우리는 그림 1-3에 묘사 된 실험에 사용 된 Nkx2-1의 mcherry의 ESC 박사 Rossant 박사 Bilodeau을 감사드립니다. FACS는 SickKids-UHN 유동 세포 계측법 시설에서 수행되었다. 이 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소 및 혁신 캐나다 재단 인프라 보조금 (CSCCD)에서 보조금을 운영에 의해 지원되었다.

동물 실험은 아픈 어린이 연구소 대한 병원의 동물 관리위원회의 지침에 따라 수행 하였다. 1. 비계 준비 <ol><li> 폐의 탈세 포화 <ol><li> CO 2 챔버를 사용하여 성체 위 스타 래트를 안락사. 챔버에서 동물을 놓고 분당 챔버 체적 10-30 %의 충전 속도 100 % CO 2 노출을 시작합니다. <ol><li> 무의식에 대한 동물을 관찰; 이 약 2 ~ 3 분 후에 발생합니다. 의식이 기간에 발생하지 않으면, 속도 및 챔버 시일 채우기 확인. 무의식에 이어, 어두운 눈 색깔과 호흡 부족으로 동물을 관찰한다. 모두가 관찰되는 경우, 1 ~ 2 분 동안 CO 2 충전을 유지하고 다음 절차를 챔버에서 동물을 제거합니다. </li></ol></li><li> 앞발과 뒷발 다리를 고정하여 표면을 해부에 동물을 고정하고, 70 % 에탄올로 가슴과 복부 영역을 스프레이. 심장과 루 입구흉골을 따라 수직 절개를 이용하여 흉강을 열어 NGS. </li><li> 격막을 통해 작은 절개를 만드 먼저 폐 천공의 가능성을 감소, 폐는 수축하게한다. 봉합과 하대 정맥을 결찰 작은 해부 가위 좌심방의 작은 절개를 배치합니다. </li><li> 헤파린 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS) (HBSS 10 U / ㎖ 헤파린)로 채워진 25 G 바늘 준비된 10 ㎖ 주사기를 사용하여 폐순환 통해 버퍼 밀어 우심실에 바늘을 삽입하여 폐 관류 시작 (2 ㎖ / 분의 속도로). 폐는 흰색 켜고 좌심방에서 흐르는 유체 분명히 실행 때까지이 절차를 계속합니다. </li><li> 관류 후, 갑상선 연골 근처 플라스틱 카테터와 기관 및 cannulate을 노출하고 봉합 제자리에 고정합니다. </li><li> 설치 레토르트 스탠드와 클램프에 10 ML의 주사기를 고정하여 중력 재관류 시스템. 제거하고 Discard 주사기 플런저. 폐 위 20cm에 주사기 배럴의 최대 충전 포인트를 고정합니다. 주사기의 끝 및 유관 기관에 탈세 포화 용액을 제공하기위한 콕 반대쪽 긴 플라스틱 배관에 양방향 콕을 부착. 주사기에 솔루션을 붓고 솔루션이 부착 된 플라스틱 튜브와 카테터를 입력 할 수 있습니다. <ol><li> 1 분 동안의 총 폐 용량 (약 12 ml)에 충전하여 폐 세척 유체 폐 밖으로 흐르게 기관에서 플라스틱 카테터를 제거한다. H 2 O의 20cm 아래에 압력을 유지하기 위해 폐 lavaging 때 주사기 10 개 이상의 ml에 기입하지 마십시오 </li></ol></li><li> 인산 완충 식염수 (PBS) 10 린스 하였다 여덟 번 탈세 포화 용액 폐 반복 세척. </li><li> 목과 가슴에 구멍이없는기도와 폐를 해부와 동물에서 분리합니다. vibratome 자체에 대한 준비까지 4 ° C에서 차가운 PBS에서 조직을 유지ctioning. </li></ol></li><li> 두꺼운 섹션 생성 <ol><li> 2 %의 약 15 ml의 (w / v) 아가로 오스 4 % 및 6 % 정도로 작은 직사각형 블록으로 모든 돌출부를 매립 (w / v) 아가로 오스를 준비한다. 은 전자 레인지로 PBS에 저 융점 아가로 오스 분말을 녹인다. 열 블록에 50 ㎖ 튜브에 아가로 오스를 전송하고 겔화를 방지하기 위해 40 ° C 이상 온도를 유지한다. </li><li> 작은 가위를 사용하여 각 로브 (뇌, 중앙, 액세서리, 그리고 꼬리 오른쪽 엽과 좌측 엽)을 분리하기 위해 각 엽성 기관지의 끝에서 decellularized 폐를 해부하다. 특허 초과 PBS를 제거하고, 2 %의 내부에 배치하는 흡수 시트를 사용하여 각각의 건조 엽 (W / V) 아가로 가열 블록에있다. </li><li> 페트리 접시에 배치, 아가로 오스의 코팅의 5 분 후 각 로브를 제거하고 표면은 냉각 판에 1 분 동안 겔 할 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 5 분 후, 다시 4 % (w / v) 아가로 오스로 멋진 로브를 배치하고, 6 % (w / v) 아가로 오스와 함께 한 번 더 코팅을 반복합니다. </li><li> 순차적 공동 후각 로​​브는 ating 가장자리에서 주변 조직 아가 적어도 3mm 금속베이스 몰드를 사용하여 6 % (w / v) 아가로 오스 별도로 각 로브를 포함. 오리엔트 각 로브는 실험자 대향 금형의 표면에서의 돌출부의 가장 큰 평평한 에지 위치로 집게를 사용. 이 날은 vibratome 절편에 대한 표본 플레이트에 고정 된 측면 될 것입니다. </li><li> 블록 전에 vibratome와 절편에 적어도 30 분 동안 냉각 판에 겔 할 수 있습니다. 4 ° C에서 최대 12 시간 동안 가습 실에 보관 블록은 이전 절편 vibratome합니다. </li><li> 설치 차가운 PBS (12)와 절편 챔버를 작성하여 vibratome. 주변의 얼음 목욕과 절편에 걸쳐 차가운 온도를 유지한다. 금형에서 블록을 제거하고 조직의 가장자리에서 약 3mm를 유지하면서, 로브를 둘러싼 초과 아가로 오스를 잘라하기 위해 면도날을 사용합니다. </li><li> 접착제를 이용하여 시료 판의 중심에 조직을 고정, 및 t에 접시 잠수함그는 절편 챔버를 PBS-가득합니다. 0.2 mm / 초, 1.85 mm, 및 350 ㎛의 : 각각 이하의 속도, 크기 및 두께의 값을 선택하여 vibratome에 경계가 설정 절편. 참고 : 로브 방향의 종 방향 및 횡 방향 모두 섹션이 허용됩니다. </li><li> 제 각각의 로브 완전히. 섹션 완전히 부 시퀀스의 마지막 날에 의해 분리되지 않는 경우 수동 절단 섹션 작은 가위를 사용하여 무료입니다. 부드럽게 발판 섹션을 수집하고 다음 단계까지 얼음에 PBS에 유의하십시오. 참고 : 생성 된 섹션은 근위 및 원위 폐 지역과 recellularization에 사용할 수있는 두 소스를 모두 포함한다; 그러나, 표면의 대부분은 말초 폐를 포함합니다. </li></ol></li><li> 비계 부분의 오염 제거 <ol><li> 마이크로 원심 튜브 (최대 30 섹션 / 튜브)에 PBS에서 350 마이크론 두께의 발판 섹션을 전송하고 클레아로 처리 (PBS에서 90 U / ㎖) (자료의 목록 참조) 12 -에 실온에서 24 시간,회 전자. </li><li> 클레아 제 처리 후, 새로운 마이크로 원심 튜브에 집게를 사용하여 회 전자에 실온에서 6 시간 동안 멸균 상태에서 (PBS 200 U / ㎖ 페니실린 스트렙토 마이신과 25 μg의 / ml의 암포 테리 신 B) 항균 용액으로 처리 전송 섹션. 참고 : 공사장 공중 발판은 사용하기 전에 일주까지 4 °에서 C에 대한 항균 솔루션에 저장할 수 있습니다. </li><li> 항균 용액으로 오염 제거 단계에 이어, 멸균 조건에서 두 번 PBS와 발판을 씻어 세포를 파종하기 전에 무료로 차별화 미디어 (SFDM)를 혈청에 전송합니다. </li></ol></li></ol> 2. 내배엽 세포 준비 <ol><li> 확실한 내배엽 유도 <ol><li> 2I 조건 (13)를 사용하여 피더 무료, 혈청 무료 문화에서 마우스 ESC 라인을 유지한다. 트립신에 의해 부착 만능 문화에서 세포를 제거하여 내배엽 유도를 시작합니다. </li><li> 20000의 밀도 SFDM 종자 세포를 재현 탁미디어의 변화없이 세포를 3 일 동안 낮은 부착 플레이트 / ㎖는 EB 형성을 허용합니다. </li><li> 사흘 부드럽게 10 ㎖ 피펫을 사용하여 50 ㎖로 원뿔형 튜브를 사채를 전송하고 실온에서 3 분 동안 바닥에 수집 할 수 있도록 한 후. </li><li> 조심스럽게 대기음 미디어와 추가 신선한 SFDM 미디어 50 NG / ㎖ 티빈 A. 보충 </li><li> 다시 1에서 낮은 부착 판 위에 종자 세포 : 세 가지 추가 일간 2 밀도와 문화가 결정적인 내배엽 분화를 달성했다. </li></ol></li><li> 확실한 내배엽 농축 <ol><li> 하루 6 사채를 수집 트립신 해리와 결합 된 형광 항체 (14)를 사용하여 C-KIT와 CXCR4 발현에 대한 레이블을 붙입니다. </li><li> 두 마커의 발현을 형광 - 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 정렬 표지 된 세포를 풍부한 최종 내배엽 인구 (15)를 얻었다. </li></ol></li></ol> 3. R​​ecellularization 설치 <ol><li> 공기 - 액체 계면문화 설치 <ol><li> 멸균 집게를 사용 소수성 부동 막 (8 μm의 기공 크기)에 SFDM 각 decellularized 발판 섹션 (단계 1.2.9)를 전송합니다. 비계를 확인 섹션 막에 균일하게 확산됩니다. </li><li> 각각 SFDM의 1 또는 0.5 ml의에 우물을 작성하여 6 또는 12 웰 플레이트를 준비합니다. 부드럽게 공기 - 액체 배양 설정을 작성, 멤브레인 미디어의 상단에 떠 있도록 우물에 막을 배치합니다. </li></ol></li><li> 3D 비계의 시드 <ol><li> 최종 내배엽 마커 (단계 2.2.2)에 대한 다음 FACS는 혈구를 사용하여 정렬 세포를 계산 SFDM에서 5 분,에 resuspend 400 XG에 스핀 다운. 약 100,000 세포 / 10 μL / 골격을 함유하는 부피를 얻기 위해 세포를 재현 탁. </li><li> 직접 단계 3.1.2에서 각각의 준비 섹션에 피펫, 세포의 10 μl를 발판을 recellularize합니다. </li><li> 문화의 모든 48 시간을 SFDM 미디어를 교체합니다. 약간의 경사에 접시를 들고가 기존의 미디어를 대기음문화를 방해 방지 할 수 있습니다. 천천히 떠있는 막으로 가라 앉는 것을 방지하기 위해 잘의 측면을 따라 문화에 신선한 SFDM를 추가합니다. </li><li> 성숙한기도 상피 세포에 접종 세포의 분화를 달성하기까지 21 일 동안 공기 - 액체 문화를 유지한다. 주 : Recellularized 절 세포 배양 물 (16) 중 임의의 시점에서 조직 면역 염색법 (IF) 현미경을 위해 처리 될 수있다. </li></ol></li></ol>

<ol>
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선언 할 경쟁 금전적 이해 관계가 없습니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 다른 보충제와 차별화를 직접 천연 폐 비계를 사용하여 성숙한 ESC 유래기도 상피 세포를 생성합니다. 이 문화의 설정은, 무 혈청, 저렴하고 재현성 정의된다. 기본 차별화 미디어의 어떠한 성장 인자 보충이 필요하지 않습니다. 줄기 세포 유래 폐 상피 세포를 생성 이전에 발행 된 방법은 혈통 제한 3,4,8,18,19을 촉진하는 성장 인자 보충과 2 차원의 전략을 사용하...

폐 혈통에 만능 세포의 감독 차별화는 미세 1, 2에 정확한 신호 이벤트에 따라 달라집니다. 이 때문에 프로세스의 동적 특성으로는 시험 관내에서 폐 기관 형성 정확한 이벤트를 모방하는 도전되었다. 최근보고는 폐 분화 3-8을 달성하기 위해 이차원 문화 수용성 성장 인자로 보충 단계적 혈통 제한 전략을 이용했다. 단계적인 분화 프로토콜에서 다 능성 세포는 배아 줄기 세포 (ESC) 또는 유도 만능 줄기 세포 여부를 먼저 최종 내배엽 세균 층으로 분화되었다. homeodomain을 포함하는 전사 인자의 발현 NKX2-1 의해 식별 내배엽 세포는이어서, 폐 전구 세포에 후 전방 내배엽 운명에 가압 하였다. 이러한 폐 전구 세포는 더 근위 (기도) 또는 원위부 (폐포) 폐 상피 세포 위스콘신에 차별화 된번째는 성장 인자 보충을 계속했다. 이러한 2 차원 전략 폐 상피 세포를 생성하는 약간의 성공이 있었다 그러나이 불분명 효율 다른 내배엽 계통의 오염 가능성, 3 차원 (3D) 구조의 부족 등 여러 제한이 있고, 일부 경우에 정의 문화 사용 혈청 보충과 함께. decellularized 폐 골격에 능성 또는 분화 세포의 배양은 점점 폐 상피 3,5,6,8,9 구조를 형성하는 시드 세포의 재생 가능성을 평가하기위한 분석법으로 사용된다. 이러한 보고서 문화는 계속 성장 인자 또는 혈청 보충과 비계에 세포를 파종. 폐 개발 환경 단서에 대한 응답으로 분할, 마이그레이션, 유전자 발현 및 개별 세포의 분화를 포함한다. 세포 외 기질 (ECM)는 구조적지지를 제공 할뿐만 아니라, tissu 지시 당 단백질의 격자 인통합하고 이러한 프로세스 10, 11를 조절하여 전자 형태 형성. 더 생체 폐 개발 환경을 모방 내배엽 배양 용 천연 플랫폼 폐 ECM 지지체를 사용함으로써 높은 효율과 재현성으로 설정 정의 된 3 차원 배양 세포 유래기도 상피 줄기 세포를 생성했다. 쥐의 폐 ECM의 발판이 생성 된 탈세 포화뿐만 아니라 마우스 ESC 유래 내배엽 세포에 의해 생성 이후에 이러한 지지체에 접종 하였다. CXCR4 &amp; C-KIT 단백질의 이중 표현은기도 (근위 폐) 전구 세포로 식별됩니다 SOX2 및 NKX2-1 식 모두에 긍정적 인 최종 내배엽 세포의 정체성과 세포를 나타냅니다. 확실한 내배엽 세포는 시험 관내에서 기능적인기도 상피 세포를 생성하는 데 최대 3 주가 용 공기 액체 경계면 (ALI)에서 배양 하였다. 이 프로토콜은 defini의 폐 계통의 분화를 촉진조기 NKX2-1 + / SOX2 + 초기 근위 폐 전구 세포의 출현으로 관찰 칠일뿐만적인의 내배엽. 하루 14 섬모를 포함 등장 문화 성숙한기도 상피 세포 인구의 21 (TUBB4A +), 클럽 (SCGB1A1의 +) 및 기저 (TRP63 +, KRT5 +) 기본 마우스기도에 대한 형태 학적 및 기능적 유사성을 가진 세포. 이 프로토콜은 상피 세포를기도 강인 분화를 달성하기위한 3 차원 매트릭스의 미세 환경의 중요성을 보여준다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusion solution</td><td>Sigma</td><td>H0777</td><td>10 U/ml heparin</td></tr><tr><td>Perfusion solution</td><td>Gibco</td><td>14170112</td><td>dissolved in Hank&#039;s balanced salt solution (HBSS-)</td></tr><tr><td>Decellularization solution</td><td>BioShop</td><td>CHA003</td><td>8&amp;nbsp;mM CHAPS</td></tr><tr><td>Decellularization solution</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td>25&amp;nbsp;mM EDTA</td></tr><tr><td>Decellularization solution</td><td>BioShop</td><td>SOD002</td><td>1&amp;nbsp;M NaCl</td></tr><tr><td>Decellularization solution</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>dissolved in PBS</td></tr><tr><td>Benzonase nuclease</td><td>Novagen</td><td>70664-3</td><td>90&amp;nbsp;U/ml Benzonase nuclease&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Benzonase nuclease</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>diluted in PBS</td></tr><tr><td>Antimicrobial solution&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>200&amp;nbsp;U/ml penicillin streptomycin</td></tr><tr><td>Antimicrobial solution&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15290</td><td>25&amp;nbsp;&amp;mu;g/ml amphotericin B</td></tr><tr><td>Antimicrobial solution&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>diluted in PBS</td></tr><tr><td>Trypsinization&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td>TrypLE</td></tr><tr><td>Serum free differentiation media (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>IMDM 2440-053, F12 11765-054</td><td>3:1 ratio of IMDM and Ham&amp;rsquo;s modified F12 medium</td></tr><tr><td>Serum free differentiation media (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td>B27 supplement (50x dilution)</td></tr><tr><td>Serum free differentiation media (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>N2 supplement (100x dilution)</td></tr><tr><td>Serum free differentiation media (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>0.05% (Fraction V) bovine serum albumin</td></tr><tr><td>Serum free differentiation media (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>200&amp;nbsp;mM Glutamax</td></tr><tr><td>Serum free differentiation media (SFDM)</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td>4&amp;nbsp;&amp;mu;M monothioglycerol</td></tr><tr><td>Serum free differentiation media (SFDM)</td><td>Sigma</td><td>A4403&amp;nbsp;</td><td>0.05&amp;nbsp;mg/ml ascobic acid</td></tr><tr><td>Endoderm induction</td><td>R&amp;amp;D</td><td>338-AC/CF</td><td>Activin A</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDH1</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>Mouse, non-conjugated, 1:100</td></tr><tr><td>C-KIT</td><td>BD Biosciences</td><td>558163</td><td>Rat, PE-Cy7, 1:100</td></tr><tr><td>CXCR4</td><td>BD Biosciences</td><td>558644</td><td>Rat, APC, 1:100</td></tr><tr><td>KRT5</td><td>Abcam</td><td>ab24647</td><td>Rabbit, non-conjugated, 1:1,000</td></tr><tr><td>NKX2-1</td><td>Abcam</td><td>ab76013</td><td>Rabbit, non-conjugated, 1:200</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB300-144</td><td>Rabbit, non-conjugated, 1:200</td></tr><tr><td>SCGB1A1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9772&amp;nbsp;</td><td>Goat, non-conjugated, 1:1,000</td></tr><tr><td>SOX2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF2018&amp;nbsp;</td><td>Goat, non-conjugated, 1:400</td></tr><tr><td>TRP63</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8431</td><td>Mouse, non-conjugated, 1:200</td></tr><tr><td>TUBB4A</td><td>BioGenex</td><td>MU178-UC</td><td>Mouse, non-conjugated, 1:500</td></tr><tr><td>Goat IgG&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td>Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200</td></tr><tr><td>Mouse IgG&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21202</td><td>Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200</td></tr><tr><td>Mouse IgG&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200</td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200</td></tr><tr><td>Rabbit IgG&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31573</td><td>Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low adherent plates</td><td>Nunc</td><td>Z721050&amp;nbsp;</td><td>Low cell binding plates,&amp;nbsp; 6 wells&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Air-liquid interface membranes&amp;nbsp;</td><td>Whatman</td><td>110614</td><td>Hydrophobic Nucleopore membrane, 8&amp;nbsp;&amp;mu;m pore size</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S&amp;nbsp;</td><td>Leica Vibratome</td></tr><tr><td>Tissue Adhesive</td><td>Ted Pella</td><td>10033</td><td>Pelco tissue adhesive</td></tr></tbody></table>

generation of esc-derived mouse airway epithelial cells using decellularized lung scaffolds

폐 혈통 차별화는 성장 인자 신호 전달, 세포 - 세포 상호 작용 및 세포 - 기질 상호 작용을 포함하는 복잡한 환경 단서의 통합이 필요합니다. 이 때문에 복잡성, 체외에서 폐 개발의 재현부는 도전 된 폐 상피 세포로 줄기 세포의 분화를 촉진합니다. 이 프로토콜에서, decellularized 폐 비계 줄기 세포 유래기도 상피 세포 폐의 3 차원 환경을 모방하고 생성하기 위해 사용된다. 마우스 배아 줄기 세포는 먼저 decellularized 지지체 상에 시딩 티빈 A를 내배엽 세포와 배아 체 (EB) 배양 방법을 이용하여 내배엽 계통으로 분화 최대 21 일 동안 공기 - 액체 계면에서 배양된다. 이 기술은 추가로 성장 인자를 보충하지 않고 작용기도 상피 세포에 접종 세포 (섬 모세포 클럽 세포 및 기저 세포)의 분화를 촉진한다. 이 문화의 설정이 정의되고, serum-무료, 저렴하고 재현성. 제한된 오염이 문화가 아닌 폐 내배엽 계통에서이 있지만,이 프로토콜은기도 상피 인구를 생성하고, 폐포 상피 세포에 상승을 제공하지 않습니다. 이 프로토콜 생성기도 상피는 폐 기관 형성 기간 동안 질병 모델링이나 낭포 성 섬유증과 같은기도 관련 병리의 약물 발견 플랫폼 세포 - 매트릭스 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜에 설명 된 바와 같이, 최종 내배엽의 강력한 차별화 상피 세포가 decellularized 폐 비계 부분에 씨앗을 품고 세포의 확장 된 문화를 사용하여 달성 될 수기도 성숙한합니다. decellularized 지지체는 (1) 숙주 세포가 완전히 제거되도록하는 것을 특징으로한다, (2) 세포 외 매트릭스 단백질 분화 지지체를 사용하기 전에 보존하는 것이 권장된다. 도 1a에 도?...

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Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Decellularized 폐 공사장 공중 발판을 사용하여 ESC 파생 마우스기도 상피 세포의 생성

이 프로토콜은 효율적으로기도에게 상피 세포를 성숙 마우스 배아 줄기 세포 유래 최종 내배엽 지시합니다. 분화 기술은 정의 된 무 혈청 배양 환경에서, 폐 계통 사양을 직접 3 차원 decellularized 폐 지지체를 사용한다.

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

generation-esc-derived-mouse-airway-epithelial-cells-using

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.6K 조회수.  Hospital for Sick Children.  이 프로토콜은 효율적으로기도에게 상피 세포를 성숙 마우스 배아 줄기 세포 유래 최종 내배엽 지시합니다. 분화 기술은 정의 된 무 혈청 배양 환경에서, 폐 계통 사양을 직접 3 차원 decellularized 폐 지지체를 사용한다. 

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Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

룽 공학을위한 절차

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

연구

생체공학

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and composition. It is based on a microsurgical procedure designed to catheterize the trachea and aorta of a euthanized mouse to perfuse the heart and lungs with decellularizing agents. The decellularized cardiopulmonary complex can subsequently be immunostained to reveal the location of structural ECM proteins. The whole procedure can be completed in 4 days.
The ECM scaffolds resulting from this protocol are free of dimensional distortions. The absence of cells enables structural examination of ECM structures down to submicron resolution in 3D. This protocol can be applied to healthy and diseased tissue from mice as young as 4-weeks old, including mouse models of fibrosis and cancer, opening the way to determine ECM remodeling associated with cardiopulmonary disease.

This protocol aims to decellularize the heart and lungs of mice. The resulting extracellular matrix (ECM) scaffolds can be immunostained and imaged to map the location and topology of their components.

뮤린 심폐 복합체의 탈세포화

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

암 연구학

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of the lung endoderm with its surrounding mesenchyme and mesothelium. Lung mesenchyme has been shown to be the source of inductive signals for lung branching morphogenesis. Epithelial-mesenchymal-mesothelial interactions are also critical to embryonic lung morphogenesis. Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system (in the absence of maternal influence and blood flow). More importantly this technique can be readily done in a serumless, chemically defined culture media. Gain and loss of function can be achieved using expressed proteins, recombinant viral vectors and/or analysis of transgenic mouse strains, antisense RNA, as well as RNA interference gene knockdown.

Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system.

마우스 배아의 폐 문화, 분기의 분자 메커니즘을 평가하는 시스템

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

생물학

Generation of Airway Epithelial Cell Air-Liquid Interface Cultures from Human Pluripotent Stem Cells

Diseases of the conducting airway such as asthma, cystic fibrosis (CF), primary ciliary dyskinesia (PCD), and viral respiratory infections are major causes of morbidity and mortality worldwide. In vitro platforms using human bronchial epithelial cells (HBECs) have been instrumental to our understanding of the airway epithelium in health and disease. Access to HBECs from individuals with rare genetic diseases or rare mutations is a bottleneck in lung research.
Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are readily generated by "reprogramming" somatic cells and retain the unique genetic background of the individual donor. Recent advances allow for the directed differentiation of iPSCs to lung epithelial progenitor cells, alveolar type 2 cells, as well as the cells of the conducting airway epithelium via basal cells, the major airway stem cells.
Here we outline a protocol for the maintenance and expansion of iPSC-derived airway basal cells (hereafter iBCs) as well as their trilineage differentiation in air-liquid interface (ALI) cultures. iBCs are maintained and expanded as epithelial spheres suspended in droplets of extracellular matrix cultured in a primary basal cell medium supplemented with inhibitors of TGF-&#223; and BMP signaling pathways. iBCs within these epithelial spheres express key basal markers TP63 and NGFR, can be purified by fluorescence activated cell sorting (FACS), and when plated on porous membranes in standard ALI culture conditions, differentiate into a functional airway epithelium. ALI cultures derived from healthy donors are composed of basal, secretory and multiciliated cells and demonstrate epithelial barrier integrity, motile cilia, and mucus secretion. Cultures derived from individuals with CF or PCD recapitulate the dysfunctional CFTR-mediated chloride transport or immotile cilia, the respective disease-causing epithelial defects.
Here, we present a protocol for the generation of human cells that can be applied for modeling and understanding airway diseases.

Recent advances in human induced pluripotent stem cell differentiation protocols allow for the stepwise derivation of organ-specific cell types. Here, we provide detailed steps for the maintenance and expansion of iPSC-derived airway basal cells and their differentiation into a mucociliary epithelium in air-liquid interface cultures.

인간 다능성 줄기 세포로부터의 기도 상피 세포 공기-액체 계면 배양물의 생성

Diseases of the conducting airway such as asthma, cystic fibrosis (CF), primary ciliary dyskinesia (PCD), and viral respiratory infections are major ...

발생학

<meta charset="utf8"></head><body>폐 장벽 무결성, 질병 및 약물 발견 연구를 위한 기도 모델

iPSC-Derived Epithelial, Mesenchymal, Endothelial, and Immune Cell Co-Culture to Model Airway Barrier Integrity in Lung Health and Disease

Human lung tissue is composed of an interconnected network of epithelium, mesenchyme, endothelium, and immune cells from the upper airway of the nasopharynx to the smallest alveolar sac. Interactions between these cells are crucial in lung development and disease, acting as a barrier against harmful chemicals and pathogens. Current in vitro co-culture models utilize immortalized cell lines with different biological backgrounds, which may not accurately represent the cellular milieu or interactions of the lung. We differentiated human iPSCs into 3D lung organoids (containing both epithelium and mesenchyme), endothelial cells, and macrophages. These were co-cultured in an air-liquid interface (ALI) format to form an epithelial/mesenchymal apical barrier invested with macrophages and a basolateral endothelial barrier (iAirway). iPSC-derived iAirways showed a reduction in barrier integrity in response to infection with respiratory viruses and cigarette toxins. This multi-lineage lung co-culture system provides a platform for studying cellular interactions, signaling pathways, and molecular mechanisms underlying lung development, homeostasis, and disease progression. iAirways closely mimic human physiology and cellular interactions, can be generated from patient-derived iPSC&#39;s, and can be customized to include different cell types of the airway. Overall, iPSC-derived iAirway models offer a versatile and powerful tool for studying barrier integrity to better understand genetic drivers for disease, pathogen response, immune regulation, and drug discovery or repurposing in vitro, with the potential to advance our understanding and treatment of airway diseases.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 동인성 상피, 내피 및 면역 세포를 사용한 인간 기도 리모델링 및 바이러스 반응 모델링

This article describes the generation of a complex, multi-cellular airway barrier model composed of induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived lung epithelium, mesenchyme, endothelial cells, and macrophages in an air-liquid interface culture.

폐 건강 및 질환에서 기도 장벽 무결성을 모델링하기 위한 iPSC 유래 상피, 중간엽, 내피 및 면역 세포 공동 배양

Human lung tissue is composed of an interconnected network of epithelium, mesenchyme, endothelium, and immune cells from the upper airway of the ...

Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex vivo. Recently developed organoid models have facilitated the expansion and study of lung epithelial progenitors in vitro, but these platforms typically rely on mouse tumor-derived matrix and/or serum, and incorporate just one or two cellular lineages. Here, we describe a protocol for generating engineered lung tissues (ELTs) based on the multi-lineage recellularization of decellularized precision-cut lung slices (PCLS). ELTs contain alveolar-like structures comprising alveolar epithelium, mesenchyme, and endothelium, within an extracellular matrix (ECM) substrate closely resembling that of native lung. To generate the tissues, rat lungs are inflated with agarose, sliced into 450 &#181;m-thick slices, cut into strips, and decellularized. The resulting acellular ECM scaffolds are then reseeded with primary endothelial cells, fibroblasts, and alveolar epithelial type 2 cells (AEC2s). AEC2s can be maintained in ELT culture for at least 7 days with a serum-free, chemically-defined growth medium. Throughout the tissue preparation and culture process, the slices are clipped into a cassette system that facilitates handling and standardized cell seeding of multiple ELTs in parallel. These ELTs represent an organotypic culture platform that should facilitate investigations of cell-cell and cell-matrix interactions within the alveolus as well as biochemical signals regulating AEC2s and their niche.

This protocol describes a method to generate reproducible, small-scale engineered lung tissues, by repopulating decellularized precision-cut lung slices with alveolar epithelial type 2 cells, fibroblasts, and endothelial cells.

탈세포화된 폐 조각으로 제조된 조작된 폐 조직

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex ...

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in regenerative medicine and bioreactor technologies offer opportunities to produce lab-grown functional tissue and organ constructs that can be used to screen drugs, model disease, and engineer tissue replacements. Here, a miniaturized bioreactor coupled with an imaging modality that allows in situ visualization of the inner lumen of explanted rat trachea during in vitro tissue manipulation and&#160;culture is described. Using this bioreactor, the protocol demonstrates imaging-guided selective removal of endogenous cellular components while preserving the intrinsic biochemical features and ultrastructure of the airway tissue matrix. Furthermore, the delivery, uniform distribution, and subsequent prolonged culture of exogenous cells on the decellularized airway lumen with optical monitoring in situ are shown. The results highlight that the imaging-guided bioreactor can potentially be used to facilitate the generation of functional in vitro airway tissues.

The protocol describes an imaging-enabled bioreactor that allows the selective removal of the endogenous epithelium from the rat trachea and homogenous distribution of exogenous cells on the lumen surface, followed by long-term in vitro culture of the cell-tissue construct.

생체 공학 기도 조직 생성을 위한 영상 유도 생물반응기

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

Decellularized 폐 공사장 공중 발판을 사용하여 ESC 파생 마우스기도 상피 세포의 생성

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Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

뮤린 심폐 복합체의 탈세포화

마우스 배아의 폐 문화, 분기의 분자 메커니즘을 평가하는 시스템

인간 다능성 줄기 세포로부터의 기도 상피 세포 공기-액체 계면 배양물의 생성

폐 건강 및 질환에서 기도 장벽 무결성을 모델링하기 위한 iPSC 유래 상피, 중간엽, 내피 및 면역 세포 공동 배양

폐 건강 및 질환에서 기도 장벽 무결성을 모델링하기 위한 iPSC 유래 상피, 중간엽, 내피 및 면역 세포 공동 배양

폐 건강 및 질환에서 기도 장벽 무결성을 모델링하기 위한 iPSC 유래 상피, 중간엽, 내피 및 면역 세포 공동 배양

탈세포화된 폐 조각으로 제조된 조작된 폐 조직

생체 공학 기도 조직 생성을 위한 영상 유도 생물반응기