Name: differentiation of atrial cardiomyocytes from pluripotent stem cells using the bmp antagonist grem2
Uploaded: 2016-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2 at JoVE.com

이 작품은 NIH 보조금 HL083958 및 HL100398 (AKH)와 2T32HL007411-33에 의해 지원되었다 &quot;심장 혈관 메커니즘의 프로그램 : 조사에서 훈련을&quot;(JB)를.

세포 배양 미디어, 솔루션 및 시약 1. 준비. <ol><li> 마우스 배아 줄기 세포를 500 ㎖ (MESC) 혼합 및 살균 여과 (0.2 ㎛의 공극 크기) 445 ml의 글래스 최소 필수 중간 (GMEM), 50 ㎖의 열 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS)에 의해 용지를 준비 5 ㎖ 100X는 L- 집중 ml의 당 1 × 10 7 단위 및 1.43 μL의 ß-머 캅토 에탄올 (최종 농도가 50 μM입니다)에서 글루타민 교체, 5 ㎕를 재조합 마우스 백혈병 억제 인자 (LIF). 사용할 준비가 될 때까지 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 혼합 및 무균 여과하여 391 ml의 배아 바디 (EB) 분화 배지 500 ml를 준비 Iscove 개변 둘 베코 중간 (IMDM), FBS를 비활성화 100㎖의 열, 5 ㎖ (100X)가 L 글루타민 교체 농축 5 ㎖ 100X 비 필수 아미노산을 농축하여 (NEAA), 및 2.86 μl를 ß-머 캅토 에탄올 (최종 농도 100 μM)입니다. 준비가 될 때까지 4˚ C에서 보관 사용하기. </li><li> w 0.2 % 준비여과하고 500 mL를 1g 돼지 피부 젤라틴 분말을 혼합하여 젤라틴 / V 수용액, 증류수 H 2 O. 고압 증기 멸균에 의해 소독. 젤라틴은 실온에서 물에 완전히 용해되지 않을 수 있습니다. 젤라틴을 고온 가압 멸균 한 후 완전히 용해되어야한다. 사용할 준비가 될 때까지 실온에서 보관하십시오. </li><li> 0.5 μg의 / μL 원액을 0.1 % BSA로 보충 된 100 ㎕의 인산 완충 식염수 (PBS)에서 동결 건조 Grem2 50 μg의 펠렛을 용해 Grem2 재조합 단백질 분취 액을 준비한다. 준비가 될 때까지의 -80˚ C 나누어지는 다섯 멸균 1.5 ml의 원심 분리기 튜브에이 원액 20 μL 및 저장소를 사용합니다. </li><li> 10 배 재고 한 출판 프로토콜 또는 구매에 따른 PBS를 준비하고 희석 19 일 1X을 여과, 증류 H 2 O로 1:10 희석. 사용 전에 오토 클레이브에 의해 멸균 PBS. 사용할 준비가 될 때까지 실온에서 보관하십시오. 일부 단계에서 사용되는 2 + 칼슘과 마그네슘없이 DPBS. 이 폴리 우레탄입니다1X 솔루션으로 rchased. 주문 정보 시약의 테이블에 포함되어있다. </li></ol> 젤라틴 2. 준비 10cm 조직 문화 요리를 코팅 <ol><li> 멸균 조직 문화 후드에 코팅 각 10cm 조직 배양 접시에 0.2 % 젤라틴 용액 5 ㎖를 추가합니다. 적어도 30 분 동안 4 일까지 37 ℃에서 인큐베이터에 넣어 요리. </li></ol> 젤라틴 3. 6- 웰 조직 배양 플레이트를 코팅 <ol><li> 멸균 조직 배양 후드에서 6- 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 0.2 % 젤라틴 1 ㎖를 추가한다. 적어도 30 분 동안 4 일까지 37 ℃에서 인큐베이터에 넣어 판. </li></ol> 4. 배아 줄기 세포 배양 <ol><li> 해동 mESCs <ol><li> 멸균 조직 문화 후드에서 실온으로 가온하여 MESC 미디어를 준비합니다. 젤라틴 코팅 10cm 접시에 10 ml의 RT 매체를 추가합니다. </li><li> 약 1 × 10 6 세포를 포함하는 mESCs의 1 병을 제거cryostorage. 37 ℃의 수욕 집게, 장소 cryovial 들고. 세포 현탁액을 해동하고 단지 작은 아이스 결정은 병의 중심에 유지 될 때까지 조심스럽게 소용돌이 친다. 와 유리 병을 건조 일회용 보풀이없는 닦아 70 % EtOH로 소독. </li><li> 무균 조직 배양 후드에서 cryovial에서 P1000 팁을 사용하여 해동 세포를 제거하고 4.1.1에서 제조 10cm 접시)에 전송할 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 백업 할 판 앞을 이동하여 세포를 배포 균등하게 5 % CO 2와 37 ℃ 가습 세포 배양 인큐베이터에 10cm 접시를 놓고, 다음 좌우로. 세포는 O / N을 도금 또는 적어도 6 시간에 첨부 할 수 있습니다. </li><li> 우선 밝은 필드 현미경을 사용하여 부착 다음날 아침 체크 세포. 일부 세포 파편과 죽은 세포는 미디어에서 관찰됩니다. 이것은 정상입니다. 요리에서 대기음 미디어 및 10 ml의 신선한 MESC 미디어로 교체합니다. </li><li> 차별을 방지하기 위해 매일 세포에서 미디어를 변경하는 것을 계속한다. </li></ol></li><li&gt;과 Passaging의 mESCs <ol><li> 통로 셀 때 60-70% 합류. 미디어 흡입과의 MgCl 2, CaCl2를하지 않고 5 ml의 멸균 1X DPBS로 세척하여 계대에 대한 세포를 준비합니다. 2 ml의 0.05 % 트립신 EDTA 솔루션을 추가합니다. 5 분 동안 37 ℃에서 인큐베이터에 놓습니다. </li><li> 세포가 배양되는 동안, 젤라틴 용액을 흡입하고 RT MESC 미디어 10 ㎖를 추가하여 새로운 10cm 요리를 준비합니다. 5 분 후 분리에 대한 세포를 확인합니다. 세포가 부착 된 상태를 유지하는 경우, 완전히 분리 될 때까지 한 번에 2 분 동안 37 ℃에서 배양하는 것을 계속한다. </li><li> MESC 배지 3 ㎖을 첨가함으로써 트립신 EDTA 담금질. 펠렛하기 위해 5 분 동안 200 XG에 15 ml의 원심 분리기 튜브와 스핀에 세포 현탁액을 전송합니다. 펠렛에서 대기음 미디어 및 10 ml의 MESC 미디어에서 일시 중지 다시. </li><li> 원하는 분할 비율에 따라, 단계 4.2.2에서 제조 된 각각의 접시)에 세포 현탁액의 0.5-1.0 ml에 추가 할 수 있습니다. 부드럽게 한 다음 앞으로 다시 좌우로 이동하여 세포를 배포 균일하게 인큐베이터에서 접시를 놓고. 모든유동 세포는 O / N 또는 적어도 12 시간 동안 부착합니다. 참고 : 1:10 분할 비율 - 1:20 대부분의 MESC 라인에 대한 일반적입니다. 이 비율은 새로운 접시 사용 라인 유로 수와 합류 소망에 따라 달라질 수있다. 갓 준비 젤라틴 코팅 10cm 접시에 1:10 분할 비 9 ml의 MESC 매체에 1 ml의 세포 현탁액의 전송 및 플레이트하십시오. </li></ol></li></ol> 배아 기관의 5. 준비 참고 : 원심 분리를 제외한 모든 단계는 무균 조직 배양 후드에서 수행됩니다. <ol><li> EB 미디어의 세포 현탁액의 제조 <ol><li> 70 % 컨 플루 (일반적으로 24 ~ 48 시간 후 - 유로)시, EB 형성 세포를 사용합니다. 4.2.3) - 분리 및 섹션 4.2.1)에 따라 펠렛으로 EB 형성 세포를 준비합니다. 참고 : (. 예를 들어, 아주 작은 세포 죽음, 아니 오염, 적절한 형태) 그것은 적어도 한 번 후 해동 통로 세포에 가장 적합하고 건강을 확인하고 강력한 성장 (전자.g., 이전의 모든 24 ~ 48 시간을 발생 인구의 분열은) 사채를 만들기 위해 사용합니다. </li><li> 5 ml의 EB 미디어에서 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계산합니다. </li><li> / 25 μl의 세포 (2.5 × 103 세포 / ㎖)을 최종 농도를 만들기 위해 EB 매체의 필요한 부피의 세포 현탁액을 희석. 배양 접시의 각 뚜껑을 약 60 사채를 보유하고 세포 현탁액의 약 1.3 ml의가 필요합니다. 이 단계에서, 사채의 수를 생성하는 세포 현탁액의 충분한 양을 준비한다. 240 사채는 실험에 필요한 경우, 예를 들어, 2.5 × 103 세포 / ml에서 5.2 ml의 준비. 참고 : EB 형성에 사용되지 않는 mESCs이 MESC 미디어에서 다시 정지 및 4.2 절에 설명 된대로 도금, 회전 수를 줄여 미래의 실험에 사용 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 배아 기관의 창조 <ol><li> 전자의 바닥에 1X PBS 2 ㎖를 첨가하여 살균 10cm에게 드롭 형성 매달려에 대한 세균 배양 - 요리를 준비ACH. </li><li> 멸균 솔루션 유역에 단계 5.1에서 EB 서스펜션)를 전송합니다. </li><li> 준비 페트리 접시에서 뚜껑을 제거하고 조심스럽게 내부 표면에 EB 서스펜션의 육십, 20 μl의 방울을 입금. 효율적 6 팁 장착 멀티 채널 피펫을 사용하여이를. 각 20 μL 강하는 지금 500 세포를 가지고있다. </li><li> 부드럽게 방울 매달려 쫓아 않도록 조심하면서, 세균 배양 접시의 하단에 덮개를 교체합니다. 이일 후 37˚ ℃에서 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓고 세포) 5.3에 설명 된대로 아래로 씻어 준비가 된 것입니다. </li></ol></li><li> 배아 기관의 워시 다운 참고 : 모든 세척 다운 단계 멸균 조직 문화 후드에서 수행됩니다. <ol><li> 이일 후 EB의 아래로 세척을위한 준비와 6cm 세균 배양 접시에 전송합니다. RT에 페트리 접시 당 EB 미디어의 사전 따뜻한 3 ㎖. 각 6cm 세균 배양 접시 효과적으로 방울 매달려의 가치가 2 뚜껑을 보유 할 수 있습니다. 주 : 비 코팅 된 배양 접시의 F를 사용하십시오또는이 단계 (재료 표 참조). 조직 배양 접시 또는 세포 부착을 장려 다른면을 사용하지 마십시오. 6 절에 설명 된대로 사채가 준비 될 때까지 미디어에 도금 할을 정지 상태로 유지해야합니다. </li><li> 인큐베이터에서 10cm 배양 접시를 제거하고 멸균 조직 문화 후드에 배치합니다. 조심스럽게 사채와 뚜껑을 제거하고 45도 각도로 기울이십시오. </li><li> RT EB 배지 3 ㎖을 함유하는 5 ㎖의 혈청 피펫을 사용하여 조심스럽게 뚜껑의 하단 풀로 사채 씻는다. 조심스럽게 표면에 부착하고 필요한 경우-씻어 다시 EBS에 대한 뚜껑을 검사합니다. </li><li> 6cm의 페트리 접시에 모든 사채 전송을 세척 한 후. </li><li> 반복 모든 EBS에 대한) -5.3.4) 5.3.2 단계를 반복합니다. 각 6cm 페트리 접시 두 10cm 뚜껑에서 사채를 포함해야합니다. 두 개 더 일 동안 37 ℃에서 다시 인큐베이터로 모든 요리를 놓습니다. 참고 : 너무 정지에 가깝게된다 사채가 서로 달라 큰 응집체를 형성 할 수있다. 이는 부정적인 심장 분화 효율에 영향을 미칠 수뿐만 아니라 상당히 사용할 사채의 수를 감소시킨다. 응집을 방지하기 위해, 사채 매일 확인하고 부드럽게 앞뒤로 이동하여 구분해야합니다, 다음 좌우로. 초기 분화 단계에서 세균 접시를 사용 접시 EB 부착을 방지하고 사채 현탁액에서 성장하도록 허용 할 필요가있다. </li></ol></li></ol> Grem2와 사채 6. 도금 및 치료 <ol><li> 1-5 μg의 / ㎖의 최종 희석 Grem2 RT EB 매체 재고 충분한 양 (0.5 μg의 / μL)을 첨가하여 Grem2 처리 매체를 준비한다. 주 : 사채의 치료 유효 농도는 세포주 및 Grem2 현재 많은 특정 활성에 따라 달라진다. 용량을 사용하기 전에이 최대 효과를 찾아 적정하는 것이 좋다. CGR8 MESC 라인을 위해 우리는 정기적으로 Grem2의 3-5 μg의 / ㎖를 사용합니다. 사이에 급속하게 수축 세포를 만들어 심방 심근 세포 생성을위한 Grem2의 유효 농도물론 각각의 전반에 걸쳐 널리 퍼져 일 7-8. 계약 표현형 치료 문화에서 관찰되지 않는 경우는 Grem2이 표시된 범위 내에서 적정 투여하는 것이 좋습니다. </li><li> 각 웰로부터 젤라틴 코팅 용액을 흡입하고 RT Grem2 처리 매체 2 ㎖를 첨가하여 6 웰 조직 배양 플레이트를 준비한다. 인큐베이터에서 사채를 제거하고 멸균 조직 문화 후드에 배치합니다. </li><li> 각 웰에 6cm 배양 접시에서 100 μl를 전송 (30) 사채로 설정 P1000 사용. 장소 사채 인큐베이터에 균등는쪽으로 한 후 전면에 뒷면 플레이트를 이동 부드럽게하여 분산. <ol><li> 사채는 젤라틴 코팅 우물에 부착 한 후, 건강한 세포를 유지하기 위해 이틀 신선한 EB 미디어를 10 일 후 하루 10까지 Grem2 치료를 중단 이틀 Grem2 미디어를 교체하고 추가 할 수 있습니다. 참고 : 연결 한 후, 사채가 코팅 된 플레이트의 표면을 따라 평평합니다. </li></ol></li></ol> RT-qPCR에 Analy 7. 세포 해리동생 <ol><li> 트립신 - EDTA와 세포 해리 <ol><li> 물론 각에서 대기음 매체와 무균 DPBS 마이너스 칼슘과 마그네슘 2+ 잘 당 1 ㎖로 두 번 씻어. </li><li> 각 웰 세포가 수집됩니다있는 0.5 ml의 0.25 % 멸균 트립신 - EDTA 솔루션을 추가합니다. </li><li> 5 분 동안 37 ℃에서 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. </li><li> 해리 5 분 체크 세포 후. 세포가 여전히 잘 탭의 하단에 부착 된 상태를 유지하면 부드럽게 풉니 다. 도청 세포를 풀고하지 않는 경우, 다시 인큐베이터에 배치하고 세포가 완전히 분리 될 때까지 매 2 분을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 각 웰에 0.5 ml의 EB 매체를 첨가함으로써 트립신 EDTA 용액을 중화. </li><li> 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 세포 현탁액 1ml를 전체 전송. </li><li> 300 X g에서 5 분 동안 탁상 원심 분리기의 회전에 의해 펠렛 세포. </li><li> 대기음은 펠렛에서 미디어 및 용해에 대한 준비가 될 때까지 -70 ℃에서 즉시 용해 또는 저장 펠릿로 이동합니다. 장 터이 RNA의 저하로 이어질 수 펠릿 m 저장하지 않는 것이 좋습니다. </li></ol></li><li> 세포 용해 및 분자 분석 <ol><li> 이때 세포는 (재료 표 참조) 상용 열 추출 키트를 사용하거나 제조사 공급 프로토콜에 따라 RNA 추출 시약을 이용하여 RNA를 분리를위한 준비가되어있다. 일단 격리, 전사 RNA를 반대하고, 21 표준 기술 (20)를 사용하여 RT-qPCR에 분석의 cDNA를 사용합니다. 참고 : RT-qPCR에 대해이 실험실에서 사용하는 프라이머는 표 1. 심방 정체성에 나와있는 레코드의 활동 전위 기간 (8 항 참조)에 심방과 심실 유전자의 발현 및 전기 생리학을보고 RT-qPCR에의 조합을 사용하여 확인할 수있다. 유전자의 선택은 안정적인 심방과 심실 마커의 예로서,이 프로토콜에 포함된다. 다 능성 줄기 세포의 분화의 맥락에서 심방과 심실의 유전자 발현에 대한 추가 정보는 기준 (14)에서 발견된다. &lt;/ 리&gt; </ol></li></ol> 8. 전기 생리 분석 <ol><li> 콜라게나 제와 세포 해리 <ol><li> 각 웰 멸균 PBS의 웰 당 1 ㎖로 두 번 씻어에서 대기음 매체. </li><li> 각 / ㎖ 콜라겐 용액 1 mg을 0.5 ml를 잘 추가합니다. </li><li> 10 분 동안 37 ℃에서 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. </li><li> 해리 5 분 체크 세포 후. 세포는 여전히 서로 또는 잘 탭의 하단에 부착 된 상태를 유지하면 부드럽게 풉니 다. 또한 P1000와 부드러운 분쇄하여 세포를 떼어 놓다. 주 : 단일 세포 현탁액이 될 때까지 패치 클램프 기록 셀을 용이하게는 분쇄한다. </li><li> 각 웰에 0.5 ml의 EB 미디어를 추가하고 피펫으로 혼합한다. </li><li> 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 세포 현탁액 1ml를 전체 전송. </li><li> 300 X g에서 5 분 동안 탁상 원심 분리기의 회전에 의해 펠렛 세포. </li><li> 세포 펠렛에서 기음 미디어. </li><li> 500 세포를 다시 일시단일 세포 현탁액에 씹다해야되고, 10 % FBS와 PBS를 μL. </li></ol></li><li> 전기 생리 특성. 참고 : 많은 우수한 프로토콜은 세포막 전위를 측정하기 위해 단일 ​​셀 패치 클램프를 사용하여이 저널에 발표되었다. 단일 세포 패치가 초보 독자를 고정 수행하는 방법에 대한 자세한 내용은이 프로토콜 21-24이라고합니다. 다음은 경험이 풍부한 electrophysiologist 준비하고 MESC이 하위 유형 특성에 대한 CMS에 파생 처리 도움이 프로토콜에 대한 특정 정보가 포함되어 있습니다. <ol><li> 10 mM의 HEPES 버퍼, 5 mM의 MgATP, 2 mM의 EGTA, 110 MM의 칼륨, 글루탐산, 10 밀리미터의 KCl, 10 mM의 NaCl을 다음 구성 세포 내 기록 솔루션을 준비합니다. 의 NaOH를 사용하여 7.2의 pH에​​ 솔루션을 조정합니다. </li><li> 세포 외 기록 (욕) 다음으로 이루어지는 용액을 조제 2 mM의 HEPES, 10 mM의 글루코스를 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를 5.4 mM의 KCl을, 137mM의 NaCl을. 의 NaOH를 사용하여 7.4의 pH에​​ 솔루션을 조정합니다. </li><li> 필라멘트 표준 붕규산 유리를 사용하여 기록 솔루션으로 채워 때 2-5 MΩ 저항을 측정하는 유리 피펫을 준비합니다. </li><li> 전송 P200 세포를 사용하는, 기록 액 함유 기록 챔버에 현탁 세포 100 ㎕. 주 : 셀은 처리를 용이하게 약물 치료 및 / 또는 재관류 분석을 위해 사용하도록 패치 또는 정지 될 수있다 8.2.5에 명시된 바와 같이, 젤라틴 코팅 된 커버 슬립)에 접종 할 수있다. </li><li> 6- 웰 플레이트의 각 웰에 10 mm 직경의 유리 커버 슬립을 배치하고이 프로토콜) 3.1 절에 기술 된 바와 같이, 젤라틴 용액으로 젤라틴 피복함으로써 피복 된 유리 커버 슬립을 준비한다. <ol><li> 적어도 30 분 대기음 젤라틴 용액 후 것은 coverslip에 적어도 2 시간 동안이나 세포가 부착 될 때까지 인큐베이터로 전체 6 웰 플레이트를 배치하는 직접 정지 세포 100 μl를 추가합니다. 세포가 부착 한 후, 연구세포 외 기록 용액 챔버 기록에 가져 가십시오 커버 슬립과 장소. 참고 : αMHC-을 DsRed 형광 심장 기자 MESC 라인을 사용하는 경우의 CM가 자신의 적색 형광 핵에 의해 식별 될 수있다. 심장 리포터 라인을 사용하지 않는 경우, 자연 수축 세포를 관찰 할 수 있고, 측정입니다. 다 능성 줄기 세포가 완전히 형성 성인 심장 근육 세포의 특성 직사각형 형태를 결여, CMS가 일반적으로 더 작고 둥근 있습니다 산출했다. </li></ol></li><li> 37 ℃에서 모든 기록을 확인합니다. 2-5 MΩ의 저항을 붕규산 유리 피펫으로 전류 클램프 모드에서 전체 셀 클램프를 사용하여 단일 세포를 패치. 전체 셀 액세스하기 전에 기가 옴 밀봉을 달성하기 위해 부드러운 음의 압력을 사용합니다. 막 파열 및 막 전위를 기록하기 전에 전체 셀 액세스하려면 빠른 부압을 적용합니다. </li><li> 현재 주사를 탈분극 4 밀리 초를 사용하여 활동 전위를 보여주고 있습니다. 노트:PSC 유래 CMS에 대한 전류량 재현성 활동 전위가 변할 수 트리거해야. 재생 가능한 활동 전위를 얻을 때까지 최적의 임계 전류를 찾기 위해, 단계적으로 비교적 낮은 전류 증가 트리거 전류 진폭 시작한다. 참고 Grem2 유도 심방 근육 세포에 대한 활동 전위 지속 시간은 20-40 밀리 초의 범위에서 일반적이며 고원 위상 (도 6b)에 부족하다. </li></ol></li></ol>

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W., Matsa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Lian, X., Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/&#946;-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/&#946;-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Zhang, J., Klos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells:+the+matrix+sandwich+method.">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li><li>Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gremlin+2+promotes+differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+atrial+fate+by+activation+of+the+JNK+signaling+pathway.">Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway.</a> Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).</li><li>Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+optimization+of+activin/nodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li><li>M&#252;ller, I. I., Melville, D. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+recombinant+protein+related+to+DAN+and+cerberus+(PRDC).">Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC).</a> Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).</li><li>Schulz, H., Kolde, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FunGenES+Database:+A+genomics+resource+for+mouse+embryonic+stem+cell+differentiation.">The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation.</a> PLoS ONE. 4 (9), e6804 (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate-buffered+saline+(PBS).">Phosphate-buffered saline (PBS).</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+Real-Time+quantitative+PCR+and+the+2&#8722;&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2&#8722;&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egr-1+regulates+expression+of+the+glial+scar+component+phosphacan+in+astrocytes+after+experimental+stroke.">Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke.</a> American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).</li><li>Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes.">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recording+of+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes.">Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller.">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li><li>Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).</li><li>H&#246;pfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiating+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies.+Volume+2:+molecular+embryo+analysis,+live+imaging,+transgenesis,+and+cloning.">Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning.</a> Methods in Molecular Biology. , 254-279 (2004).</li><li>Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+mouse+embryonic+stem+cell+based+assay+for+quantifying+cardiogenic+Induction+Efficiency.">Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li><li>Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+embryoid+bodies+from+human+pluripotent+stem+cells+using+AggreWell&#8482;+plates.">Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell&#8482; plates.</a> Basic Cell Culture Protocols. 946, 523-533 (2013).</li><li>Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+culture+of+murine+primordial+germ+cells+and+embryonic+germ+cells.">Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells.</a> Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).</li></ol>

The authors of this manuscript have no competing financial interests.

이 프로토콜은 정기적으로 심방 혈통의 특징의 CM의 높은 비율과 문화를 생산하고 있습니다. 모든 분화 프로토콜로서, 분화 이전 mESCs의 품질에 특별한주의를 기울여야한다. mESCs 정기적으로 적절한 형태 (그림 1A)에 대해 모니터링해야한다. 이전에 사채의 형성 발생 된 자연 분화는 심각 cardiogenesis의 효율성을 제한합니다 (그림 1B)를 계대 전에 제거해야합니다. EB의 크기도...

다 능성 줄기 세포를 생성하고, 특히 인간 1-5에서는 기초 연구 및 비 임상 연구에 대한 액세스 조직에 어려운 호스트로부터 세포를 연구하기위한 강력한 도구이다. 발달 신호 경로를 적절히 조절하여 원하는 표현형 운명​​ 다 능성 줄기 세포의 분화를 유도 할 수있다. 대부분의 프로토콜은 다 능성 줄기 세포로부터 심근 6-14 (CMS)를 생성하기 위해 개발되었다. 이러한 프로토콜은 일반적으로 TFGβ 수퍼 패밀리 (티빈, BMP, 및 TGFβ)과의 Wnt 외생 적 성장 인자 및 / 또는 작은 분자 10,12-15의 시간 제한 추가를 통해 경로의 변조를 포함한다. 이러한 프로토콜은 CMS에가 세포의 비율을 증가 시키는데 일반적으로 효과적이지만, 심방, 심실 및 노드 / 전도 시스템의 계통을 나타내는 세포의 혼합 집단을 생성 특이성이 부족하다. 특정 심장을 연구하기 위해 더 많은 지시 차별화 아프로을 아류ACH가 필요합니다. Gremlin2 (단 짧은에 대한 켈베로스 또는 PRDC 관련 Grem2라고도 단백질) 제브라 피쉬 (16)의 심장 개발하는 동안 적절한 심장 차별화와 심방 실 형성에 필요한 분비 BMP 길항제이다. 단지 중배엽 마커 T-Brachyury 1 등 켈베로스의 피크 식 후, 분화 4 일에 Grem2와 차별화 된 배아 줄기 세포 치료,의 CM의 수율을 증가시키고 주로 심방 혈통 (14)의 세포의 풀을 생성합니다. 재조합 Grem2는 분화 세포를 치료하는 데 사용되는 표준 단백질 생산 기술 (17)을 사용하여 제조 될 수 있거나 또는 시중에서 구입할 수있다. 이 수용액에 용해되는 고도로 원하는 시점에서 배양 물에 외생 첨가 될 수있다. 차별화 마커 담당자의 발현을 정량 RT-qPCR에를 사용하여 추적 할 수 있습니다심장 혈관 전구 세포, 심장 전구 세포, 그리고 헌신의 CM의. 면역은 식별 심장 세포 유형의 공간 분포를 가시화 할 수있다. 식별 CMS에 분리 리포터 시스템을 사용하는 경우에 순수 집단을 필요로하는 응용 프로그램은 더 용이하게 수행된다. 이를 위해, 우리는 αMHC-DsRedNuc 마우스 CGR8 ES 세포주 (14)로 구성 도입했다. CGR8 세포 확장 및 분화 검정 (18)을 용이하게 성장 피더 세포 능성없이 남아있다. ES 세포주는 유전자 프로모터 (MHC 또는 Myh6 α) 심장 관련 알파 마이 오신 무거운 체인에서 핵 지역화 신호을 DsRed 형광 단백질 코딩 서열이 포함되어 있습니다. 이들 세포를 사용하여, CMS는 쉽게 식별 및 정량화 셀 정렬 전기 생리학, 약물 스크린, 심방 분화 기전을 연구 단리 할 수​​있다.

<table><tbody><tr><td>GMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11710</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>&amp;szlig;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Sigma</td><td>I3390</td><td></td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Tissue Culture Plates</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Bacterial Petri Dishes</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Bacterial Petri Dishes</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>6-well tissue culture plates</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>Gremlin 2 recombinant protein</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>2069-PR-050</td><td></td></tr><tr><td>Sterile filter units</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-741-02</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin (from porcine skin)</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS, Sterile</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>BSA&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA solution</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no Calcium, no Magnesium</td><td>Life Technologies</td><td>14200</td><td></td></tr></tbody></table>

differentiation of atrial cardiomyocytes from pluripotent stem cells using the bmp antagonist grem2

다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포 집단을 생성하기위한 프로토콜이 개발되었지만, 이들은 일반적으로 혼합 된 세포 표현형을 얻었다. 특정 심근 세포 아형을 포함하는 연구를 추구에 관심 연구진은보다 감독 차별화 접근법을 필요로한다. Grem2 생체 내 심방 실 형성에 필요한 분비 BMP 길항제와 마우스 배아 줄기 (ES) 세포를 처리하여, 심방 심장 세포 표현형 다수 생성 할 수있다. 설계 Myh6-을 DsRed-NUC 능성 줄기 세포주를 사용 식별, 선택 및 심근 정화용 수있다. 이 프로토콜에서 배아 체는 매달려 드롭 방법을 사용하여 Myh6-을 DsRed-NUC 세포에서 생성 및 분화 날 4 (D4)까지 정지 유지하고 있습니다. 셀 D4에 Grem2로 처리 젤라틴 코팅 된 플레이트 상에 도금. D8-D10 큰 계약 지역 문화에서 관찰 및 확장을 계속하고 m되는 사이D14을 통해 ature. 분자는 조직 학적 및 electrophysiogical 분석 Grem2 처리 한 세포에서 세포가 심방 심근의 생물학 및 다양한 약리 에이전트에 대한 반응을 연구하기 위해 체외 모델을 제공 심방과 같은 특성을 획득 나타냅니다.

이전 차별화, 만능 줄기 세포는 컴팩트하고 자발적인 분화 없어야합니다. 도 1a에 도시 된 셀은 단일화 및 프로토콜의 섹션 5.1에 기술 된 바와 같이 드랍 매달려에 사용될 준비가되었다. 도 1b에 도시 된 세포는 자발적으로 분화되고 매달려 상품의 제조에 사용되어서는 안된다. 패널은 2는...

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Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

BMP 길항제 Grem2를 사용하여 다 능성 줄기 세포에서 심방 심근의 차별화

Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

differentiation-atrial-cardiomyocytes-from-pluripotent-stem-cells

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.7K 조회수.  Vanderbilt University School of Medicine. Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.

비디오: Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포의 유도

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

연구

발생학

Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes available for basic research and translational applications. To differentiate hiPSCs into cardiomyocytes, various protocols including embryoid body (EB)-based differentiation and growth factor induction have been developed. However, these protocols are inefficient and highly variable in their ability to generate purified cardiomyocytes. Recently, a small molecule-based protocol utilizing modulation of Wnt/&#946;-Catenin signaling was shown to promote cardiac differentiation with high efficiency. With this protocol, greater than 50%-60% of differentiated cells were cardiac troponin-positive cardiomyocytes were consistently observed. To further increase cardiomyocyte purity, the differentiated cells were subjected to glucose starvation to specifically eliminate non-cardiomyocytes based on the metabolic differences between cardiomyocytes and non-cardiomyocytes. Using this selection strategy, we consistently obtained a greater than 30% increase in the ratio of cardiomyocytes to non-cardiomyocytes in a population of differentiated cells. These highly purified cardiomyocytes should enhance the reliability of results from human iPSC-based in vitro disease modeling studies and drug screening assays.

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

작은 분자 변조 차별화 및 후속 포도당 기아을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 고도로 정제 된 심근 세포의 유도

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates. Conventional aggregate formation of hPSCs involves dissociating cell colonies into smaller clumps, with size control of the clumps crudely controlled by pipetting the cell suspension until the desired clump size is achieved. One of the main challenges of conventional aggregate-based cardiac differentiation of hPSCs is that culture heterogeneity and spatial disorganization lead to variable and inefficient cardiomyocyte yield. We and others have previously reported that human embryonic stem cell (hESC) aggregate size can be modulated to optimize cardiac induction efficiency. We have addressed this challenge by employing a scalable, microwell-based approach to control physical parameters of aggregate formation, specifically aggregate size and shape. The method we describe here consists of forced aggregation of defined hPSC numbers in microwells, and the subsequent culture of these aggregates in conditions that direct cardiac induction. This protocol can be readily scaled depending on the size and number of wells used. Using this method, we can consistently achieve culture outputs with cardiomyocyte frequencies greater than 70%.

Conventional methods to initiate suspension aggregate based cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) are plagued with culture heterogeneity with respect to aggregate size and shape. Here, we describe a robust method for cardiac differentiation employing microwells to generate size-controlled hPSC aggregates cultured under cardiac-promoting conditions.

인간 다 능성 줄기 세포의 서스펜션 기반의 심장 차별화를위한 마이크로 웰의 집계 크기 최적화

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates.  Conventional aggregate formation ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

마우스 배아 섬유 아 세포의 전사 인자 매개 재 프로그래밍에 따라 심근 서브 타입을 평가

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) are increasingly recognized as having great value for modeling cardiovascular diseases in humans, especially arrhythmia syndromes. They have also demonstrated relevance as in vitro systems for predicting drug responses, which makes them potentially useful for drug-screening and discovery, safety pharmacology and perhaps eventually for personalized medicine. This would be facilitated by deriving hPSC-CMs from patients or susceptible individuals as hiPSCs. For all applications, however, precise measurement and analysis of hPSC-CM electrical properties are essential for identifying changes due to cardiac ion channel mutations and/or drugs that target ion channels and can cause sudden cardiac death. Compared with manual patch-clamp, multi-electrode array (MEA) devices offer the advantage of allowing medium- to high-throughput recordings. This protocol describes how to dissociate 2D cell cultures of hPSC-CMs to small aggregates and single cells and plate them on MEAs to record their spontaneous electrical activity as field potential. Methods for analyzing the recorded data to extract specific parameters, such as the QT and the RR intervals, are also described here. Changes in these parameters would be expected in hPSC-CMs carrying mutations responsible for cardiac arrhythmias and following addition of specific drugs, allowing detection of those that carry a cardiotoxic risk.

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

Electrophysiological characterization of cardiomyocytes derived from human Pluripotent Stem Cells (hPSC-CMs) is crucial for cardiac disease modeling and for determining drug responses. This protocol provides the necessary information to dissociate and plate hPSC-CMs on multi-electrode arrays, measure their field potential, and a method for analyzing QT and RR intervals.

다중 전극 배열 (MEAs)을 이용한 인간 다 능성 줄기 세포 유래 심근 세포 (hPSC-CMs)의 전기 생리 학적 분석

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading cause of mortality worldwide. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising option for cell-based therapies to replace current, invasive techniques. MSCs can differentiate into mesenchymal lineages, including cardiac cell types, but complete differentiation into functional cells has not yet been achieved. Previous methods of differentiation were based on pharmacological agents or growth factors. However, more physiologically relevant strategies can also enable MSCs to undergo cardiomyogenic transformation. Here, we present a differentiation method using MSC aggregates on cardiomyocyte feeder layers to produce cardiomyocyte-like contracting cells.
Human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) have been shown to have a greater differentiation potential than commonly investigated MSC types, such as bone marrow MSCs (BMSCs). As an ontogenetically younger source, we investigated the cardiomyogenic potential of first-trimester (FTM) HUCPVCs compared to older sources. FTM HUCPVCs are a novel, rich source of MSCs that retain their in utero immunoprivileged properties when cultured in vitro. Using this differentiation protocol, FTM and term HUCPVCs achieved significantly increased cardiomyogenic differentiation compared to BMSCs, as indicated by the increased expression of cardiomyocyte markers (i.e., myocyte enhancer factor 2C, cardiac troponin T, heavy chain cardiac myosin, signal regulatory protein &#945;, and connexin 43). They also maintained significantly lower immunogenicity, as demonstrated by their lower HLA-A expression and higher HLA-G expression. Applying aggregate-based differentiation, FTM HUCPVCs showed increased aggregate formation potential and generated contracting cells clusters within 1 week of co-culture on cardiac feeder layers, becoming the first MSC type to do so. 
Our results demonstrate that this differentiation strategy can effectively harness the cardiomyogenic potential of young MSCs, such as FTM HUCPVCs, and suggests that in vitro pre-differentiation could be a potential strategy to increase their regenerative efficacy in vivo.

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Here, we present a method to efficiently harness the cardiac differentiation potential of young sources of human mesenchymal stem cells in order to generate functional, contracting, cardiomyocyte-like cells in vitro.

생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in developmental cardiology have led to generating cardiac cells from pluripotent stem cells, it is unclear if the two cardiac fields - the first and second heart fields (FHF and SHF) &#8212; are induced in pluripotent stem cells systems. To address this, we generated a protocol for in vitro specification and isolation of heart field-specific cardiac progenitor cells. We used embryonic stem cells lines carrying Hcn4-GFP and Tbx1-Cre; Rosa-RFP reporters of the FHF and the SHF, respectively, and live cell immunostaining of the cell membrane protein Cxcr4, a SHF marker. With this approach, we generated progenitor cells which recapitulate the functional properties and transcriptome of their in vivo counterparts. Our protocol can be utilized to study early specification and segregation of the two heart fields and to generate chamber-specific cardiac cells for heart disease modelling. Since this is an in vitro organoid system, it may not provide precise anatomical information. However, this system overcomes the poor accessibility of gastrulation-stage embryos and can be upscaled for high-throughput screens.

The purpose of this method is to generate heart field-specific cardiac progenitor cells in vitro in order to study the progenitor cell specification and functional properties, and to generate chamber specific cardiac cells for heart disease modelling.

마우스 심장 필드 특정 심장 전구 세포의 시험관 내 생성

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

생물학

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...