 같은 타임 라인을 따라 중단. 연구자들은 임상 관련 크기의 지원 혈관 3 차원 기능 혈관 조직 구조를 생산하는이 생체 구성을 사용하고 있습니다. 4,23는 또한 그것의 본래 혈관 척추 경으로 설계 혈관 조직 구조가 부상 사이트에서 후속 이식 수확 할 수있다 .보다 임상 적으로 가능한 시나리오는 재건의에 대한 확실한 사이트에서 실을 만드는 것 (24, 25)가슴으로 UCH. 따라서,이 새로이 조직 공학 방법은 재건 수술에 대한 기능적 대상 조직의 새로운 소스를 제공하기 위해 임상 적 잠재력을 가질 수있다. 26-28 다음 프로토콜은 상이한 동물 모델에서 적응 혈관 행렬 생성 및 세포 이동과 분화의 복잡한 과정을 조사하기 위해 이용 될 수있는 래트에서 생체 내 혈관 조직 공학 챔버를 구성하는 일반적인 지침을 제공 할 것이다.

<table><tbody><tr><td>1 15 Blade Scalpel</td><td>Braun</td><td>BB515</td><td></td></tr><tr><td>1 Toothed Adson Forceps</td><td>Braun</td><td>BD527R</td><td></td></tr><tr><td>1 Needle Holder</td><td>Braun</td><td>BM201R</td><td></td></tr><tr><td>1 Bipolar Coagulator&amp;nbsp;</td><td>Braun</td><td>US335</td><td></td></tr><tr><td>1 Micro Needle Holder B-15-8.3</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00763</td><td></td></tr><tr><td>1 Micro Dilator Forceps D-5a.2</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00125</td><td></td></tr><tr><td>1 Micro Jeweler&#039;s Forceps JF-5</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00108</td><td></td></tr><tr><td>1 Micro Scissors - Straight SAS-11</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00098</td><td></td></tr><tr><td>1 Micro Scissors - Curved SDC-11</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00090</td><td></td></tr><tr><td>2 Single Clamps B-3</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00400</td><td></td></tr><tr><td>2 10/0 nylon suture</td><td>S &amp;amp; T</td><td>03199</td><td></td></tr><tr><td>1 6/0 nylon suture</td><td>Braun</td><td>G2095469</td><td></td></tr><tr><td>2 4/0 Silk Sutures</td><td>Braun</td><td>C0760145</td><td></td></tr><tr><td>Xilocaine 1%</td><td>Dealmed</td><td>150733</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Heparin Sodium</td><td>Dealmed</td><td>272301</td><td>5,000 UI/ml</td></tr><tr><td>Ringer Lactate</td><td>Baxter</td><td>JB2323</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>1 dome-shaped tissue engineering chamber</td><td>custom made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 flow-through chamber</td><td>custom made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lectin I, Griffonia Simplicifolia&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1105</td><td>1.67 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Troponin T antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab8295</td><td>4 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Human-specific Ku80 antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab80592</td><td>0.06 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Desmin antibody</td><td>Dako</td><td>M0760</td><td>2.55 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Cell Tracker CM-DiI dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C-7000</td><td>3 mg/10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; cells</td></tr><tr><td>Lethabarb (sodium pentobarbitone)</td><td><a href="www.virbac.com.au" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Virbac Animal Health</a></td><td>LETHA450</td><td>325 mg/ml</td></tr><tr><td>Heat pad flexible</td><td><a href="http://www.redzoneheating.com.au" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Redzone Heating</a></td><td>RZ/Medium</td><td></td></tr></tbody></table>

tissue engineering by intrinsic vascularization in an in vivo tissue engineering chamber

재건 수술에서, 서로에 대한 복잡하고 비용이 많이 드는 무역 하나의 결함있는자가 재건의 현재의 방법에 대한 대안에 대한 임상이 필요하다. 조직 공학이 수요 증가를 해결하기 위해 약속을 보유하고있다. 그러나, 대부분의 조직 공학 전략 인해 열악한 혈관 안정 기능적 조직 대체물을 생성하지 못한다. 본 논문은 관류 동맥과 정맥 중 하나 동정맥 루프 또는 흐름을 통해 척추 경 구성으로는 보호 중공 챔버 내부 지향 내장 혈관의 생체 조직 공학 챔버 모델에 초점을 맞추고있다. 이 챔버 기반 시스템에서 혈관 신생 발아는 동정맥 혈관에서 발생하고,이 시스템은 점차적으로 석면 혈관 조직과 챔버 공간을 채우고 구동 허혈성 염증 내생 세포 이동을 끈다. 외인성 세포 / 챔버 구축시에 매트릭스 주입 셀 SUR 향상천공되지 및 개발하는 엔지니어링 조직의 특이성을 결정한다. 우리의 연구는 이러한 챔버 모델이 성공적 지방, 심장 근육, 간 등의 다른 조직을 생성 할 수 있다는 것을 보여 주었다. 그러나, 수정 및 개선이 형성이 일관되고 재현 표적 조직을 보장하기 위해 필요합니다. 이 문서는 생체 내에서 두 개의 서로 다른 혈관 조직 공학 챔버 모델의 제조를위한 표준화 된 프로토콜을 설명합니다.

상기 프로토콜에 기재된 바와 같이 조직 공학 챔버들의 생성은 미세 수술을 실시 하였다. 챔버 내부에서 발생하는 조직 3. 다양한 조직 유형이 성공적으로 생체 내 혈관 챔버 (도 2)를 이용하여 설계 한 프로토콜 단계에서 설명하는 바와 같이 조직 학적으로 관찰 할 수있다. 이러한 신생아 쥐의 심근 (그림 2A), 지방 조직 세포 외 기질 (?...

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Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

에 내장 혈관 신생에 의하여 조직 공학<em&gt; 생체</em&gt; 조직 공학 상공 회의소

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

8.8K 조회수.  St Vincent's Institute of Medical Research. This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling. 

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Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

타악기 생물 반응기를 사용하여 생물 공학 기반 혈관의 이식

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

연구

생체공학

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, and observation and quantification are very challenging. However, conventional in vitro microvessel assays have limitations when representing in vivo microvessels with respect to three-dimensional (3D) geometry and providing continuous fluid flow. Using a combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics, we have developed a multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip, which mimics the 3D geometry of in vivo microvessels and runs under controlled continuous perfusion flow. A positive reflowable photoresist was used to fabricate a master mold with a semicircular cross-sectional microchannel network. By the alignment and bonding of the two polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated from the master mold, a cylindrical microchannel network was created. The diameters of the microchannels can be well controlled. In addition, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded inside the chip showed that the cells lined the inner surface of the microchannels under controlled perfusion lasting for a time period between 4 days to 2 weeks.

A microchannels-on-a-chip platform was developed by the combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics. The endothelialized microchannels platform mimics the three-dimensional (3D) geometry of in vivo microvessels, runs under controlled continuous perfusion flow, allows for high-quality and real-time imaging&#160;and can be applied for microvascular research.

멀티 깊이 원형 단면 Endothelialized 마이크로 채널 - 온 - 칩의 개발을위한 절차

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

전체 피부 결함 모델은 생체의 혈관 신생을 평가하기<em&gt; 생체</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent endothelial progenitors (EPs), which can differentiate into the cell types necessary to assemble mature, functional vasculature, have been derived from both embryonic and induced pluripotent stem cells. However, these cells have not been rigorously evaluated in three-dimensional environments, and a quantitative measure of their vasculogenic potential remains elusive. Here, the generation and isolation of iPSC-EPs via fluorescent-activated cell sorting are first outlined, followed by a description of the encapsulation and culture of iPSC-EPs in collagen hydrogels. This extracellular matrix (ECM)-mimicking microenvironment encourages a robust vasculogenic response; vascular networks form after a week of culture. The creation of a computational pipeline that utilizes open-source software to quantify this vasculogenic response is delineated. This pipeline is specifically designed to preserve the 3D architecture of the capillary plexus to robustly identify the number of branches, branching points, and the total network length with minimal user input.

Endothelial progenitors derived from induced pluripotent stem cells (iPSC-EPs) have the potential to revolutionize cardiovascular disease treatments and to enable the creation of more faithful cardiovascular disease models. Herein, the encapsulation of iPSC-EPs in three-dimensional (3D) collagen microenvironments and a quantitative analysis of these cells&#8217; vasculogenic potential are described.

iPSC 유래 내피 선조의 혈관 전위를 정량화하는 체외 3D 모델 및 전산 파이프라인

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

발생학

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

미세유체역학(Microfluidics) 기반 혈관화된 인간 미세종양 모델 준비

Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical cancer research and therapeutic development.&#160;To overcome this problem, we have developed the vascularized microtumor (VMT), or tumor chip, a microphysiological system that realistically models the complex human tumor microenvironment. The VMT forms de novo within a microfluidic platform by co-culture of multiple human cell types under dynamic, physiological flow conditions. This tissue-engineered micro-tumor construct incorporates a living perfused vascular network that supports the growing tumor mass just as newly formed vessels do in vivo. Importantly, drugs and immune cells must cross the endothelial layer to reach the tumor, modeling in vivo physiological barriers to therapeutic delivery and efficacy. Since the VMT platform is optically transparent, high-resolution imaging of dynamic processes such as immune cell extravasation and metastasis can be achieved with direct visualization of fluorescently labeled cells within the tissue. Further, the VMT retains in vivo tumor heterogeneity, gene expression signatures, and drug responses. Virtually any tumor type can be adapted to the platform, and primary cells from fresh surgical tissues grow and respond to drug treatment in the VMT, paving the way toward truly personalized medicine. Here, the methods for establishing the VMT and utilizing it for oncology research are outlined. This innovative approach opens new possibilities for studying tumors and drug responses, providing researchers with a powerful tool to advance cancer research.

저자 스포트라이트: Creating Human Vascularized Micro-Tumors as Models for Translational Cancer Research (중개 암 연구를 위한 모델로서의 인간 혈관 미세 종양 생성) 

This protocol presents a physiologically relevant tumor-on-a-chip model to perform high-throughput basic and translational human cancer research, advancing drug screening, disease modeling, and personalized medicine approaches with a description of loading, maintenance, and evaluation procedures.

암 연구를 위한 생리학적 인간 혈관화 미세종양 모델 확립

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical ...

암 연구학

The Arteriovenous (AV) Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.
We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment. 
In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient's needs.

The Arteriovenous AV Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

We describe a microsurgical approach for the generation of an arteriovenous (AV) loop as a model for analyzing vascularization in vivo in an isolated and well-characterized environment. This model is not only useful for the investigation of angiogenesis, but is also optimally suited for engineering axially vascularized and transplantable tissues.

소형 동물 모델에서의 동정맥 (AV) 루프는 혈관 신생과 혈관을 조성한 조직 공학을 공부하기

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

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요약

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