Name: aggregate size optimization in microwells for suspension-based cardiac differentiation of human pluripotent stem cells
Uploaded: 2016-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

We thank Dr. Peter Zandstra, in whose laboratory this protocol was developed, and Drs. Mark Gagliardi and Gordon Keller who provided assistance in establishing the initial methods on which this process was based. Protocol development was supported by an Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology to C.B. and a grant from the Heart and Stroke Foundation of Ontario to Peter Zandstra.

중간 구성 요소 1. 준비 <ol><li> 워시 매체를 준비합니다. DMEM / F12 100 ㎖ 당 1 100X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PEN / 패 혈성)의 ㎖, 100X L- 글루타민 1 ㎖ 혈청 대체 5 mL를 추가한다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 화학적으로 기저 심장 유도 매체를 준비합니다. </li><li> 이 프로토콜에서 사용되는 미디어 다음 재고 시약을 준비합니다. <ol><li> L- 아스코르브 산가 : 원뿔 튜브에 4 ° C, 멸균 울트라 순수한 증류수 ㎖의 당 5 밀리그램의 재고 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 얼음에이 솔루션을두고 용질이 완전히 용해 될 때까지 주기적으로 튜브를 소용돌이. 필터 멸균 0.22 ㎛의 주사기 필터를 사용하여 아스코르브 산 용액. </li><li> 아스코르브 산 용액 1 ml의 분취 량을 준비하고 -20 ℃에서 분취 액이 저장한다. 때마다 매체를 준비 갓 해동 나누어지는을 사용합니다. </li></ol></li><li> 매체 제조 당일기저 심장 유도 보통 1 ㎖에 monothioglycerol (MTG) 13 μL 희석. 사용하지 않는, 희석 MTG 폐기하십시오. </li><li> -20 ℃에서 저장 트랜스페린 (30 ㎎ / ㎖) 1 ml의 분취 량을 준비한다. 스토어는 최대 3 개월 동안 4 ° C에서 분취 량을 해동. </li><li> 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 4 mM의 염산 (HCL)을 준비한다. 흄 후드에서, 초순수, 증류수 50 ml의 6.0 N HCl 용액 30 μL를 추가한다. 필터 멸균 0.22 ㎛의 주사기 필터를 사용하여 용액. 50 ml의 HCl 용액에 25 % BSA 용액 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 0.1 % BSA를 함유하는 인산염 완충 식염수 (PBS)를 준비한다. ml의 PBS 당 25 % BSA 용액 20 μl를 추가합니다. </li><li> 인간의 뼈 형태 형성 단백질 4 (BMP-4) 원액 (10 NG / μL)를 준비합니다. 0.1 % BSA를 함유하는 4 mM의 염산 완충액 1 ㎖에서 BMP-4 10 μg의 동결을 녹인다. -20 ° C에서 저장하는 50 μl의 분취 량을 준비합니다. </li><li> 인간 섬유 아세포 성장 인자 2 (bFGF를) 원액을 준비(10 NG / μL). 0.1 % BSA를 함유하는 인산염 완충 식염수 1 ㎖ (PBS) 10 μg의 동결 건조의 bFGF를 녹인다. -20 ° C에서 저장하는 50 μl의 분취 량을 준비합니다. </li><li> 인간의 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 원액 (5 NG / μL)를 준비합니다. 0.1 % BSA를 함유하는 PBS 1 ㎖에 5 μg의 동결 건조 된 VEGF를 녹인다. -20 ° C에서 저장하는 50 μl의 분취 량을 준비합니다. </li><li> 티빈에게 원액 (10 NG / μL)를 준비합니다. 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 PBS 1 ㎖에 티빈 동결 10 μg의 용해. -20 ° C에서 저장하는 50 μl의 분취 량을 준비합니다. </li><li> 이 Wnt 생산-2 (IWP-2) 원액 (10 밀리미터)의 억제제를 준비합니다. 429 ㎕의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 2 mg을 IWP-2를 녹여. -80 ° C에서 저장하는 10 μl의 분취 량을 준비합니다. </li></ol></li><li> 전체 심장 유도 매체를 준비합니다. 기저 심장 유도 보통 100 ㎖, 1 ~ 100X 펜 / ml의 스트렙토, 100X L- 글루타민 1 ㎖, 트랜스페린의 500 μL, 추가 1신선하게 해동 아스코르브 산 용액 및 MTG 300 μL. 사용되지 않는 매체를 폐기하십시오. </li></ol> 마이크로 웰 플레이트 2. 준비 참고 : 모든 단계가 생물 안전 캐비닛에서 수행해야합니다. <ol><li> 접시에 사용되는 각 웰에 0.5 ml의 세척 용액 (키트의 구성 요소)를 추가합니다. 용액 연락처 각 마이크로 웰의 내부 표면 전체를 2 분 동안 840 XG에 플레이트를 원심 분리되도록한다. </li><li> 실온에서 30 ~ 60 분 동안 접시를 품어. </li><li> 우물에서 세척 용액을 대기음. 다음과 같이 각 웰에 두 번 씻으 : 각 웰에 PBS 1 ml의 추가, 원심 분리기 판을 2 분 동안 840 XG에 다음 PBS를 대기음. </li></ol> hPSC 3. 형성은 마이크로 웰 플레이트에서 집계합니다 참고 : 모든 단계가 생물 안전 캐비닛에서 수행해야합니다. <ol><li> 37 ° C의 물을 욕조에 세척 매체를 놓습니다. 참고 : 볼륨은 HP의 우물 = 1 ML의 X 번호를 요구해리 될 것이다 SC. </li><li> 하나의 세포에 hPSCs을 떼어 놓다 참고 :이 단계는 6 웰 플레이트에서 배양 세포의 분리를 설명 - 시약의 볼륨은 서로 다른 문화 형식에 대해 비례 적으로 확장 할 수 있습니다. <ol><li> 각 hPSC 문화에서 잘 해리의 문화 매체를 기음. 분해 효소 1 ㎖로 각 웰을 헹군 후 즉시 각 웰의 분해 효소 대기음. 주 : 잔류 분해 효소는 세포를 해리하기에 충분해야한다. </li><li> 3 분 37 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 각 웰에 세척 보통 1 ㎖를 첨가하고 기계적 조직 배양 표면 위에 P1000의 micropipettor로 세척 중간 피펫 팅하여 조직 배양 표면에서 세포를 해리. 해리가 완료되지 않은 세포 덩어리가 남아있는 것으로 나타나는 경우,이 시점에서 스트레이너를 통해 정지를 전달합니다. </li><li> 15 ML 원뿔 관 및 저장에 세포 현탁액을 전송인큐베이터에서 튜브는 셀 수는 다음 단계에서 수행된다. </li><li> 셀 카운트를 수행합니다 <ol><li> 이전 단계에서 수집 된 세포 현탁액 10 μL 샘플을보십시오. 트리 판 블루의 30 μl를 추가하고 피펫으로 잘 현탁액을 섞는다. </li><li> 혈구의 각 실에 트리 판 블루 염색 된 세포의 10 μl를 전송하고 10 배 목적으로 반전 현미경으로 시각화. 세포를 계산합니다. </li></ol></li><li> 셀 카운트 결과로부터, 마이크로 웰 플레이트의 웰 당 1.2 × 106 세포로 시딩 수 잇는 웰 구한다. 계산 집계 매체는 물론 당 1 ml의에서 세포를 배정해야합니다. </li><li> 집계 매체를 준비합니다. 전체 심장 유도 보통 10 ㎖, 당 BMP4 원액 0.5 μL (최종 농도 = 0.5 NG / ㎖) 및 Y-27632 ROCK 억제제 (최종 농도 = 10 μM)를 추가합니다. </li><li> 인큐베이터와 centrifu에서 hPSCs를 포함하는 원뿔 튜브를 제거GE의 5 분 200 XG에 튜브. 세척 매질 대기음 용액 당 1.2 × 106 세포의 밀도로 응집 매질에서 세포를 재현 탁. </li><li> 마이크로 웰 플레이트의 각 웰에서 PBS 세척 용액을 대기음. 균등하게 분배하고 잘 마이크로 웰 플레이트에 각 세포 현탁액의 씨앗 1 ml를하는 P1000의 micropipettor를 사용하여. 웰 다수 시드 주기적 침강 방지 세포 현탁액을 소용돌이. </li><li> 5 분 동안 200 XG에서 접시를 원심 분리기. 세포는 각각의 마이크로 웰의 바닥에 방사 한 확인하기 위해 현미경으로 접시를 관찰한다. </li><li> 5 % CO 2, 5 % O 2 (저산소증) 인큐베이터에서 37 ℃에서 24 시간 동안 플레이트를 인큐베이션. </li></ol></li></ol> 4. 심장 유도 1 단계 <ol><li> 집계 다음의 어느 날 (1 일), (우물, 볼륨 = 1 ML의 X 번호 24 웰 플레이트 용) 1 단계 유도 매체의 필요한 볼륨을 준비합니다. 전체 1 ㎖를 들어심장 유도 매체, BMP4 스톡 용액 (최종 농도 = 10 NG / ㎖) 1 μL, bFGF의 스톡 용액 (최종 농도 = 5 NG / ㎖) 0.5 μL와 티빈 (A)의 0.6 μl를 추가 (최종 농도 = 6 NG / ㎖). 적어도 15 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 매체를 넣습니다. </li><li> 인큐베이터에서 마이크로 웰 플레이트를 제거합니다. 현미경 집계를 검사합니다. 즉시 후 원심 분리기 집계에 비해, 그들은 부드러운 가장자리 (더 라운드 전날보다 작은 광장)에 그대로 나타납니다. </li><li> 마이크로 웰 내부의 집계를 방해하지 않고 뜨는을 제거 : <ol><li> 수평 레벨을 마이크로 웰 플레이트를 잡고 (예.,을 기울이지 않는다). 각 웰 마이크로 웰 플레이트에 대해, 배지의 표면에 상기 웰의 가장자리에 대해 P1000의 micropipettor의 선단을 배치. </li><li> 천천히 마이크로 웰의 하단에있는 집계를 방해하지 않도록주의, 배지를 제거합니다. t을 감소 후텍스쳐 마이크로 웰의 표면으로부터 약 1 내지 2 mm로 그 중간 레벨 서서히 볼륨이 충분히 낮아지면 유체 운동이 크게 감소 웰 (일측에 매체를 수집 플레이트를 기울여 드러내 점점 응집을 방지하기 쉽다는 ) 개별 마이크로 웰의 아웃. 천천히 잘 남아있는 매체를 피펫. </li></ol></li><li> 집계는 개별 마이크로 웰에 남아 확보하면서 신선한 1 단계 유도 매체를 추가하려면 다음과 P1000의 micropipettor와 함께 1 단계 유도 배지 1 ㎖을 그립니다. 우물의 안쪽 가장자리에 피펫 팁을 잡고 아주 천천히 잘의 내부 벽에 매체를 분배. 나머지 우물에 대해 반복합니다. </li><li> 3 일 저산소 조건에서 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다. </li></ol> 5. 심장 유도 2 단계 <ol><li> 하루에 4 일, 장소는 15 분의 최소 37 ° C의 물을 욕조에 (우물의 부피 = 수 × 2 ㎖) 매체를 씻는다. </li><li> (최종 농도 = 10 NG / ㎖) VEGF 원액의 2 μl를 추가, 전체 심장 유도 중간 ml의 당 0.5 ㎕를 IWP-2 : 2 단계 유도 중간 (우물 × 1 ml의 부피 = 수)의 필요한 양을 준비 주식 솔루션 (최종 농도 = 5 μM). 15 분의 최소 37 ° C를 물을 욕조에 준비된 2 단계 유도 매체를 넣습니다. </li><li> 5 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여 마이크로 웰 플레이트의 각 웰에서 집계를 수확하고 원뿔 튜브 (15 ML 튜브 당 10 우물까지 수집) 15 용액에 집계 정지를 수집합니다. </li><li> 집계가 저산소 배양기에서 15 분 동안 정착하도록 허용합니다. 참고 :이 단계는 그대로 집계에서 단일 세포와 세포 파편을 분리하는 것이 중요합니다. </li><li> 잔류 유도 사이토 카인을 제거하기 위해 미리 예열 워시 보통 10 ㎖의 집계를 조심스럽게 뜨는을 기음과 재현 탁 (예를 들면, 티빈 A는 심지어 매우 낮은 공에 강력한 신호 분자이다ncentrations). </li><li> 2 분 50 XG에서 집계를 원심 분리기. 뜨는을 대기음. 예비 가온이 유도 매체에 펠렛을 재현 탁 집합체. </li><li> 물론 당 1 ml의에서 24도 초저 첨부 파일 (ULA) 판에 집계 정지를 전송합니다. 유니폼, 꽉 세포 클러스터와 현미경으로 집계을 준수하십시오. 6 일까지 저산소 조건에서 품어. </li></ol> 6. 심장 유도 3 단계 <ol><li> 하루 6 일, 3 단계 유도 중간 (우물 × 1 ml의 부피 = 수) 필요한 볼륨을 준비합니다. 전체 심장 유도 중간 1ml를 들어, 2 μL VEGF 스톡 용액 (최종 농도 = 10 NG / ㎖), 및 bFGF의 스톡 용액 (최종 농도 = 5 NG / ㎖) 0.5 μl를 추가한다. 15 분의 최소 37 ° C를 물을 욕조에 준비 3 단계 유도 매체를 넣습니다. </li><li> 총 10 ㎖까지 풀링, 15 ml의 원뿔 튜브 응집체를 전송하는 데 5 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여튜브 당들. </li><li> 집계가 정착하는 10 분을 허용합니다. 뜨는을 기음과 미리 예열 3 단계 유도 중간에 집계를 재현 탁. 5 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여, 잘 당 1 ml의에서 24 웰 ULA 판으로 집계 재배포. </li><li> 10 일에, 3 단계 유도 중간 단계 6.1에 따라 (우물 × 1 ml의 부피 = 수) 필요한 볼륨을 준비합니다. </li><li> 튜브 당 집계 10 ㎖까지 풀링, 15 ML 원뿔 튜브 응집체를 전송하는 데 5 ml의에게 혈청 학적 피펫을 사용합니다. </li><li> 집계가 정착하는 10 분을 허용합니다. 뜨는을 기음과 3 단계 유도 중간에 집계를 재현 탁. 5 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여, 잘 당 1 ml의에서 24 웰 ULA 판으로 집계 재배포. </li><li> 이틀 동안 저산소증 조건 하에서 인큐베이션. 일 12 일 배양 기간의 나머지 (37 ° C, 20 % O 2, 5 % CO 2)에 대한 정상 산소의 산소 농도에서 세포를 배양하기. 노트:이 시점 후에, 세포가 더 이상 저산소증 조건 하에서 배양 없다. </li><li> 이 완전 배지 교환을 반복 세포 수확까지 14 일부터 4 일마다 (6.2 및 6.3 단계) (일반적으로, 피크 심근 농도는 차별화의 14 일 후 관찰된다). </li></ol> 심장 트로포 닌 T (cTnT를) 마이크로 웰 문화 출력의 발현 빈도 7. 유동 세포 계측법 분석 <ol><li> 다음과 같이 집계를 떼어 놓다 : <ol><li> 15 ML 원뿔 튜브에 집계 1도를 전송하는 데 5 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용합니다. 2 분 50 XG에서 집계을 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 대기음. </li><li> 집계에 갓 용해 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 유형 II 솔루션 1 ML을 추가합니다. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 집계 정지를 전송합니다. 실온에서 하룻밤 동안 콜라게나 제 II 형의 응집체 부화. </li><li> 다음 날, 부드럽게 집계를 떼어 놓다하기 위해 P1000의 micropipettor를 사용균질 한 단일 세포 현탁액. 집계가 쉽게 해리하지 않는 경우, 집계를 정착 뜨는을 대기음하고, 실온에서 1 ~ 2 분 동안 해리 효소의 700 μL의 집계를 품어. 조심스럽게 해리 할 수있는 P1000의 micropipettor으로 집계 1 ~ 2 번 피펫. </li><li> 해리 효소를 희석 : 1 ㎎ / ㎖ DNase의 원액 14 μl를 포함하는 세척 매체의 700 μl를 추가합니다. 2 분 동안 300 XG에 벤치 탑의 microcentrifuge를 사용하여 나머지 정지를 셀 수를 수행하고, 원심 분리하기 위해 10 μL 샘플을 가져 가라. </li></ol></li><li> 세포 계수를 수행하여 트리 판 블루 동량 10 μL 계산 샘플 얼룩과 혈구를 사용하여 계산. </li><li> 의 microcentrifuge에서 남아있는 세포를 포함하는 1.5 ml의 microcentrifuge 관을 제거합니다. 뜨는을 기음과 포함 행크스 균형 소금 용액에 100 μL 당 200,000 500,000 세포의 농도로, 세포를 재현 탁2 % 태아 소 혈청 (HF). </li><li> 각 조건을 위해, 세포 현탁액 100 ㎕ 당 웰을 96- 웰 플레이트 (하나의 웰은 cTnT의 항체로 염색되며, 다른 하나는 이차 항체 제어 것) 2 웰 옮긴다. </li><li> 2 분 동안 300 XG에 접시를 원심 분리기. 멀티 채널 micropipettor와 뜨는을 제거합니다. </li><li> 세포를 수정 : 잘 당 고정 솔루션 (키트의 구성 요소)의 200 μl를 추가하고 실온에서 15 분 동안 접시를 품어. </li><li> 2 분 동안 300 XG에 접시를 원심 분리기. 조심스럽게 우물에서 뜨는을 철회 멀티 채널 micropipettor를 사용합니다. 파라 포름 알데히드 폐기물 용기에 뜨는을 폐기하십시오. </li><li> 두 번 고정 된 세포를 씻으 : 각 웰에 HF 200 μl를 추가합니다. 2 분 동안 300 XG에 접시를 원심 분리기. 뜨는을 대기음, 한 번 더 세척 단계를 반복합니다. 고정 된 세포는 4 ° C에서 HF 최대 일주일 동안 저장 될 수있다. </li><li> 세포 Permeabilize 하시려면 : <ol><li> (300)에서 접시를 원심 분리기2 분 XG. </li><li> 각 웰에 Permeabilization 용액 (키트 성분) 100 ㎕를 추가하고 실온에서 5 분 동안 평판을 배양한다. </li><li> 2 분 300 XG에 접시를 원심 분리기와 뜨는을 대기음. </li></ol></li><li> 주어진 로트 번호에 대한 최적의 농도로 HF에 방지 cTnT의의 마스터 믹스를 준비합니다 (최적의 희석은 적정에 의해 결정되며 일반적으로 1 범위해야합니다 : 500 1 : 2,000). </li><li> 각 조건 (조건 당 2 웰)의 경우, 하나의 잘 (스테인드 샘플)과 다른 잘 (이차 항체 제어)에 일반 HF 100 ㎕에 마스터 믹스 100 μl를 추가합니다. 30 분 동안 4 ° C에서 세포를 품어. </li><li> 2 분 동안 300 XG에 세포를 원심 분리기. 뜨는을 대기음 잘 당 HF 200 μl를 추가합니다. 이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다. </li><li> 이차 항체의 마스터 믹스를 준비합니다. 마다 잘 100 μL에 해당하는 HF의 볼륨 (이차 항체 제어를 전송하고cTnT를 염색)의 치료를 받고. (: 200 희석 1) HF 200 μL 당 염소 항 - 마우스 - APC 차 항체의 1 μl를 추가합니다. </li><li> 샘플을 얼룩. 각 웰 (이차 항체 제어 및 안티 cTnT를 묻은 우물 둘 다) 염색 용액 100 μl를 추가합니다. 30 분 동안 4 ° C (photobleaching에 방지하기 위해 형광 차 항체를 추가 한 후 커버 플레이트 또는 어둠 속에서 유지)에 어둠 속에서 세포를 품어. </li><li> 2 분 동안 300 XG에 세포를 원심 분리기. 뜨는을 대기음 잘 당 HF 200 μl를 추가합니다. 이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다. </li><li> 분석 튜브 사이토 5 ㎖ 둥근 바닥 흐름 샘플을 전송 한 기기 (19)의 표준 프로토콜을 사용하여 APC 채널에서 신호에 대한 유세포 분석기를 수행한다. </li></ol>

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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+signaling+through+TGF&#946;+family+members+and+WNT+regulates+patterning+and+pancreatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells.">Stage-specific signaling through TGF&#946; family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Dev. Camb. Engl. 138, 861-871 (2011).</li><li>Niebruegge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+mesoderm+and+cardiac+cells+using+size-specified+aggregates+in+an+oxygen-controlled+bioreactor.">Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor.</a> Biotechnol. Bioeng. 102, 493-507 (2009).</li></ol>

M.U. has a financial interest in the underlying microwell technology.

이 다 능성 줄기 세포를 효율적으로 심장 분화가 매우 다양 과정임을 관찰되었다. 그것은 다른 세포주가 특정 세포 유형으로 분화 용량 변화 성향을 나타내는 것은 당연하지만, 이는 심장 분화 효율 동일한 세포주 (6)를 사용하여 실행 복제 사이 급격히 변동하는 것이 관찰되었다. 여기에 설명 된 프로토콜은 직접 집계 당 입력 세포 수를 제어함으로써 이러한 변화의 한 주요 원인을 해결합니다. 상기 런 사이 변동을 저감하기 위해서는, 단일 세포 계대하도록 hPSC 라인 능성 마커의 발현 빈도 (예를 들면, 인 Oct4, Nanog를에 대하여 더 일관 능성 인구 hPSC 확장 및 유지 보수의 결과,이 형태로 사용되는 것을 권장 TRA-1-60, 등.). 여기서 작성된 프로토콜은 O 1,000 세포 응집체 크기를 지정HES -2- 배아 줄기 세포주로부터 유도 ptimal 심장. 상이한 세포주에이 프로토콜을 적용하기 위해서는 초기 집합 크기 화면 세포주 별 최적의 응집체 크기를 결정하기 위해 수행되는 것이 중요하다. 직접적 여기 따라야 할 절차에 영향을주지 않지만, 우리는 산소 전달에 영향을 미치는 것으로 예상되는 골재의 크기와 전체 셀 밀도의 변화 리더 나게. 이 다운 스트림 애플리케이션에서 관련 고려 될 수 있습니다. 또한, 사멸 세포의 죽음은 하나의 세포에 hPSCs의 해리 동안 관심사입니다. 따라서, 그 ROCK 저해제는 마이크로 웰의 강제 세포 응집 동안 존재 확인하는 것이 중요하다. 마지막으로 분화 4 일에 집계가 아니라 이전에 유도 2 중간에서 재 부유로 유도 한 매체에 존재하는 추적 티빈을 제거하는 세척하는 것이 중요합니다. 분화 4 일 후에 티빈 A는 메소 희생 내배엽 분화를 촉진덤 유도 20. 이 기술의 주요 응용 프로그램은 효율적인 심장 분화를 촉진 집계 크기를 선별하는 것입니다. 그러나, 현재 기술의 한계 중 하나는 마이크로 웰 플레이트를 이용하여 임상 적으로 관련된 수준 심장 생산 스케일 도전된다는 것이다. 심장 차별화의 스케일 업 일반적으로 교반 서스펜션 생물 반응기 (21)의 대량 배양 조건에서 수행된다. 마이크로 웰 시스템이 효율적 심장 유도 골재 크기의 허용 가능한 범위를 결정하는 데 사용 된 후 따라서 확장하는 다음 단계는 원하는 세포 응집체 크기를 생성 할 수있는 바이오 리액터 임펠러 속도를 결정하는 것이다. 골재 기반 심장 분화하는 다른 방법에 대해 이러한 기술의 큰 차이의 하나는 집합체 내인성 신호의 변조에 영향뿐만 아니라 직접 조사를 가능하게한다는 것이다골재 (13) 내의 hPSCs와 유도 / 억제 조직 유형의 공동 배양. 조사 이러한 유형의 대규모 심장 생산 공정 개발을 알릴 수있다.

시험 관내 세포 배양에서 양식의 개수에 따라 수행 될 수 있지만, 일반적으로 이차원 부착 상태 이상을 완전히 생체 시스템에서 요점을 되풀이 입체 정지 조건 중 수행된다. 따라서 입체적인 조직 구조를 생성하기위한 강력한 방법을 개발하는 연구가 다양한 분야에서 증가 경향이있다. 세포 유형 및 프로세스가지지 세포 외 기질 (ECM)의 표면과의 밀착성 신호를 요구 시나리오에서는 삼차원 배양 세포 또는 매트릭스 1지지 외래에서 배양 스캐 폴딩 구조를 통해 활성화 될 수있다. 지지가 매트릭스의 접착을 필요로하지 않는 세포와 공정은 주로 또는 독점적 2,3- (다음 자신의 내인성 행렬을 생성하기 위해 진행할 수있다) 세포로 구성 unscaffolded 시스템으로 현탁액을 행할 수있다. 여기, 우리는 심장 차별화 O를위한 프로토콜을 제시F 인간 다 능성 줄기 세포 - 크기 조절, 유니폼, unscaffolded 집계에서 (hPSCs는 배아 또는 기타 소스에서 몸의 모든 세포 유형이 될 수있는 세포 여부를 줄기). 서스펜션 집계로 hPSCs의 차별화가 실행 내부와 실행 사이에 모두 집합 크기가 큰 변화에 의해 괴롭혀된다. 이 변화는 세포 콜로니의 기계적 분리를 포함 일반적으로 이러한 응집체를 생성하기 위해 사용 된 방법의 결과이다. 이 변동을 저감하기 위해 접근 방법이 당 총 셀의 개수뿐만 아니라 골재 직경의 균일 성을 제어하기 위해 사용되어왔다. 실시 예는 마이크로 원심 튜브 4 응집체의 형성을 포함하거나 걸려 5 삭제 같이 미세화하거나 세포의 원심 U- 또는 V 바닥 멀티 웰 플레이트 (7,8)으로 한 후 현탁액에 전송할 수 이차원 hPSC 콜로니 6 규정 9. 그러나, 이러한 모든 approaches 집계 세대의 낮은 처리량에 의해 제한됩니다. 음 기반 시스템은 V-저판 시스템과 유사한 방식의 마이크로 웰의 그러나 더 작은 크기를 채용 아니라 단일 배양 접시에서 균일 응집체 더 많은 수의 생성을 가능하게 (이 프로토콜에서 각각 400 ㎛의 폭을 갖는) 전체 V-바닥 판 (10)에서 생성되는 것보다 (포함 15.5 mm ~ 1,200 마이크로 웰 ~의 표준 직경). 음 계 응집체 형성이 11 내배엽 12 중배엽 13 배외 (extraembryonic) 14 운명 외배엽하는 hPSCs의 분화를 비롯한 여러 설정에 사용되었다; 중간 엽 줄기 세포 (15)에서 연골; 독성 학적 검사 (16)에 대한 균일 한 기판의 생성; 및 제어 공학 (17)의 조사. hPSC 유래 cardiom의 생산을위한 견고한 제조 프로토콜을 개발 한 주요 과제yocytes은 실행 사이의 심장 분화 효율 재현성의 부족이었다. 우리는 이전에이 변화는 내배엽 및 신경 분화 6,18과 관련된 유전자를 발현 모두 자기 갱신 hPSCs 및 분화 세포를 포함하는 시작 hPSC 인구의 이질성에 기인 할 수 있다는 것을 보여 주었다. 이러한 분화 세포에 의해 분비 신호는 심장 유도에 영향을 미친다. 신경 전구 세포가 심장 유도를 억제하면서 특히, 배외 (extraembryonic) 내배엽은 심장 유도를 촉진한다. hPSC 집계하면, 총 차별화 내의 세포와는 그래서 미분화 hPSCs은 골재 표면 (13)에 개발 배외 (extraembryonic) 내배엽 세포의 층으로 둘러싸여있다 정리할 수 있습니다. 응집체의 크기를 조절함으로써, 우리는 미분화 hPSCs (부피비 표면적)을 심장 유도 내배엽 세포의 비율을 조절하고, 최대 심장 유도 (13)이 비를 최적화 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>Biological safety cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (5 to 25 ml)&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aspirator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aspirator or Pasteur pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 and 50 ml conical tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fume hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m syringe filter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;sub&gt;,&lt;/sub&gt; and humidity controlled cell culture incubator&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Hypoxic (low oxygen) incubator</td></tr><tr><td>5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 20% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;sub&gt;,&lt;/sub&gt; and humidity controlled cell culture incubator&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low speed centrifuge with a swinging bucket rotor fitted with a plate holder&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2, P20, P200, and P1000 micropipettors and associated tips&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope with 4X, 10X and 20X phase objectives&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Low Attachment (ULA) 24 well plates&amp;nbsp;</td><td>Corning/Costar</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bench-top microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Ultrapure distilled water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 &amp;deg;C freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monothioglycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td>Toxic; Aliquoting of MTG is strongly recommended to minimize oxidation due to repeated opening. Aliquots can be stored at 4 &amp;deg;C for up to 3 months, -20 &amp;deg;C is recommended for long-term storage.</td></tr><tr><td>StemPro-34 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10639-011</td><td>Basal Cardiac Induction Medium; The supplement is stored at -20 &amp;deg;C and the basal medium at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Roche</td><td>10652202001</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>R&amp;amp;D Technologies</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;amp;D Technologies</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>R&amp;amp;D Technologies</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R&amp;amp;D Technologies</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Reagents Direct</td><td>57-G89</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15561</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>Corrosive</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12660</td><td></td></tr><tr><td>100x Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>100x L-glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563</td><td>Dissociation enzyme</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 400 plates</td><td>StemCell Technologies</td><td>27845</td><td>Microwell Plates</td></tr><tr><td>Aggrewell Rinsing Solution</td><td>StemCell Technologies</td><td>7010</td><td>Microwell Rinsing Solution</td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK Inhibitor</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate (for FACS staining)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intraprep Permeabilization Reagent</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM2389</td><td>Kit with 2 parts: Fixation Solution and Permeabilization Solution; Toxic</td></tr><tr><td>cTnT antibody</td><td>Neomarkers&amp;nbsp;</td><td>MS-295</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse-IgG APC antibodyThermoFisher</td><td>Molecular Probes</td><td>A865</td><td></td></tr><tr><td>5 ml round bottom flow cytometry tubes</td><td>FACS machine dependent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aggregate size optimization in microwells for suspension-based cardiac differentiation of human pluripotent stem cells

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates. Conventional aggregate formation of hPSCs involves dissociating cell colonies into smaller clumps, with size control of the clumps crudely controlled by pipetting the cell suspension until the desired clump size is achieved. One of the main challenges of conventional aggregate-based cardiac differentiation of hPSCs is that culture heterogeneity and spatial disorganization lead to variable and inefficient cardiomyocyte yield. We and others have previously reported that human embryonic stem cell (hESC) aggregate size can be modulated to optimize cardiac induction efficiency. We have addressed this challenge by employing a scalable, microwell-based approach to control physical parameters of aggregate formation, specifically aggregate size and shape. The method we describe here consists of forced aggregation of defined hPSC numbers in microwells, and the subsequent culture of these aggregates in conditions that direct cardiac induction. This protocol can be readily scaled depending on the size and number of wells used. Using this method, we can consistently achieve culture outputs with cardiomyocyte frequencies greater than 70%.

hPSCs 크기 조절 응집체 효과적으로 단 전지의 농도 및 마이크로 웰 표면적에 의존 마이크로 웰 시스템을 사용하여 형성 될 수있다. 짧은 원심 분리 후, 세포의 적절한 숫자 (이 프로토콜 1000)는 각각 마이크로 웰 (그림 1A)에 함께하게된다. 중요한 것은,이 세포는 24 시간 이내에 세포 내 연결을 다시 설정하고 더 이상 잘 채우기 없지만, 부드러운 가장자리 (그림 1B)와 소형 집계로 나타납니다. 이 집계는 심장 운명을 향해 더 차별화를위한 출발 물질을 제공합니다. 세포가 꽉 클러스터를 형성하지 않으면,이 가능한 세포 분리 및 재 응집 다음 죽음과 검사해야 특정 세포주 단일 세포 및 계대 ROCK 억제제 농도의 적합성을 시사한다. 마이크로 웰의 다음과 같은 세 가지 일 집계 모토에 약간의 변화를 보여말의 뜻은 약간의 성장은 분명하다,하지만. 마이크로 웰에서 제거 할 때, 단위는 라운드, 단단히 포장 형태를 유지하고 서로 (그림 1C)와 비슷한 크기 여야한다. ULA 24- 웰 플레이트의 배양은 상기 세포의 성장 및 팽창을 허용한다. 8 일째으로 첫 번째 티빈 신호와의 Wnt 억제에 노출 된 후, 집계는 크고 밝은 집계 (그림 1D)로 표시하기 시작합니다. 이 기간 동안 상당한 세포 파편을 각 웰의 바닥에 명백 할 것이다 집계 매체를 제거하기 전에 정착시킴으로써 제거되어야한다. 때때로, 많은 집계가 함께 융합 할 것이다. 이 &quot;슈퍼 집계가&quot;작은 집계에 보이는 형태 학적 변화를 전시하지 않는 경향이 완전한 차별화를받을 가능성이 적은 있지만, 이것은 물론 다른 골재의 분화를 억제하지 않습니다. FO &quot;jove_content&quot;유지 - together.within 페이지 =을 증가 크기와 조직 섬유 영역의 모양과 집계에 주목할만한 형태 학적 변화의 &quot;1&quot;&gt; 계속 분화의 결과. 12 일까지, 계약 집계는 관찰 할 수있다. 이들은 항상 큰 투명 세포로 구성 될 종종 집계 (그림 2) 외부의 광범위한 세포 외 기질이 포함됩니다. 총 전체의 수축이 성공적으로 차별화를 나타내는 반면, 심장 마커의 발현도 계약을 표시하지 않는 집계에서 관찰 할 수있다. 단위 및 immunolabeling의 분리 후, 세포의 대부분은 유동 세포 계측법에 의한 심근 마커 cTnT를 (그림 3)에 대한 긍정적 인 것입니다. 이 마커의 발현이 세포에서 안정하고 늦게 분화 19 일로서 응집체에서 관찰 될 수있다. 1.JPG &quot;/&gt; 그림 1 : hPSC의 타임 라인은 심장 운명을 향해 차별화 된 즉시 집계 한 후, 세포가 거의 각각의 마이크로 웰 (A)를 입력합니다.. 어느 날 후, 집계가 응축 나타납니다 부드러운 (B). 이 형태의 집합체가 마이크로 웰로부터 제거하고, 웰 플레이트 (C)에 도금되는 경우에도 지속. 8 일째으로 집계 확장하기 시작 및 색상 (D)에서 가벼운 나타납니다. 스케일 바 :. 250 μm의 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54308/54308fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54308/54308fig2.jpg" /> 그림 2 :. 심장 유도 3 단계 중간에 육일는 강력한 집계 차원의 수축이 관찰 한 후 집계는 (주 분화 (12)에 의해 상부 패널을 계약 시작 : 휴식ATION, 가운데 패널 : 수축). 하판은 검은 색 또는 흰색 (화살촉)로 나타나는 가장 중요한 차이점이 상부 및 중간 패널 감산으로부터 유도된다. 스케일 바 :. 250 μm의 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54308/54308fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54308/54308fig3.jpg" /> 그림 3 :. 하루에 17에서 차별화 된 hPSCs에서 심장 트로포 닌 T에 대한 Immunolabeling, 세포의 대부분은 유동 세포 계측법 (채워진 막대 그래프)에 의해 심장 트로포 닌 T에 긍정적이다. 또한 혼자 차 항체 (채워지지 히스토그램)으로 염색 된 세포가되어 도시. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54308/54308fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells

기존의 방법은 인간 만능의 서스펜션 집계를 기반으로 심장 분화 세포 (hPSCs) 골재의 크기와 모양에 대한 문화의 이질성으로 고생하는 줄기 시작합니다. 여기, 우리는 크기 조절 hPSC가 심장 촉진 조건에서 배양 집계 생성하는 마이크로 웰을 사용하는 심장 차별화를 위해 강력한 방법을 설명합니다.

인간 다 능성 줄기 세포의 서스펜션 기반의 심장 차별화를위한 마이크로 웰의 집계 크기 최적화

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates.  Conventional aggregate formation ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.7K 조회수.  University of Toronto.  기존의 방법은 인간 만능의 서스펜션 집계를 기반으로 심장 분화 세포 (hPSCs) 골재의 크기와 모양에 대한 문화의 이질성으로 고생하는 줄기 시작합니다. 여기, 우리는 크기 조절 hPSC가 심장 촉진 조건에서 배양 집계 생성하는 마이크로 웰을 사용하는 심장 차별화를 위해 강력한 방법을 설명합니다. 

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Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into all three germ layers. This makes them an attractive cell source for regenerative medicine and experimental modeling of normal and diseased organogenesis. However, the differentiation of hPSCs in vitro is heterogeneous and spatially disordered. Cell micropatterning technologies potentially offer the means to spatially control stem cell microenvironments and organize the resultant differentiation fates. Micropatterning hPSCs needs to take into account the stringent requirements for hPSC survival and maintenance. Here, we describe stencil micropatterning as a method that is highly compatible with hPSCs. hPSC micropatterns are specified by the geometries of the cell stencil through-holes, which physically confine the locations where hPSCs can access and attach to the underlying extracellular matrix-coated substrate. Due to this mode of operation, there is greater flexibility to use substrates that can adequately support hPSCs as compared to other cell micropatterning methods. We also highlight critical steps for the successful generation of hPSC micropatterns. As an example, we demonstrate that stencil micropatterning of hPSCs can be used to modulate spatial polarization of cell-cell and cell-matrix adhesions, which in turn determines mesoendoderm differentiation patterns. This simple and robust method to micropattern hPSCs widens the prospects of establishing experimental models to investigate tissue organization and patterning during early embryonic development.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have the intrinsic ability to differentiate and self-organize into distinct tissue patterns; although this requires the presentation of spatial environmental gradients. We present stencil micropatterning as a simple and robust method to generate biochemical and mechanical gradients for controlling hPSC differentiation patterns.

차별화 운명의 공간 조직을 프로빙에 대한 인간 다 능성 줄기 세포의 스텐실 미세화

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

연구

발생학

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

생체공학

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can trigger cerebellar dysfunction. Most of the current knowledge about disease-related neuronal phenotypes is based on postmortem tissues, which makes understanding of disease progression and development difficult. Animal models and immortalized cell lines have also been used as models for neurodegenerative disorders. However, they do not fully recapitulate human disease. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have great potential for disease modeling and provide a valuable source for regenerative approaches. In recent years, the generation of cerebral organoids from patient-derived iPSCs improved the prospects for neurodegenerative disease modeling. However, protocols that produce large numbers of organoids and a high yield of mature neurons in 3D culture systems are lacking. The protocol presented is a new approach for reproducible and scalable generation of human iPSC-derived organoids under chemically-defined conditions using scalable single-use bioreactors, in which organoids acquire cerebellar identity. The generated organoids are characterized by the expression of specific markers at both mRNA and protein level. The analysis of specific groups of proteins allows the detection of different cerebellar cell populations, whose localization is important for the evaluation of organoid structure. Organoid cryosectioning and further immunostaining of organoid slices are used to evaluate the presence of specific cerebellar cell populations and their spatial organization.

This protocol describes a dynamic culture system to produce controlled size aggregates of human pluripotent stem cells and further stimulate differentiation in cerebellar organoids under chemically-defined and feeder-free conditions using a single-use bioreactor.

인간 다능성 줄기 세포에서 성숙한 소뇌 오르가노이드의 확장 가능한 생성 및 면역 염색에 의한 특성화

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided a unique opportunity to study the complex interplay among different cardiovascular cell types that drives tissue development and disease. In the area of cardiac tissue models, several sophisticated three-dimensional (3D) approaches use induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) to mimic physiological relevance and native tissue environment with a combination of extracellular matrices and crosslinkers. However, these systems are complex to fabricate without microfabrication expertise and require several weeks to self-assemble. Most importantly, many of these systems lack vascular cells and cardiac fibroblasts that make up over 60% of the nonmyocytes in the human heart. Here we describe the derivation of all three cardiac cell types from iPSCs to fabricate cardiac microtissues. This facile replica molding technique allows cardiac microtissue culture in standard multi-well cell culture plates for several weeks. The platform allows user-defined control over microtissue sizes based on initial seeding density and requires less than 3 days for self-assembly to achieve observable cardiac microtissue contractions. Furthermore, the cardiac microtissues can be easily digested while maintaining high cell viability for single-cell interrogation with the use of flow cytometry and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq). We envision that this in vitro model of cardiac microtissues will help accelerate validation studies in drug discovery and disease modeling.

Here, we describe an easy-to-use methodology to generate 3D self-assembled cardiac microtissue arrays composed of pre-differentiated human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells. This user-friendly and low cell requiring technique to generate cardiac microtissues can be implemented for disease modeling and early stages of drug development.

인간 iPSC 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포를 사용하여 3D 심장 미세 조직 배열의 제조

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

미세 유체 플랫폼 내에서 3D 조직 된 인간 심장 조직 개발

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

Multititre 판 형식으로 인간 만능의 줄기 세포에서 뉴런의 신속하고 효율적인 생성

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

생물학

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We recently published a cost-effective strategy for the massive expansion of hiPSC-CMs in two dimensions (2D). Two major limitations are cell immaturity and a lack of three-dimensional (3D) arrangement and scalability in high-throughput screening (HTS) platforms. To overcome these limitations, the expanded cardiomyocytes form an ideal cell source for the generation of 3D cardiac cell culture and tissue engineering techniques. The latter holds great potential in the cardiovascular field, providing more advanced and physiologically relevant HTS. Here, we describe an HTS-compatible workflow with easy scalability for the generation, maintenance, and optical analysis of cardiac spheroids (CSs) in a 96-well-format. These small CSs are essential to fill the gap present in current in vitro disease models and/or generation for 3D tissue engineering platforms. The CSs present a highly structured morphology, size, and cellular composition. Furthermore, hiPSC-CMs cultured as CSs display increased maturation and several functional features of the human heart, such as spontaneous calcium handling and contractile activity. By automatization of the complete workflow, from the generation of CSs to functional analysis, we increase intra- and inter-batch reproducibility as demonstrated by high-throughput (HT) imaging and calcium handling analysis. The described protocol allows modeling of cardiac diseases and assessing drug/therapeutic effects at the single-cell level within a complex 3D cell environment in a fully automated HTS workflow. In addition, the study describes a straightforward procedure for long-term preservation and biobanking of whole-spheroids, thereby providing researchers the opportunity to create next-generation functional tissue storage. HTS combined with long-term storage will substantially contribute to translational research in a wide range of areas, including drug discovery and testing, regenerative medicine, and the development of personalized therapies.

Presented here is a set of protocols for the generation and cryopreservation of cardiac spheroids (CSs) from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured in a high-throughput, multidimensional format. This three-dimensional model functions as a robust platform for disease modeling, high-throughput screenings, and maintains its functionality after cryopreservation.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심장 스페로이드의 생성, 고처리량 스크리닝 및 바이오뱅킹

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...

iPSC에서 효율적인 인간 장 오가노이드 생성을 위한 매트릭스 비교

Comparative Study of Basement-Membrane Matrices for Human Stem Cell Maintenance and Intestinal Organoid Generation

Extracellular matrix (ECM) plays a critical role in cell behavior and development. Organoids generated from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are in the spotlight of many research areas. However, the lack of physiological cues in classical cell culture materials hinders efficient iPSC differentiation. Incorporating commercially available ECM into stem cell culture provides physical and chemical cues beneficial for cell maintenance. Animal-derived commercially available basement membrane products are composed of ECM proteins and growth factors that support cell maintenance. Since the ECM holds tissue-specific properties that can modulate cell fate, xeno-free matrices are used to stream up translation to clinical studies. While commercially available matrices are widely used in hiPSC and organoid work, the equivalency of these matrices has not been evaluated yet. Here, a comparative study of hiPSC maintenance and human intestinal organoids (hIO) generation in four different matrices: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB), and VitroGel (Matrix 4-XF) was conducted. Although the colonies lacked a perfectly round shape, there was minimal spontaneous differentiation, with over 85% of the cells expressing the stem cell marker SSEA-4. Matrix 4-XF led to the formation of 3D round clumps. Also, increasing the concentration of supplement and growth factors in the media used to make the Matrix 4-XF hydrogel solution improved hiPSC expression of SSEA-4 by 1.3-fold. Differentiation of Matrix 2-AB -maintained hiPSC led to fewer spheroid releases during the mid-/hindgut stage compared to the other animal-derived basement membranes. Compared to others, the xeno-free organoid matrix (Matrix 4-O3) leads to larger and more mature hIO, suggesting that the physical properties of xeno-free hydrogels can be harnessed to optimize organoid generation. Altogether, the results suggest that variations in the composition of different matrices affect stages of IO differentiation. This study raises awareness about the differences in commercially available matrices and provides a guide for matrix optimization during iPSC and IO work.

저자 스포트라이트: iPSC를 사용한 약물 개발을 위한 오가노이드 생성 발전

Organoids have become valuable tools for disease modeling. The extracellular matrix (ECM)&#160;guides cell fate during organoid generation, and using a system that resembles the native tissue can improve model accuracy. This study compares the generation of induced pluripotent stem cells-derived human intestinal organoids in animal-derived ECM and xeno-free hydrogels.

인간 줄기세포 유지와 장 오가노이드 생성을 위한 기저막 매트릭스의 비교 연구

Extracellular matrix (ECM) plays a critical role in cell behavior and development. Organoids generated from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) ...