This work is supported in part by American Heart Association Scientist Development Grant and NARSAD Young Investigator Award to Yingwei Mao.

참고 : 동물을 포함한 모든 프로토콜은 펜실베니아 주립 대학의 동물 관리 지침에 따라 추적 관찰, IACUC의 # 44057 1. 렌티 바이러스 생산 참고 : 형질 전날, LentiX-293 세포는 80 % 포화 상태에 있어야합니다. <ol><li> 단지 형질 전환 전에 DMEM으로 세포를 씻어 실온에서 5 분 동안 페니실린 (100 IU / ml) 및 스트렙토 마이신 (100 ㎕ / ml)이 DMEM / 10 % FBS의 10ml에 품어. </li><li> 1 분 동안 1 ㎖의 DMEM 소용돌이 : 3 비율 (PEI 3 μL의 1 μg의 DNA :) DNA와 폴리에틸렌 이민 (PEI) (1) (1 ㎎ / ㎖)을 희석. DNA의 체적은 DNA의 농도에 의존했다. 실온에서 10 분 동안 인큐베이션. <ol><li> 예를 들어, 접시 당 PEI의 60 μL 벡터 플라스미드의 10 μg의, psPax2 14 플라스미드의 5 μg의, 수 포성 구내염 바이러스 (VSV)의 5 μg의 구성 DNA 플라스미드의 20 μg의를 사용합니다. </li></ol></li><l난&gt; 1 분 동안 텍싱 다시 DNA와 PEI 솔루션을 섞는다. 실온에서 10 분 동안 인큐베이션. </li><li> DMEM (100mm 접시에 10 ml의 배지에 대한 예 1 ㎖) 총 배지의 1 / 10 볼륨. 접시에 드롭에 의해 DNA - 페이 혼합물 드롭 1 ㎖를 추가하고 문화 매체가 DNA와 잘 혼합 때까지 주위에 접시를 소용돌이 친다. </li><li> 실온에서 6 시간 동안 품어 뜨는을 제거합니다. 배지 5 mL를 추가합니다. </li><li> 형질 전환 후 48 시간은 50 ㎖ 튜브에 4 ℃에서 5 분 동안 627 XG에 바이러스 뜨는 스핀를 수집합니다. 초 원심 분리기 튜브에 0.45 ㎛의 주사기 필터를 통해 바이러스 상등액 30㎖의 필터. </li><li> 튜브를 밸런스, 파라 필름의 작은 조각 튜브를 충당하기 위해 멸균 물을 추가합니다. 스핀 튜브를 4 ℃에서 120 분 동안 11,249 XG에. 진공 팁을 사용하여 액체를 제거합니다. </li><li> 차가운 PBS 100 μL 튜브를 추가합니다. 조심스럽게 4 ° CO / N에서 튜브를 바위. </li><li> 바이러스, 피펫 (T)를 다시 일시 중단그는 PBS는 끝 펠렛을 만지지 않도록 조심하면서, 펠렛 10 배 이상 단계 1.8에서 추가. 이 작업이 완료 될 때까지 펠릿을 재현 탁하지 않는다. </li><li> -80 ° C에서 액체 질소 저장 튜브, 플래시 동결 당 10 ~ 20 μL에서 바이러스를 나누어지는. </li></ol> 2. 정위 주입 악기의 2.1) 준비 <ol><li> 이전에 수술 가위, 무딘 엔드 집게, 바늘 홀더, 메스, 면봉 한 쌍, 및 멸균 지표와 밀봉 팩에 천 및 오토 클레이브를 놓습니다. 또한, 10 %, 포비돈 요오드, 70 % 에틸 알코올, 흡수성 봉합사, 가열 패드, 인공 눈물을 구 유리 비드 살균기, 드릴, 드릴 비트,이 일회용 주사기, 주입 주사기, 전기 면도기, 진통 (케토 프로 펜), 마취제 (AVERTIN), 장갑, 및 주입 펌프 정위 장치. </li><li> 0.2 사용하여 멸균 후드에서 1.25 % AVERTIN 신선한 솔루션 그 날, 필터를 확인# 181; 멸균 주사기 필터를 M 및 멸균 혈청 유리 병에 넣습니다. 차 - 아밀 알코올 5 ㎖에 2,2,2- tribromoethyl 알코올의 2.5 g을 혼합 한 후 200 ml의 물에 용해. 5. 15 아래의 pH를 유지 </li></ol> 마우스 2.2) 준비 <ol><li> 마우스 (375 ㎎ / ㎏)의 중량을 기준 AVERTIN 관리]. 15 복강 내 (IP) 주입을 통해 AVERTIN와 마우스를 주사 한 후 완전 마취까지 다시 케이지로 놓는다. </li><li> IP 주입 (ketaprofen, 5 ㎎ / ㎏), 장소 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 인공 눈물을 통해 진통을 제공합니다. </li><li> 마우스가 자신의 발을 곤란에 의해 완전히 잠 들어 있는지 확인합니다. 마우스가 발 핀치에 응답하는 경우, 다음 (50 μL의 용량에) 더 많은 마취제를 제공합니다. 전기 면도기를 이용하여 마우스의 면도 헤드. (주둥이의 상단에, 일반적으로 그냥 귀 뒤에서)에 조작 할 수있는 지역 및 주변 지역을 면도. </li><li> 마우스 나 배치정위 장치 NTO. 전방 클램프에 앞니를 래치, 클램프를 낮추고 턱이 완전히 안전 있도록 조입니다. </li><li> 완전히 머리를 안정 외이도에 귀 막대를 삽입합니다. 내이가 손상 될 수있는, 너무 멀리에 귀 막대를 삽입하지 않도록주의하십시오. 완성되면, 마우스 본체는 헤드의 위치를​​ 방해하지 않고 약간 이동 될 수 있어야한다. </li><li> 절차 내내 쥐의 체온을 조절하기 위해 마우스 하에서 가열 패드를 배치. </li><li> 철저하게 수술 영역을 청소합니다. 면봉을 사용하여 수술 부위의 중앙으로부터 시작하여 바깥쪽으로 이동하는 원 운동을 10 % 포비돈 요오드를 문질러. 그 후, 동일한 방식으로 수술 부위에 70 %의 에틸 알코올을 문질러 면봉을 사용한다. 두 번 반복합니다. </li></ol> 2.3) 첫 번째 절개 <ol><li> 마우스가 수험 공부를하게되면, 멸균 장비 가방을 엽니 다. 변경 장갑 touchi 전에악기를 ng를. 멸균 천을 꺼내 천으로 악기를 배치합니다. 어떤 악기 않은 멸균 표면에 닿으면, 그것을 소독 15 초 동안 유리 구슬 살균기를 사용합니다. </li><li> 비 지배적 인 손에 지배적 인 손과 무딘 엔드 집게에 메스를 가져 가라. 무딘 엔드 집게로 부드럽게 그립 마우스의 피부를 사용하고, 메스를 사용하여 절개를합니다. 약 1.5 cm (코 쪽) 귀 위의 절개를 시작하고 귀 아래 약 0.5 cm로 확장 할 수 있습니다. (그림 1) 브레 그마 노출 마우스의 머리의 중앙에 수직으로 절개를 확장 할 수 있습니다. </li><li> 브레 그마가 가시화되면, 부드럽게 두개골의 표면을 덮고있는 피를 제거하는 살균면 팁을. 머리 피부 측으로 밀어 두면 끝을 사용한다. </li></ol> 2.4) 장비 설치 <ol><li> 모든 혈액 두개골 표면으로부터 제거되고 브레 그마가 분명히 가시화되면 (콘을 주사기를 준비10 8 TU 1 μL의 / ㎖, 볼륨)의 자기 중심. 흄 후드에서 바이러스와 주사기 주입되는 입력합니다. 기포 내부 없는지 확인합니다. 완전히 고정되어 있는지 확인하고, 정위 장치에 주사기를 놓습니다. </li><li> 멸균 주사기 바늘의 끝은 브레 그마의 교점과 라인 간가 설정되도록 그것이 바로 두개골 표면 위에까지 천천히 주사기를 낮출. 0으로이 점을 설정하고,이 시점에서 좌표를 결정합니다. </li><li> 관심의 뇌 영역에 따라, 정위 좌표를 변화한다. 뇌지도 책 (4)를 이용하여 이러한 좌표를 결정합니다. 좌표가 결정되면, 그 좌표에 일치하도록 주사기의 바늘을 움직인다. 좌표를 사용하여 치아 이랑을 대상 = +/- 1mm, A / P = -1.82 mm M / L. 구멍을 뚫어야 할 필요가있는 시각화하기 위해 두개골 위 오른쪽에있는 바늘을 낮 춥니 다. </li><li> 약간 주사기를 올려 드릴을 가지고 드릴 BI를 배치두개골에 약 45 ° 각도에서 대상 드릴 사이트 위의 T 오른쪽. 시추를 시작하고, 두개골 방법을 제공 할 때까지 시추를 유지한다. 두개골 방법을 제공하는 경우, 저항의 저하를 검출 할 수있다. 대뇌 피질의 손상을 방지하기 위해, 뇌에 드릴하지 않도록주의하십시오. </li><li> 멸균면 팁을 가지고 구멍에서 모든 피를 닦아. </li><li> 끝이 오른쪽 뇌 (안 두개골)의 표면에 앉아 있도록 주사기를 낮 춥니 다. D / V를가 뇌 아틀라스 좌표에 기초하여, 원하는 깊이까지 더 낮은 0 주사기 (깊이) 좌표를 설정한다. -1.79 mm로 치아 이랑, 설정 D / V에 도달합니다. </li><li> 0.2 μL / 분의 속도로 주사를 시작한다. 주사기가 원하는 깊이보다 낮은 슬립하지 않도록 손목 시계. 이 경우, 부드럽게 다시 원하는 깊이에 주사기를 올립니다. </li><li> 주입이 완료된 후, 잔여 바이러스가 흡수되었는지 확인 약 2 분을 기다린다. 천천히 주사기를 제기하고 리를 제거하기 위해면 팁을 사용주사 부위에서 파운드. </li><li> 다른 반구에 대해 반복합니다. </li></ol> 2.5) 봉합 <ol><li> 포장 및 그립에서 바늘 홀더를 사용하여 바늘을 멸균 봉합사와 바늘을 제거합니다. 떨어진 바늘 홀더 바늘의 날카로운 에지에 직면한다. 비 지배적 인 손에 무딘 엔드 집게를 잡고 마우스 그립 피부에 그것을 사용할 수 있습니다. 지배적 인 손으로 시작합니다. </li><li> 부드럽게 피부 봉합을 통하여 밀어 절개의 반대편에 피부를 잡아 무딘 단부 집게를 사용한다. 약 0.75 인치가 남을 때까지 통해 봉합사를 당깁니다. </li><li> 바늘의 이동을하자, 바늘 홀더 한 번 주위의​​ 봉합을 포장 무딘 엔드 집게를 사용하여, 다음, 바늘 홀더와 0.75 인치 나머지 봉합을 잡은 통해 봉합사를 당겨 바늘과 바늘 홀더 있도록 그들은 원래의되었던 것과 헤드의 대향 측에서 끝낸다. 이 매듭을 형성​​한다. </li><li> 이 단계를 반복합니다세 번 이상, 머리의 측면 번갈아 바늘 홀더는 각각의 시간에 끝난다. </li><li> 봉합사를 잘라 단계를 반복 2.5.1-2.5.3 절개를 닫을 때까지. </li></ol> 2.6) 수술 후 케어 <ol><li> 부드럽게 마우스의 귀 막대를 제거하고 전방 클램프에서의 턱을 제거합니다. </li><li> 이 깨어나서 자신의 주위에 이동 될 때까지 가열 패드에 마우스를 유지합니다. 매일 마우스를 모니터링하고 유지하며, 손질 먹거나 마시는하지 고통의 흔적에 대한 눈을 밖으로. 필요하다고 판단되는 경우 추가 진통제를주십시오. </li></ol> 3. 필드 테스트 3.1) 설정 <ol><li> 50cm 높은 벽, 크기 50cm X 50cm와 빈 사각형, 플라스틱 분야를 얻습니다 (하지만 약간 더 클 수 있습니다.) 실험을 시작하기 전에 70 %의 에틸 알코올과 아레나 청소. 에틸 알코올이 완전히 경기장에 마우스를 배치하기 전에 건조 가지고 있는지 확인하십시오. </li><li> 에 경기장을 배치바닥 및 조명은 그림자와 눈부심을 최소화하기 위해 설정되어 있는지 확인하려고합니다. </li><li> 추적 소프트웨어를 사용하는 경우, (마우스의 밝은 전망을 가지고 충분히 멀리 떨어져 전체 포함하는 전체 경기장,하지만 충분히 가까이), 오픈 필드의 직접 오버 헤드 열기 필드 위의 약 1.5 피트 카메라를 배치합니다. </li><li> 상자 (30cm X 30cm 약 지역)의 중심 영역을 설정합니다. (16), 시간대를 설정 측면 패널의 영역 (1) 탭을 클릭합니다. <ol><li> 상단 패널에서 모양의 윤곽을 선택하고 중앙 영역의 경계를 설명합니다. 영역을 추가 선택하고 중앙 영역의 내부를 클릭합니다. 프로그램 지시 사항을 사용하여 (이이 절차를 &quot;중심&quot;이라한다) 영역의 이름. 행동 테스트 손으로 득점 할 경우, 필드의 바닥이 테이프를 사용하여 표시, 10cm X 10cm 사각형으로 분할되어 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 소프트웨어를 설정 때문에 설정이 올바른지, 마우스가 쉽게 VISI입니다화면 BLE. 시험 분야 (조명) 및 마우스 컬러와 호환되도록 시스템에서 검출 설정을 조정하여이 작업을 수행. 참고 : 설정이 올 때, 시스템은 어떤 그림자 또는 소변 / 대변 만 마우스를 추적하고,해서는 안된다. 구체적인 소프트웨어 설정은 경기장 조명 및 마우스의 컬러에 의존한다. </li></ol> 3.2) 적응도 및 테스트 <ol><li> 주변 환경에 적응을하기 위해 시험 전에 행동 방 1 시간에 실험 쥐를 이동합니다. 순응에 대한 자신의 새장에 마우스를 둡니다. </li><li> 테이프에 카메라의 행동 작업을 켜고 마우스가 벽을 향하도록 경기장의 중앙 앞쪽으로 마우스를 놓습니다. </li><li> 5 분 타이머를 설정하고 멀리 경기장에서 단계. 가능하면 실수 마우스에 영향을주지 않도록하기 위해, 공간을 남겨. </li><li> 5 분가되면, 마우스를 제거하고 자신의 새장에 배치합니다. </li><li> 철저하게 다음 마우스로 진행하기 전에 현장을 청소하기 위해 70 %의 에틸 알코올을 사용합니다. 에틸 알코올이 완전히 건조 가지고 있는지 확인하십시오. </li></ol> 3.3) 점수 <ol><li> 네 발은 중간 30cm X 30cm의 내부에있을 때, 필드의 중심에있는 것으로 마우스를 고려한다. </li><li> 마우스 중심에서 소비하는 시간을 정량화. 또한,이 시간 (예 : Noldus의 ethovison 등) 추적 소프트웨어를 사용하여 결정합니다. <ol><li> 이렇게하려면 분석 탭으로 이동 및 분석 프로필에서 &quot;운동&quot;을​​ 클릭합니다. 현재 설정되어있는 카테고리를 삭제 한 다음 위치 탭에서 &quot;영역&quot;을 선택합니다. 중앙 영역을 선택합니다. 다음, 결과를 볼 수있는 (결과 탭에서) &quot;분석 출력&quot;을 선택합니다. 각각의 재판이 나타납니다 시간을 나열하는 표는 움직이지 보냈다. </li></ol></li><li> 그렇지 않으면, 손으로 OFT 점수. 오픈 필드는 OPE의 하단에 설명 (25) 10cm X 10cm 사각형이 있어야합니다N 필드 (AS 단계 3.1.3에 설명). 마우스는 경기장의 중심으로 항목 수에 더하여, 센터에서 소비하는 시간을 정량화. 16 참고 : 중앙 30cm X 30cm 지역은 열기 필드의 중심으로 간주됩니다. 마우스는 네 개의 발은 30 X 30cm 영역 내에있는 경우 중심 지역에 거주하는 것으로 간주된다. </li></ol> 4. 강제 수영 테스트 주 : 행동 작업 사이의 오일의 최소 허용합니다. 4.1) 설정 <ol><li> 2 L 명확한 버킷을 확보, 22 ° C의 물을 채우기. 테이블에 양동이를 놓고 조명은 그림자와 눈부심을 최소화하기 위해 설정되어 있는지 확인하려고합니다. </li><li> 추적 소프트웨어를 사용하는 경우, 직접 오버 헤드 버킷의 카메라를 배치합니다. </li><li> 소프트웨어를 설정 마우스가 화면에 쉽게 볼 수 있도록. </li></ol> 4.2) 적응도 및 테스트 <ol><li> 행동 소유주에 실험 쥐를 이동검사 전 OM 1 시간은 주변 환경을 적응한다. 순응에 대한 자신의 새장에 마우스를 둡니다. </li><li> 테이프에 카메라 행동 작업을 켭니다. 조심스럽게 물 물통의 중간에 마우스를 배치했다. 마우스를 떨어 뜨리지 않도록해야합니다. 천천히 마우스를 내려 전면 발을 먼저 물에 접촉하도록. 잠수에서 자신의 머리를 방지하기 위해주의해야합니다. </li><li> 6 분 동안 타이머를 설정하고 행동 영역에서 멀리 단계. </li><li> 6 분가되면, 버킷에서 마우스를 제거하고 자신의 새장에 다시 마우스를 배치하기 전에 물기를 닦아 낸다. </li></ol> 4.3) 점수 <ol><li> 수영 대 떠있는 시간을 정량화, (기본 설정해야합니다) Noldus에 의해 제안 추적 소프트웨어를 사용하는 경우, 11 % %의 부동을 설정합니다. </li><li> 추적 시스템을 사용하여 정량화하기 위해, 분석 탭으로 이동 및 분석 프로필에서 이동을 클릭합니다. 에, 현재 설정되어있는 카테고리를 삭제하고 이동 상태를 선택(개인 행동 아래) 왼쪽 패널. 11 %로 부동을 설정합니다. </li><li> 결과 탭에서, 트랙 시각화를 선택합니다. 결과를 볼 수있는 (결과 탭에서) 분석 출력을 선택합니다. 각각의 재판이 나타납니다 시간을 나열하는 표는 움직이지 보냈다. </li><li> 손 채점 경우, 마우스가 마우스가 움직이지 소비 시간의 수영이나 등산, 그리고 양을 소비 한 시간을 측정한다. 또한, 처음에 움직 레이턴시를 측정한다. 결과 섹션에서 그림 2를 참조하십시오. </li></ol>

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	<li>Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cre-transgenic+mouse+strain+for+ubiquitous+deletion+of+loxP-flanked+gene+segments+including+deletion+in+germ+cells.">A Cre-transgenic mouse strain for ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells.</a> Nucleic Acids Research. 23 (24), 5080-5081 (1995).</li><li>Hirrlinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-cre+complementation+indicates+coincident+activity+of+different+genes+in+vivo.">Split-cre complementation indicates coincident activity of different genes in vivo.</a> PLoS One. 4 (1), 1-10 (2009).</li><li>Fenno, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cells+with+single+vectors+using+multiple-feature+Boolean+logic.">Targeting cells with single vectors using multiple-feature Boolean logic.</a> Nature Protocols. 11 (7), 763-772 (2014).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in sterotaxic coordinates. , (2001).</li><li>Gould, T. D., Dao, D. T., Kovacsics, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mood+and+anxiety+related+phenotypes+in+mice:+the+open+field+test.">Mood and anxiety related phenotypes in mice: the open field test.</a> Humana Press. 42, 1-20 (2009).</li><li>Denenberg, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-field+behavior+in+the+rat:+W.0hat+does+it+mean.">Open-field behavior in the rat: W.0hat does it mean.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 159, 852-859 (1969).</li><li>Bogdanova, O. V., Kanekar, S., D&#8217;Anci, K. E., Renshaw, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+behavior+in+the+forced+swim+test.">Factors influencing behavior in the forced swim test.</a> Physiology &amp; Behavior. 118, 227-239 (2013).</li><li>Porsolt, R. D., Anton, G., Blavet, N., Jalfre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+despair+in+rats:+A+new+model+sensitive+to+antidepressant+treatments.">Behavioral despair in rats: A new model sensitive to antidepressant treatments.</a> European Journal of Pharmacology. 47 (4), 379-391 (1978).</li><li>Hunsberger, J., Dunman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+depression-like+and+anxiety-like+behavior.">Animal models for depression-like and anxiety-like behavior.</a> Nature Protocol Exchange. , (2007).</li><li>Hommel, J. D., Sears, R. M., Georgescu, D., Simmons, D. L., DiLeone, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+gene+knockdown+in+the+brain+using+viral-mediated+RNA+interference.">Local gene knockdown in the brain using viral-mediated RNA interference.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1539-1544 (2003).</li><li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+in+schizophrenia+1+regulates+neuronal+progenitor+proliferation+via+modulation+of+GSK3beta/beta-catenin+signaling.">Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling.</a> Cell. 136 (6), 1017-1031 (2009).</li><li>Clark, M. S., Sexton, T. J., McClain, M., Root, D., Kohen, R., Neumai, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+5-HT1B+receptor+in+dorsal+raphe+nucleus+using+herpes+simplex+virus+gene+transfer,+increases+anxiety+behavior+after+inescapable+stress.">Overexpression of 5-HT1B receptor in dorsal raphe nucleus using herpes simplex virus gene transfer, increases anxiety behavior after inescapable stress.</a> Journal of Neuroscience. 2 (11), 4550-4562 (2002).</li><li>Tasan, R. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+and+basolateral+amygdala+are+critical+sites+of+neuropeptide+Y/Y2+receptor-mediated+regulation+of+anxiety+and+depression.">The central and basolateral amygdala are critical sites of neuropeptide Y/Y2 receptor-mediated regulation of anxiety and depression.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6282-6290 (2010).</li><li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titration+of+lentiviral+vectors.">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protoc Hum Gen. 12 (12.10), (2007).</li><li>Carter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetizing+mice.">Anesthetizing mice.</a> Methods Mol Biol. 18, 135-136 (1993).</li><li>Alachkar, A., Jiang, D., Harrison, M., Zhou, Y., Chen, G., Mao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+EJC+factor+RBM8a+regulates+anxiety+behaviors.">An EJC factor RBM8a regulates anxiety behaviors.</a> Current Molecular Medicine. 13 (6), 887-899 (2013).</li><li>Bernal, J., Baldwin, M., Gleason, T., Kuhlman, S., Moore, G., Talcott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+rodent+survival+surgery.">Guidelines for rodent survival surgery.</a> Journal of Investigative Surgery. 22, 445-451 (2009).</li><li>Wahlsten, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+ready+for+testing.+Mouse+Behavioral+Testing:+How+to+use+mice+in+behavioral+neuroscience.">Getting ready for testing. Mouse Behavioral Testing: How to use mice in behavioral neuroscience.</a> Academic Press. , 133-141 (2011).</li><li>Kheirbek, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+control+of+learning+and+anxiety+along+the+dorso-ventral+axis+of+the+dentate+gyrus.">Differential control of learning and anxiety along the dorso-ventral axis of the dentate gyrus.</a> Neuron. 6 (77), 955-968 (2013).</li><li>Snyder, J. S., Soumier, A., Brewer, M., Pickel, J., Cameron, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+hippocampal+neurogenesis+buffers+stress+responses+and+depressive+behaviors.">Adult hippocampal neurogenesis buffers stress responses and depressive behaviors.</a> Nature. 476 (7361), 458-461 (2011).</li><li>Sik-Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+neuronal+vascular+endothelial+growth+factor+expression+by+cAMP+in+the+dentate+gyrus+of+the+hippocampus+is+required+for+antidepressant-like+behaviors.">Induction of neuronal vascular endothelial growth factor expression by cAMP in the dentate gyrus of the hippocampus is required for antidepressant-like behaviors.</a> Journal of Neuroscience. 29 (26), 8493-8505 (2009).</li><li>Miller, D. G., Adam, M. A., Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+by+retrovirus+vectors+occurs+only+in+cells+that+are+actively+replicating+at+the+time+of+infection.">Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (8), 4239-4242 (1990).</li><li>Rubinson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells,+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference.">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nature Genetics. 33, 401-406 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

성공적인 정위 주사는 세 가지 요소에 의존 : 바늘 (팁, 살아 마우스를 유지 (브레 그마의 교회법 및 간가 줄에 바늘의 끝을) 좌표에 대한 올바른 원점 설정, 영점에 대한 권리 깊이를 설정 다만) 뇌 조직의 외관을 터치. 마우스의 생존 능력은 중요하다. 수술 생존율은 마우스가 제대로 마취 적절한 진통제를 수신되어 있는지 확인하여 도움을받을 수 있습니다. 통증 수술 후 회복 나쁨의 주요 원인으...

그 유전자 조작이 용이하기 때문에 마우스 신경 생물학에서 널리 사용되어왔다. 유전자 녹아웃 기술은 각각의 유전 인자는 마우스 동작을 모양 방법을 연구 조사 할 수 있습니다. 또한, CRE-에 loxP 시스템은 조직 -을위한 유용한 도구를 제공하고, 다른 조직에서 유전자 기능을 연구하는 연구자 수 있습니다 생쥐의 유형 - 특정 유전자 녹아웃을, 세포. (1) 그러나, 실제로, CRE 프로모터의 발현 패턴을 제어하기 어려운 , 지금까지 많은 설립 CRE 드라이버는 특정 지역과 관련된 표현을 달성하지 않았습니다. 2,3 대안 적으로, 정위 주사 성인 쥐의 뇌의 특정 영역을 목표로하는 방법이다. 된 cDNA 또는 shRNA를 발현 유전자 조작 바이러스를 주입하여, 유전자 발현의 특정 지역과 관련된 변조를 달성 할 수있다. 각 마우스의 뇌의 크기가 다르지만, 뇌의 특정 영역의 위치는 정위 번호 좌표를 사용하여 결정될 수있다궁둥이 마우스 뇌의 두개골에 랜드 마크에서 설정합니다. 가장 일반적으로 사용되는 랜드 마크 브레 그마, 람다, 및 라인 간가있다. 뇌 아틀라스로부터 얻어지는 좌표를 사용하여, 각 뇌 영역의 4 정확한 위치는 안테 - 후방 (A / P), 내측 - 외측 (M / L)에 의해 식별 될 수 있고, 지느러미 - 복부는 (D는 / V)에서 축 브레 그마는 / 간가 라인 교차. 주사는 형광 현미경으로 확인 할 수 있도록 일반적으로 쥐의 뇌에 주입 바이러스는 하나 빨강, 또는 녹색 형광 단백질 (RFP 또는 GFP) 태그된다. 쥐의 행동 평가는 정신 질환의 기초 연구에 특히 필요하다. 환자의 정신 장애의 증상은 일반적으로 비정상적인 행동을 포함한다. 이러한 인간의 행동 중 일부는 진화 적으로 보존하고 직접 모방 및 마우스에서 관찰 할 수있다. 예를 들어, 우울증 행동 절망을 측정함으로써 마우스에서 모델링 될 수있다. 자주 우울증이있는 사람그들도 도움이 될 것입니다 아무것도 할 것처럼 EN은 결국 자살로 이어질 수있는 증상을 느낀다. 설치류, 이것은 물 풀에 떠 대 수영 마우스 (포기로 간주) 시간의 양을 측정 강제 수영 시험 (FST)를 사용하여 모델링 될 수있다. 이 패러다임은 항우울제와 표현형을 구출에 의해 검증된다. 처리되지 않은 대조군에 비해 훨씬 적은 시간 움직이지를 보낼 것입니다 항우울제를받은 7, 8, 9 마우스를. 다른 행동 테스트, 오픈 필드 테스트 (OFT) 마우스에서 운동을 평가하도록 설계되고, 별도로 마우스에서 불안 표현형을 분석하는데 사용될 수있다. 5,6이 시험은 그들이 가까이있을 때 마우스는 안전한 느낌 전제 소설 열기 필드에서 벽에. 그들은 호기심 동물로 야생 형 마우스는 결국, 새로운 환경을 모색 할 것입니다. 그러나, 필드의 중심에서 적은 시간을 소비하는 것은 마우스 initia를 극복 할 수 없게되므로, 마우스에 불안을 나타낸다L의 공포는 새로운 환경에 가져왔다. 열린 필드의 중심에서 필요한 시간의 양에 의해 정량화 마우스 불안은 많은 정신 질환에 존재하는 인간 임상 불안, 비교 될 수있다. 행동 패러다임 정위 주사의 조합은 타겟 뇌 영역에서 특정 유전자의 발현을 변경하는 신규 한 방법이다. 마우스 동작에 변조 된 유전자 발현의 효과는 결정될 수있다. 전뇌 녹아웃 대조적으로,이 방법은 특정 뇌 영역을 대상으로 특히 유용하다. 또한, 정위 주사는 일반적으로 성인 야생형 마우스에서 수행되며, 따라서, 내인성 유전자 발현이 발달 단계에 걸쳐 유지되었다. 유전자는 배아 발달 또는 출생 후의 단계에서 생존에 필요한 경우이 방법은 효과가 혼동을 방지한다. 하나의 주요 제한은 실험 쥐를 통해 서 갈 필요가 있다는 것입니다H 쥐의 두개골이 가지고있는 침습 수술은 열 수 있습니다. 또한, 유전자 조절의 정도는 바이러스의 역가 및 효율성에 의해 결정된다. 바이러스는 특별한기구를 필요로 정위 좌표를 이용하여 정확한 영역에 주입되어야한다. 정확한 주사 부위의 확인은 사후을 완료 할 수 있습니다. 이 방법은 이전에 각종 신경 질환에서 특정 유전자의 참여를 테스트하는 데 사용되어왔다. 예를 들어, 바이러스 성 매개의 RNAi가 (도파민 합성 할 수있다) 토륨 유전자를 타겟팅하는 흑색질의 compacta에 주입하고, 전위의 거동 분석을 수행 하였다. (10) 또 다른 연구가 관련 마우스의 행동을 평가 렌티 소음 DISC1의 정위 주사를 사용 정신 분열증에. DISC1의 최저은 새로움에 대한 응답으로 증가 운동을 주도 (평행 정신 분열증의 양성 증상), 그리고 더 큰 부동FST. (11)는 마찬가지로, 추가 연구는 5-HT (1B)의 과발현이, OFT 증가 탐색 행동이 방법을 사용하여 항 불안 표현형과 일치 주도 것으로 나타났습니다. (12) 정위 주사 CRE-에 loxP 생쥐에서 재결합을 유도하는 CRE 바이러스를 제공 할 수 있습니다 . 이 방법은 선택적으로 편도선에서 Y2 수용체 맥리의 terminalis의 침대 핵을 제거하기 위해 사용되었다. 행동 분석하면,이 마우스는 유전자가 중앙 편도체에서 삭제 된 항 우울 표현형을 찾았지만, 한 유전자가 기저 편도 또는 맥리의 terminalis의 침대 핵에 삭제없이 표현형. (13) 따라서,이 기술을 동물의 행동에 유전 적 효과를 연구 할 수있는 독특한 도구를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Stereotactic Apparatus item 51725</td><td>Stoelting co.</td><td>51725</td><td></td></tr><tr><td>Quintessential stereotaxic pump&amp;nbsp;</td><td>Stoelting co.</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Injection Styringe, 65 RN</td><td>Hamilton</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>PEI&amp;nbsp;</td><td>Polysciences Inc.</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Blunt end forceps</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder&amp;nbsp;</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Ram Products Inc</td><td>Microtorque control box, Tech2000 handpiece</td><td>with pedal</td></tr><tr><td>Glass bead sterilizer</td><td>Inotech&amp;nbsp;</td><td>IS-400</td><td></td></tr><tr><td>Absorbable sutures&amp;nbsp;</td><td>Unify</td><td>M-K518r19</td><td>Absorbable, reverse cutting</td></tr><tr><td>Cotton swabs</td><td>VWR</td><td>89031-270</td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Gaymar</td><td>T-pump TP-500 PN11184-000</td><td></td></tr><tr><td>Artificial tears</td><td>Rugby</td><td>NDC 0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>Disposable syringe</td><td>BD Syringe</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Cloth</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gloves&amp;nbsp;</td><td>Ansell</td><td>Senseitouch #7823</td><td></td></tr><tr><td>Avertin or other anesthetic</td><td>see recipe citation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen or other analgesic</td><td>see veternarian&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tracking software</td><td>Noldus</td><td>Ethovision XT</td><td></td></tr><tr><td>Tracking Camera</td><td>Noldus</td><td>Media Recorder</td><td></td></tr></tbody></table>

applying stereotactic injection technique to study genetic effects on animal behaviors

정위 주사는 쥐에서 대상 뇌 영역에 높은 역가의 렌티 바이러스를 전달하는 유용한 기술이다. 렌티 바이러스가 과발현 또는 뇌 조직에 큰 손상없이 비교적 집중된 지역에서 최저 유전자 발현 할 수 있습니다. 복구 후, 주입 된 마우스는 오픈 필드 테스트 (OFT)과 강제 수영 시험 (FST) 등의 다양한 행동 작업에 테스트 할 수 있습니다. OFT는 마우스 신규 오픈 필드의 중앙에 보내는 시간의 양을 측정함으로써 마우스에서 운동 및 불안 표현형을 평가하기 위해 디자인된다. 더 불안 마우스 대조군과 비교하여 신규 필드의 중심에서 상당히 적은 시간을 소요한다. FST 물 버킷에 넣고, 마우스가 움직이지 않는 경우에 소요되는 시간을 정량화하여 항 우울증 표현형을 평가한다. 항 우울 표현형을 가진 마우스는 동물을 대조군에 비해 훨씬 적은 시간 움직이지를 보낼 것입니다. 이 프로토콜의 목적은 아이돌을 사용하는 것행동 검사와 함께 렌티 바이러스의 eotactic 주입은 동물의 행동을 조절하는 방법을 유전 적 요인 평가합니다.

<html> 정확한 정위 주입 올바른 좌표를 설정하는 방법에 크게 의존. 바이러스를 주입하기 위해 사용되는 바늘의 팁은 브레 그마의 교차점 간가 라인 (도 1)에 직접적으로 설정되어야한다. 이것은 바늘이 올바르게 배치되어 있는지의 여부를 확인하기 위해 실체 현미경을 사용하는 것이 도움이된다. 현미경으로 보면 바이러스가 주입 된 경우, 그것이 브레 그마의 교차점 간가 라인에 바?...

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Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

렌티 바이러스는 cDNA를 표현 또는 shRNA를 생쥐의 특정 뇌 영역에서 유전자 발현을 조절할 수의 정위 주입. 여기, 우리는 오픈 필드 테스트 (OFT)과 강제 수영 시험 (FST)와 같은 행동 작업으로 정위 주사를 결합하는 프로토콜을 제시한다.

정위 사출 기술을 적용하는 것은 동물의 행동에 유전 적 영향을 연구하기

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

applying-stereotactic-injection-technique-to-study-genetic-effects-on

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Behavior

14.1K 조회수.  The Pennsylvania State University.  렌티 바이러스는 cDNA를 표현 또는 shRNA를 생쥐의 특정 뇌 영역에서 유전자 발현을 조절할 수의 정위 주입. 여기, 우리는 오픈 필드 테스트 (OFT)과 강제 수영 시험 (FST)와 같은 행동 작업으로 정위 주사를 결합하는 프로토콜을 제시한다. 

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Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an entire gene expression pathway by inducing destruction and/or inhibiting translation of these targets. Several miRNAs play key roles in maintaining neuronal structure and function and in higher-level brain functions, and methods are sought for manipulating their levels for exploring these functions. Here, we present a direct in vivo method for examining the cognitive consequences of enforced miRNAs excess in mice by stereotactic injection of miRNA-encoding virus particles. Specifically, the current protocol involves injection into the hippocampal CA1 region, which contributes to mammalian memory consolidation, learning, and stress responses, and offers a convenient injection site. The coordinates are measured according to the mouse bregma and virus perfusion is digitally controlled and kept very slow. After injection, the surgery wound is sealed and the animals recover. Lentiviruses encoding silencers of the corresponding mRNA targets serve to implicate the specific miRNA/target interaction responsible for the observed effect, with na&iuml;ve mice, mice injected with saline and mice injected with "empty" lentivirus vectors as controls. One month post-injection, the animals are examined in the Morris Water Maze (MWM) for assessing their navigation learning and memory abilities. The MWM is a round tank filled with colored water with a small platform submerged 1 cm below the water surface. Steady visual cues around the tank allow for spatial navigation (sound and the earth's magnetic field may also assist the animals in navigating). Video camera monitoring enables measuring the route of swim and the time to find and amount the platform. The mouse is first taught that mounting the hidden platform offers an escape from the enforced swimming; it is then tested for using this escape and finally, the platform is removed and probe tests examine if the mouse remembers its previous location. Repeated tests over several consecutive days highlight improved performance of tested mice at shorter latencies to find and mount the platform, and as more direct routes to reach the platform or its location. Failure to show such improvement represents impaired learning and memory and/or anxiety, which may then be tested specifically (e.g. in the elevated plus maze). This approach enables validation of specific miRNAs and target transcripts in the studied cognitive and/or stress-related processes.

MicroRNAs have significant roles in brain structure and function. Here we describe a method to enforce hippocampal miRNA over-expression using stereotactic injection of an engineered miRNA-expressing lentivirus. This approach can serve as a relatively rapid way to assess the in vivo effects of over-expressed miRNAs in specific brain regions.

의 정위 주입 MicroRNA의 발현 마우스 해마 CA1 영역으로 렌티 바이러스 및 행동 결과의 평가

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

연구

행동분석학

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes of interest allows for enhanced temporally- and regionally-specific control of gene deletion, compared to existing methods. While conditional deletion can also be achieved by mating mice that express Cre recombinase under the control of specific gene promoters with mice carrying a floxed gene, stereotaxic microinjection allows for targeting of discrete brain areas at experimenter-determined time points of interest. In the context of cocaine conditioned place preference, and other cocaine behavioral paradigms such as self-administration or psychomotor sensitization that can involve withdrawal, extinction and/or reinstatement phases, this technique is particularly useful in exploring the unique contribution of target genes to these distinct phases of behavioral models of cocaine-induced plasticity. Specifically, this technique allows for selective ablation of target genes during discrete phases of a behavior to test their contribution to the behavior across time. Ultimately, this understanding allows for more targeted therapeutics that are best able to address the most potent risk factors that present themselves during each phase of addictive behavior.

This article describes how to microinject viral vectors into mouse brain and then test in a conditioned place preference paradigm that includes an acquisition, extinction and reinstatement phase.

크레 재조합이 코카인 컨디셔닝 장소 환경에있는 표적 유전자의 역할을 연구하는 표현 바이러스 성 벡터의 정위 미세 주입

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

쥐 뇌 미세 주입은 분자 기판 동기를 행동을 연구하기 위해

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are particularly devastating, difficult to treat, and confer a poor prognosis. While the precise incidence of brain metastases in the United States remains hard to estimate, it is likely to increase as extracranial therapies continue to become more efficacious in treating cancer. Thus, it is necessary to identify and develop novel therapeutic approaches to treat metastasis at this site. To this end, intracranial injection of cancer cells has become a well-established method in which to model brain metastasis. Previously, the inability to directly measure tumor growth has been a technical hindrance to this model; however, increasing availability and quality of small animal imaging modalities, such as magnetic resonance imaging (MRI), are vastly improving the ability to monitor tumor growth over time and infer changes within the brain during the experimental period. Herein, intracranial injection of murine mammary tumor cells into immunocompetent mice followed by MRI is demonstrated. The presented injection approach utilizes isoflurane anesthesia and a stereotactic setup with a digitally controlled, automated drill and needle injection to enhance precision, and reduce technical error. MRI is measured over time using a 9.4 Tesla instrument in The Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumor volume measurements are demonstrated at each time point through use of ImageJ. Overall, this intracranial injection approach allows for precise injection, day-to-day monitoring, and accurate tumor volume measurements, which combined greatly enhance the utility of this model system to test novel hypotheses on the drivers of brain metastases.

Intracranial brain metastasis modeling is complicated by an inability to monitor tumor size and response to treatment with precise and timely methods. The presented methodology couples intracranial tumor injection with magnetic resonance imaging analysis, which when combined, cultivates precise and consistent injections, enhanced animal monitoring, and accurate tumor volume measurements.

두개 내 주입 및 자기 공명 이미징을 통해 뇌 전이를 모델링

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

암 연구학

Establishment of Orthotopic Patient-derived Xenograft Models for Brain Tumors using a Stereotaxic Device

The development of clinically relevant and reliable models for central nervous system (CNS) tumors has been pivotal in advancing the field of neuro-oncology. One of the most widely used techniques is the orthotopic intracranial injection, a method that allows investigating of tumor growth, invasion, and dissemination within a controlled setting. This technique involves transplanting tumor cells from a specific patient region into the corresponding anatomical site in an animal. By doing so, these orthotopic brain tumor models offer a unique advantage, as they more accurately replicate cancer's biological behavior and its interactions with the brain environment seen in human patients. This makes them especially valuable for preclinical therapeutic testing, where a close resemblance to the clinical scenario is essential for evaluating potential treatments. This protocol shares experiences in developing patient-derived xenograft (PDX) models for pediatric brain tumors, including diffuse midline glioma (DMG), glioblastoma (GBM), medulloblastoma, and ependymoma. This method delineates the procedure for conducting intracranial stereotaxic injections in mice, ensuring the correct targeting of the injection site within the brain. Additionally, we describe the post-procedural monitoring system employed to detect signs of successful tumor engraftment. Following tumor injection, a rigorous monitoring system is implemented to observe the animals for any signs of neurological impairment, behavioral changes, and/or weight loss, which are common indicators of tumor progression. This system allows for timely intervention and provides critical data regarding the tumor's growth dynamics. By refining these models and protocols, we aim to enhance the reliability and translational potential of preclinical studies, contributing to the development of more effective treatments for pediatric CNS tumors.

The development of orthotopic pediatric brain tumor models requires meticulous precision, using a stereotaxic device to implant cancer cells precisely. The methodology presented here outlines the steps involved in preparing brain tumor cells, performing intracranial injections, and implementing a post-operative monitoring system to assess brain tumor engraftment.

The development of clinically relevant and reliable models for central nervous system (CNS) tumors has been pivotal in advancing the field of ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

신생아 마우스 두뇌의 Striatal 세포에서 유전자 조작에 대 한 stereotaxic 수술

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

신경과학

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

마우스 뇌 슬라이스에 장거리 입력의 광유전학 자극을 위한 Vivo intracerebral 입체 전착성 주사

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain regions still presents a challenge, particularly when targeting brain structures along the midline. These challenges include avoiding of the superior sagittal sinus and third ventricle and the ability to consistently target selective and discrete brain nuclei. In addition, more advanced neuroscience techniques (e.g., optogenetics, fiber photometry, and two-photon imaging) rely on targeted implantation of significant hardware to the brain, and spatial limitations are a common hindrance. Presented here is a modifiable protocol for stereotactic targeting of rodent brain structures using an angled coronal approach. It can be adapted to 1) mouse or rat models, 2) various neuroscience techniques, and 3) multiple brain regions. As a representative example, it includes the calculation of stereotactic coordinates for targeting of the mouse hypothalamic ventromedial nucleus (VMN) for an optogenetic inhibition experiment. This procedure begins with the bilateral microinjection of an adeno-associated virus (AAV) encoding a light-sensitive chloride channel (SwiChR++) to a Cre-dependent mouse model, followed by the angled bilateral implantation of fiberoptic cannulae. Using this approach, findings show that activation of a subset of VMN neurons is required for intact glucose counterregulatory responses to insulin-induced hypoglycemia.

Described here is a stereotactic procedure that can target challenging and difficult-to-reach brain regions (due to spatial limitations) using an angled coronal approach. This protocol is adaptable to both mouse and rat models and can be applied to diverse neuroscientific applications, including cannula implantation and microinjections of viral constructs.

다목적 신경 과학 기술을 위한 적응가능한 각진 입체 적 접근 법

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain ...

Stereotaxic Intracranial Delivery of Chemicals, Proteins or Viral Vectors to Study Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is a progressive disorder traditionally defined by resting tremor and akinesia, primarily due to loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra. Affected brain areas display intraneuronal fibrillar inclusions consisting mainly of alpha-synuclein (asyn) proteins. No animal model thus far has recapitulated all characteristics of this disease. Here, we describe the use of stereotaxic injection to deliver chemicals, proteins, or viral vectors intracranially in order to mimic various aspects of PD. These methods are well-established and widely used throughout the PD field. Stereotaxic injections are incredibly flexible; they can be adjusted in concentration, age of animal used for injection, brain area targeted and in animal species used. Combinations of substances allow for rapid variations to assess treatments or alter severity of the pathology or behavioral deficits. By injecting toxins into the brain, we can mimic inflammation and/or a severe loss of dopaminergic neurons resulting in substantial motor phenotypes. Viral vectors can be used to transduce cells to mimic genetic or mechanistic aspects. Preformed fibrillar asyn injections best recapitulate the progressive phenotype over an extended period of time. Once these methods are established, it can be economical to generate a new model compared to creating a new transgenic line. However, this method is labor intensive as it requires 30 minutes to four hours per animal depending on the model used. Each animal will have a slightly different targeting and therefore create a diverse cohort which on one hand can be challenging to interpret results from; on the other hand, help mimic a more realistic diversity found in patients. Mistargeted animals can be identified using behavioral or imaging readouts, or only after being sacrificed leading to smallercohort size after the study has already been concluded. Overall, this method is a rudimentary but effective way to assess a diverse set of PD aspects.

We describe how to successfully inject solutions into specific brain areas of rodents using a stereotaxic frame. This survival surgery is a well-established method used to mimic various aspects of Parkinson's disease.

Parkinson's disease (PD) is a progressive disorder traditionally defined by resting tremor and akinesia, primarily due to loss of dopaminergic neurons in ...

마우스의 입체탁스 미세주입 정확도 최적화

Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their choice of stereotaxic injection parameters on mouse brain atlases or published materials that employed various populations/ages of mice and different stereotaxic equipment, necessitating further validation of the stereotaxic coordinate parameters. The efficacy of calcium imaging, chemogenetic, and optogenetic manipulations relies on the precise expression of reporter genes within the region of interest, often requiring several weeks of effort. Thus, it is a time-consuming task if the coordinates of the target brain region are not verified in advance. Using an appropriate dye instead of a virus and implementing cryosectioning, researchers can observe the injection site immediately following dye administration. This facilitates timely adjustments to coordinate parameters in cases where discrepancies exist between the actual injection site and the theoretical position. Such adjustments significantly enhance the accuracy of viral expression within the target region in subsequent experiments.

저자 스포트라이트: 입체택스 주입 및 비용 효율적인 염료를 통한 생쥐의 인지 장애 연구 가속화

The present protocol describes a practical strategy to expedite the verification step of stereotaxic injection coordinates before conducting viral tracing using dyes and frozen sections.

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their ...