Y.N.T. would like to acknowledge the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore for the financial support under the JCO CDA grant 13302FG063.

주의 : 사용하기 전에 모든 관련 화학 물질의 안전 보건 자료 (SDS)를 참조하시기 바랍니다. 약물 스크리닝 실험은 대량의 대응에 비해 추가 위험이있을 수 있습니다 나노 물질의 합성 및 처리를 포함한다. 확인하십시오 모든 필요한 통제 조치는 엔지니어링 컨트롤 (흄 후드) 및 개인 보호 장비 (PPE, 예를 들어, 안전 길이 바지, 폐쇄 발가락 신발, 내 화학성 장갑, 안전 고글)의 사용을 포함, 실험을하는 동안 연습을한다. 약물 검사 용 화학 시약 1. 준비 <ol><li> 금 나노 합성 전구체 <ol><li> 금 (III) 클로라이드 용액을 15 mm로 제조 초순수 6.9 ㎖에 금 (III) 클로라이드 용액 (99.99 % 미량 금속 기준으로, 묽은 염산 30 중량. %) 30 mg을 용해. 주의 : 금 염화물 용액은 부식성과 자극성이다. 눈과 피부에 직접 접촉을 방지하기 위해 적절한 개인 보호구를 착용 할 것. </li><li> 디초순수 1 ㎖의 HSA 또는 BSA의 ssolve 74 mg을 74 밀리그램 / 단백질 원액 ml의 준비를한다. </li></ol></li><li> 약액 <ol><li> 목적하는 약물의 양, 예를 들면, (a) 이부프로펜 1.9 ㎎, (b) 와파린 2.8 ㎎, (c) 페니토인 2.3 ㎎, 450 mm의 제조 DMSO 20 μL의 (d) 술 파닐 아미드 1.5 ㎎을 용해 약물 재고 솔루션. 주 : 이들 약물은 소수성이고 물에 난 용성이 때문에 DMSO 용매로서 선택된다. </li></ol></li><li> 기타 시약 <ol><li> NaOH 용액 1.5 M을 제조 초순수 10ml에 수산화 나트륨 펠렛을 600 mg을 녹인다. 우레아 수용액의 20 M을 제조 초순수 2 ㎖에 우레아 2.4 g을 용해. </li></ol></li></ol> 단백질 템플릿 형태 금 나노 2. 합성 <ol><li> HSA-주형 금 나노 (HSA-금 나노) <ol><li> 두 개의 개별 온도 제어 자기 교반에 두 개의 유리 병, 거기에 마이크로 자기 교반 막대를 포함하는 각을 배치rers. </li><li> 60 ° C로 한 마그네틱 스터 러의 온도를 설정하고, &quot;60 ℃&quot;로 그 위에 유리 바이알 라벨; 다른 자기 교반기는 그 위에 유리 바이알 &quot;RT&quot;로 표시되는 상온 (RT)에서 유지된다. </li><li> 단백질 주형 내부 금 이온의 밀봉을 허용하도록 HSA 용액 200 μL, 초순수 200 μL, 및 (달리 명시하지 않는 한 360 RPM으로 설정) 일정한 교반 하에서 각각의 바이알에 금 (III) 클로라이드 용액 200 μL를 추가한다. </li><li> 금 나노 결정을 형성 HSA의 환원 능력을 활성화하고 0 분으로 반응 시간을 기록하기 시작하도록 2 분 후에, 각각의 바이알에 NaOH 용액 20 μL를 추가한다. </li><li> 매 20 분, 384 웰 검은 판에 샘플의 각각의 솔루션의 50 μl를 그리는 마이크로 플레이트 리더와 발광 스펙트럼을 측정한다. 일반적인 스캔 설정 : - 850 nm의 λ 전 = 370 nm의은, λ EM은 410 =. </li><li> 100 분 후 자석 교반기를 중지합니다. </li><li> 싱크대에 흐르는 물에 유리 병을 쿨. 주의 : 유리 병이 뜨겁습니다. 연소를 방지하기 위해 내열 장갑을 착용 할 것. </li><li> 각 샘플은 다른 온도 조건에서의 Au 나노 결정의 형성이 반응 속도를 획득하기 위해 모든 시점에서 광전자 스펙트럼 플롯. </li></ol></li><li> BSA-주형 금 나노 (BSA-금 나노) <ol><li> 자기 교반기 위에 마이크로 자기 교반 막대를 함유하는 유리 바이알을 놓는다. 실내 온도와 같은 온도를 남겨주세요. </li><li> BSA 용액 200 μL, 우레아 200 μL, 일정한 교반하에 유리 바이알에 금 (III) 클로라이드 용액 200 μL를 혼합한다. </li><li> 2 분 후에, 금 나노 결정을 형성하기 위해 BSA의 환원 능력을 활성화하고 0 분으로 반응 시간을 기록하기 시작하는 NaOH 용액 20 μL를 추가한다. 시간당 반응 혼합물의 광전자 스펙트럼을 측정한다. 주 : BSA - 금 나노 결정의 광전자 스펙트럼을 측정덜 빈번 BSA - 금 나노 결정의 형성 비율 인해 우레아 이하의 효과를 동일 온도에서 HSA-Au로보다 느리게하기 때문에 단백질을 전개한다. </li><li> 7 시간 후 자석 교반기를 중지합니다. 요소의 변성에 의해 금 나노 결정의 형성 반응 속도를 볼 수있는 모든 시간에 광전자 스펙트럼을 플롯. </li></ol></li></ol> 3. 작은 분자 약물 검사 <ol><li> HSA에 다른 작은 분자 약물의 화면 상대 결합력 <ol><li> 다섯 유리 병, 온도 제어 멀티 자석 교반기 위에 거기에 자기 교반 막대를 포함하는 각 놓습니다. A, B, C로이 병에 레이블을 각 약물, 즉 이부프로펜, 와파린, 페니토인, 그리고 설파 닐 아미드에 대한 각각 거라고. 제어 순수한 HSA와 함께 한 레이블. </li><li> 각 바이알에 HSA 200 μl를 추가합니다. 네 대응하는 유리 병에 약액의 1 μl를 추가합니다. 컨트롤에 DMSO의 1 μl를 추가합니다. 교반기 전환하고 360 회전 속도를 설정RPM 및 HSA에 결합하는 약물을 완료 할 수 있도록 1 시간 동안 품어. </li><li> 1 시간 후, 밀리 Q 물 200 μL와 일정한 교반하면서 각각의 유리 병에 금 (III) 클로라이드 용액 200 μl를 추가합니다. 10 분 동안 일정하게 교반하면서 60 ℃로 온도를 설정합니다. 각 바이알에 1.5 M NaOH를 20 μl를 첨가하고 0 분으로 반응 시간을 기록하기 시작한다. </li><li> 신속하게 방출 스펙트럼을 (결과는 0 분으로 표시) 384 웰 블랙 플레이트에 각 바이알에서 용액 50 μL를 그리고 측정한다. 각 샘플마다 10 분의 발광 스펙트럼을 녹음. 네 개의 다른 시간에 적어도 네 개의 스펙트럼을 수집, 즉, 0, 10, 20, 및 30 분이다. </li><li> 일관된 추세에 결과를 얻기 위해 3.1.4 여러 번 - 반복 3.1.1 단계를 반복합니다. 자석 교반기를 중지합니다. </li><li> (- D 및 제어) 각 샘플에 대한 시간 - 분해 광전자 스펙트럼 플롯. 다이에서의 Au 나노 결정의 형성 반응 속도를 비교하는 시간에 대한 모든 샘플 플롯의 피크 강도를 파악fferent 약물로드 단백질 템플릿. </li></ol></li><li> HSA에 특정 약물의 결합 상수를 측정 <ol><li> 3.1.4 - 반복 3.1.1 단계를 반복합니다. (단 약물 로딩없이 HSA를 사용하여 제어 샘플 포함) 네 가지 농도에서 이부프로펜 솔루션 약물 솔루션을 교체합니다. 대응 약물 농도에 따른 유리 바이알에 라벨. </li><li> 10 분 후, 싱크대에서 흐르는 물에 유리 튜브를 냉각. 주의 : 유리 병이 뜨겁습니다. 연소를 방지하기 위해 내열 장갑을 착용 할 것. </li><li> 384 웰 검은 접시에 각각의 유리 병에서 위의 솔루션의 50 μL를 그리고, 발광 스펙트럼을 측정한다. </li><li> 다른 약물 농도 결과의 또 다른 두 세트를 얻기 위해 3.2.3 두 번 더 - 반복 3.2.1 단계를 반복합니다. </li><li> 자석 교반기를 중지합니다. 광전자 스펙트럼을 플롯 한 결과를 분석한다. <ol><li> 각각의 배치에서 얻어진 미가공 데이터를 위해, 각각의 광전자 스펙트럼 플롯소프트웨어 샘플 등 OriginPro의 소프트웨어와 같은 피크 강도를 찾을 수 있습니다. </li><li> 상대 형광 강도 계산 및 플롯 [(I 0 - I)을 / I 0] 나는 내가 각각 약물로드 HSA 순수한 HSA에 형성된 금 나노 결정의 형광 강도를 참조 0 약물 농도에 대하여. </li><li> 미카엘리스 - 멘텐 방정식을 사용하여 단일 부위 결합 모델에 데이터를 피팅함으로써 결합 상수를 계산한다 : R 최대가 최대 응답 신호가 나타내는 C / (K D + C) × Y = R 최대를, C는 리간드의 농도이고 D 및 K는 결합 상수이다. 이러한 OriginPro의 같은 소프트웨어에서이 작업을 수행합니다. 비선형 커브 피팅 피팅 메뉴 분석을 선택한 다음, 성장 / S 자형 범주에서 힐 기능을 선택합니다. 설정에서 : 기능 선택 페이지에서 장착 결과를 표시하는 맞춤을 클릭합니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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	<li>Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Solution-Based+Medicinal+Library+Screening+against+Human+Serum+Albumin.">High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin.</a> Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).</li><li>Vuignier, K., Veuthey, J. -. L., Carrupt, P. -. A., Schappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Analytical+Strategy+to+Measure+Drug&#8211;Plasma+Protein+Interactions:+From+High-Throughput+to+In-Depth+Analysis.">Global Analytical Strategy to Measure Drug&#8211;Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis.</a> Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).</li><li>Zsila, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdomain+Ib+Is+The+Third+Major+Drug+Binding+Region+of+Human+Serum+Albumin:+Toward+The+Three-Sites+Model.">Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model.</a> Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).</li><li>Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorine-NMR+Experiments+for+High-Throughput+Screening:+Theoretical+Aspects,+Practical+Considerations,+and+Range+of+Applicability.">Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).</li><li>Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).</li><li>Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+Design+of+Diflunisal+Analogues+with+Reduced+Affinity+for+Human+Serum+Albumin.">Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin.</a> J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+NMR-Based+Screening+with+Competition+Binding+Experiments.">High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).</li><li>Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correspondence+of+Fatty+Acid+and+Drug+Binding+Sites+on+Human+Serum+Albumin:+A+Two-Dimensional+Nuclear+Magnetic+Resonance+Study.">Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study.</a> Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).</li><li>Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Magnetic+Resonance+of+Hyperpolarized+Fluorine+for+Characterization+of+Protein&#8211;Ligand+Interactions.">Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein&#8211;Ligand Interactions.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).</li><li>Salvi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boosting+the+Sensitivity+of+Ligand&#8211;Protein+Screening+by+NMR+of+Long-Lived+States.">Boosting the Sensitivity of Ligand&#8211;Protein Screening by NMR of Long-Lived States.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).</li><li>Zsila, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+Dichroism+Spectroscopic+Detection+of+Ligand+Binding+Induced+Subdomain+IB+Specific+Structural+Adjustment+of+Human+Serum+Albumin.">Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin.</a> J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).</li><li>Navratilova, I., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragment+Screening+by+Surface+Plasmon+Resonance.">Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance.</a> ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+Phase+SPR+Biosensor+for+Efficient+Targeted+Drug+Screening+with+High+Sensitivity+and+Stability.">Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability.</a> Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).</li><li>Lu, Y., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-Nanometre+Sized+Metal+Clusters:+From+Synthetic+Challenges+to+The+Unique+Property+Discoveries.">Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries.</a> Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).</li><li>Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursor+Engineering+and+Controlled+Conversion+for+The+Synthesis+of+Monodisperse+Thiolate-Protected+Metal+Nanoclusters.">Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters.</a> Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).</li><li>Jin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+Sized,+Thiolate-Protected+Gold+Nanoclusters.">Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters.</a> Nanoscal. 2, 343-362 (2010).</li><li>Jiang, D. -. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Expanding+Universe+of+Thiolated+Gold+Nanoclusters+and+Beyond.">The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond.</a> Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).</li><li>Aikens, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+Structure+of+Ligand-Passivated+Gold+and+Silver+Nanoclusters.">Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters.</a> J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).</li><li>Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+Activities+of+Subnanometer+Gold+Clusters+(Au16&#8211;Au18,+Au20,+and+Au27&#8211;Au35)+for+CO+Oxidation.+ACS.">Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16&#8211;Au18, Au20, and Au27&#8211;Au35) for CO Oxidation. ACS.</a> ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).</li><li>Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione-Protected+Gold+Clusters+Revisited:+Bridging+the+Gap+between+Gold(I)&#8722;Thiolate+Complexes+and+Thiolate-Protected+Gold+Nanocrystals.">Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)&#8722;Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).</li><li>Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+the+Crystal+Structure+of+A+Thiol-Protected+Au25+Cluster+and+Optical+Properties.">Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Highly+Luminescent+Au22(SG)18+Nanocluster.">Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster.</a> J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+at+the+Core&#8211;Ligand+Interface+of+Au+Lipoic+Acid+Nanoclusters+That+Enhances+the+Near-IR+Luminescence.">Oxidation at the Core&#8211;Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence.</a> J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).</li><li>Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Atomic-Level+Strategy+for+Unraveling+Gold+Nanocatalysis+from+the+Perspective+of+Aun(SR)m+Nanoclusters.">An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters.</a> Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).</li><li>Niesen, B., Rand, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+Film+Metal+Nanocluster+Light-Emitting+Devices.">Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices.</a> Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).</li><li>Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-Small+Fluorescent+Metal+Nanoclusters:+Synthesis+and+Biological+Applications.">Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications.</a> Nano Toda. 6, 401-418 (2011).</li><li>Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasmall+Near-Infrared+Gold+Nanoclusters+for+Tumor+Fluorescence+Imaging+in+Vivo.">Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo.</a> Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).</li><li>Archana, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular-Receptor-Specific,+Non-Toxic,+Near-Infrared-Emitting+Au+Cluster-Protein+Nanoconjugates+for+Targeted+Cancer+Imaging.">Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging.</a> Nanotechnolog. 21, 055103 (2010).</li><li>Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave-Assisted+Synthesis+of+BSA-Protected+Small+Gold+Nanoclusters+and+Their+Fluorescence-Enhanced+Sensing+of+Silver(I)+Ions.">Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions.</a> Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).</li><li>Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+Nanocluster+Based+Fluorescent+Sensors+for+Highly+Sensitive+and+Selective+Detection+of+Cyanide+in+Water.">Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water.</a> 20, 951-1907 (2010).</li><li>Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+Tumor+Targeting+of+Renal-Clearable+Luminescent+Gold+Nanoparticles:+Long+Tumor+Retention+and+Fast+Normal+Tissue+Clearance.">Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).</li><li>Negishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Loading+of+Small+Aun+Clusters+(n+=+10&#8211;39)+onto+BaLa4Ti4O15+Photocatalysts:+Toward+an+Understanding+of+Size+Effect+of+Co-Catalyst+on+Water+Splitting+Photocatalytic+Activity.">Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10&#8211;39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity.</a> J. Phys. Chem. C. , (2015).</li><li>Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Directed+Synthesis+of+Highly+Fluorescent+Gold+Nanoclusters.">Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).</li><li>Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Stability+Induced+by+Ligand+Binding+Correlates+with+Changes+in+Protein+Flexibility.">Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility.</a> Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).</li><li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+Analysis+of+Ligand-Induced+Changes+in+Protein+Thermal+Unfolding+Applied+to+High-Throughput+Determination+of+Ligand+Affinities+with+Extrinsic+Fluorescent+Dyes.">Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes.</a> Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).</li><li>Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Based+Fluorescent+Metal+Nanoclusters+for+Small+Molecular+Drug+Screening.">Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening.</a> Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).</li><li>Shortridge, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover. , (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 방법으로 강조 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 다른 작은 분자 약물의 상대적 결합 친 화성을 심사의 프로토콜이 단계에서 3.1.2, 3.1.3 및 3.1.4은 상대 바인딩 강도 일관된 추세를 보여주는 좋은 결과를 얻을 중요하다. 이 단계에서, 측정 용 반응 액을 화학 물질을 첨가하여 드로잉 작업은 시간 지연 효과 및 일관성을 보장하기 위해 실시한다 측정 반응 액을 화학 물질을 첨가 및 도면의 동일?...

인간 혈청 알부민 (HSA)과 소 혈청 알부민 (BSA)와 같은 혈청 알부민은 혈장에서 가장 풍부한 단백질이고 혈액 구획의 삼투압을 유지하는데 중요한 역할을한다. 또한 스테로이드와 같은 낮은 수용해도의 소분자, 지방산, 갑상선 호르몬, 약물의 광범위한 담체 단백질로서 인식된다. 바인딩 재산권 알부민 혈청하는 이들 분자의 (예를 들어, 친 화성 또는 강도를 결합, 결합 부위)의 약동학에 중요한 주제를 형성한다. 1-4 여러 분석 방법과 같은, 알부민 혈청 상이한 약물의 결합 특성을 연구하기 위해 개발되어왔다 X 선 결정학, 5,6- 핵 자기 공명 (NMR), 7-11 및 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 12, 13 등 그러나, 이들 방법은 지루하고 시간 소모적 해석 처리 (하나에 의해 제한되는 예를 들면, X 선 crystallo위한 단결정 성장그래픽 연구), 전문 및 고가의 장비의 요구 사항 (SPR), 또는 검출을위한 비용이 많이 드는 동위 원소 표지 (NMR)을 필요로한다. 또한, 빨리 감기 직쇄, 비용 효율적인 방법으로 저분자 약물 스크리닝하는 다른 방법을 개발하는 것이 매우 바람직하다. 금 나노 클러스터 (금 나노)는 그들의 분리 및 크기에 의존하는 전자 구조, (18)에 그들은 광범위한 연구 관심을 받고있다 2 나노 미터. 14 ~ 17보다 작은 크기의 금속 원자의 수십 포함 된 나노 물질의 특별한 유형이다 20-23 이러한 독특한 재료의 특성, 특히 강한 형광이, 생물학적 시스템에서 감지 및 영상. 24-32 초소형 형광 금 나노 기능성 단백질을 사용하여 합성 할 수있는 등 다양한 응용 프로그램을 발견했다. (19)와 분자 등의 흡수 및 배출, 이러한 주형으로서 혈청 알부민 등. (33)의 전형적인 주형 단백질 합성<html> 금 나노 결정은, 금 염 일정량 제 단백질 안에 캡슐화되고이어서 단백질 자체에 의해 감소​​된다. 단백질의 환원 능력은 알칼리성 용액의 pH를 증가시킴으로써 활성화 될 수있는 기능성의 아미노산 잔기 (예를 들어, 티로신) 성분에 기인한다. 단백질 구조의 전개는 금 나노 결정의 형성을위한 중요한 단계로 고려된다. 전개 된 단백질, 더 환원 관능기 캡슐화 금 염에 노출 될 수 있기 때문이다. 단백질 변성제에 열처리 또는 노광에 의해 달성 될 수 흘러 가고. 작은 분자 약물의 도입은 또한 중간 변성 온도 및 전개의 엔탈피를 수정 즉 전개 과정에 영향을 미칠 수있다. (34, 35) 이러한 모든 요인의 효과를 차례로 형광 금 나노 결정의 형성 반응 속도에 의해 반사 될 수 있으며 각성 얻어진 금 나노 결정의 형광 강도. 36 e_content는 &quot;&gt;이 비디오는 높은 온도 (60 ℃)에서 약물 - 로딩 알부민 단백질의 Au 나노 결정을 합성 또는 변성제 (예를 들면, 우레아) 얻어진 금 나노 결정의. 형광 강도의 존재 하에서 약물의 스크리닝 방법을 보여 신호 판독이다. 먼저, 금 나노가 금 나노. 초의 형성 반응 속도에 영향을 미치는 단백질 (열처리 또는 변성제에 의해 유도) 흘러 가고 방법을 보여 60 ℃에서 또는 우레아의 존재하에 처리 된 HSA 및 BSA 템플릿에서 합성되어, 금 나노 결정은 다른 약제와 함께 미리로드 단백질 템플릿을 합성하고, 얻어진 금 나노 결정의 상대적 형광 농도의 약물 로딩 효과는 상대적인 결합 강도의 측정을 제공하는 연구된다. 마지막으로, Au로 NC 약물 선별 프로토콜을 위해 수정 될 고정 된 농도의 단백질에 사전로드 약물 함량을 변화시킴으로써 약물 - 단백질 결합 상수 (K D)의 정량적 측정.

<table><tbody><tr><td>Gold (III) chloride solution, 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484385</td><td>Corrosive, irritant</td></tr><tr><td>Human serum albumin, 96%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1887</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum albumin, 96%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Ibuprofen, 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4883&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>warfarin, 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2250</td><td></td></tr><tr><td>phenytoin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1139</td><td></td></tr><tr><td>sulphanilamide, 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9251</td><td></td></tr><tr><td>dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>IKA</td><td>RT5</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>384-well plate</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml air displacement pipette</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;#956;l air displacement pipette</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;#956;l air displacement pipette</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5,000 &amp;#956;l Eppendorf tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;#956;l Eppendorf tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;#956;l Eppendorf tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml micro tube</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml glass vial with screw cap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 ml glass vial with screw cap</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a rapid and quantitative fluorimetric method for protein-targeting small molecule drug screening

우리는 금 나노 결정에서 방출되는 차동 형광 신호에 기초하여 약물 - 로딩 단백질 내의 형광 금 나노 클러스터 (금 나노)를 형성함으로써 표적 단백질에 작은 약물 분자의 결합 친화도를 결정하기위한 새로운 약물 스크리닝 방법을 보여준다. 인간 혈청 알부민 (HSA)과 소 혈청 알부민 (BSA)과 같은 단백질은 알부민 단백질 모델로서 선택된다. 4 개의 작은 분자 약물 알부민 단백질에 다른 결합 친화도의 (예를 들어, 이부프로펜, 와파린, 페니토인 및 설파 닐 아미드)를 시험한다. 이는 변성 조건 (즉, 60 ° C 또는 우레아의 존재하에)하에 약물로드 알부민 단백질 내부 형광 금 나노 결정의 형성 비율은 (약물)없이 깨끗 단백질에 형성된 것보다 느리다는 것을 발견 하였다. 또한, 상기와 같은 나노 결정 형성의 형광 강도는 반비례 알부민이 단백질 약물의 결합 친화도에 상관 관계가 발견된다. 특히,금 나노 결정 형성 속도 느린 약물 - 단백질 결합 친 화성이 높은, 이렇게 얻어진 금 나노 낮은 형광 강도가 관찰된다. 얻어진 금 나노 결정의 형광 강도 테스트 따라서 다른 약물의 상대적인 결합 강도의 단순한 측정을 제공한다. 이 방법은 단순히 고정 된 단백질의 단백질 농도로 사전로드 약물 함량을 변화시킴으로써, 특정 약물 - 단백질 결합 상수 (K D)를 측정하기 위해 연장된다. 측정 결과는 다른 프레스하지만 더 복잡한 방법을 이용하여 얻어진 값과 잘 일치.

단백질의 반응성 작용기 (예를 들어, 티로신 잔기)가 캡슐화 된 금 이온을 감소시키고 이에 따라 금 나노 결정의 형성 비율을 가속 노출 될 수 있기 때문에, 전개 된 단백질들은 단백질 주형의 Au 나노 결정의 형성에 중요한 절차이다. 가열 및 외부 변성제는 단백질 전개 과정을 촉진하기 위해 두 가지 일반적인 방법이다. (1)는 모델 단백질로서 HSA를 사용하여, 금 나노 결정의 형?...

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A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

단백질 표적 소분자 약물 검사를위한 신속하고 정량적적인 형광 방법

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

a-rapid-quantitative-fluorimetric-method-for-protein-targeting-small

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K 조회수.  Agency for Science, Technology and Research (A*STAR). A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

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Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe validation. Methods that measure this phenomenon without modification of the protein target or small molecule are particularly valuable though technically challenging. The cellular thermal shift assay (CETSA) is one technique to monitor target engagement in living cells. Here, we describe an adaptation of the original CETSA protocol, which allows for high throughput measurements while retaining subcellular localization at the single cell level. We believe this protocol offers important advances to the application of CETSA for in-depth characterization of compound-target interaction, especially in heterogeneous populations of cells.

Measurements of drug target engagement are central to effective drug development and chemical probe validation. Here, we detail a protocol for measuring drug-target engagement using high content imaging in a microplate-compatible adaption of the cellular thermal shift assay (CETSA).

척도 부착 셀에 대상 참여를 이미징 높은 콘텐츠를 사용 하 여

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

연구

생화학

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known small molecule-protein interactions and to find potential protein targets for natural products. Compared with other methods, DARTS uses native, unmodified, small molecules and is simple and easy to operate. In this study, we further enhanced the data analysis capabilities of the DARTS experiment by monitoring the changes in protein stability and estimating the affinity of protein-ligand interactions. The protein-ligand interactions can be plotted into two curves: a proteolytic curve and a dose-dependence curve. We have used the mTOR-rapamycin interaction as an exemplary case for establishment of our protocol. From the proteolytic curve we saw that the proteolysis of mTOR by pronase was inhibited by the presence of rapamycin. The dose-dependency curve allowed us to estimate the binding affinity of rapamycin and mTOR. This method is likely to be a powerful and simple method for accurately identifying novel target proteins and for the optimization of drug target engagement.

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

In this study, we enhanced the data analysis capabilities of the DARTS experiment by monitoring the changes in protein stability and estimating the affinity of protein-ligand interactions. The interactions can be plotted into two curves: a proteolytic curve and a dose-dependence curve. We have used mTOR-rapamycin interaction as an exemplary case.

라파마이신/mTOR 상호 작용을 연구하기 위한 반정량적 약물 선호도 반응 형 표적 안정성(DARTS) 분석

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer composition). The utility of TSA, and specifically of nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF), has been established over the years, both for finding conditions that help stabilize a specific protein and for looking at ligand binding by monitoring changes in the apparent Tm. This paper presents an efficient screening of the Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) fragment library (768 compounds) by the use of nano-DSF, monitoring Tm to identify potential fragment binding. The prerequisites regarding protein quality and concentration for performing nano-DSF experiments are briefly outlined followed by a step-by-step protocol that uses a nano-liter robotic dispenser commonly used in structural biology laboratories for preparing the required samples in 96-well plates. The protocol describes how the reagent mixtures are transferred to the capillaries needed for nano-DSF measurements. In addition, this paper provides protocols to measure thermal denaturation (monitoring intrinsic tryptophan fluorescence) and aggregation (monitoring light back-scattering) and the subsequent steps for data transfer and analysis. Finally, screening experiments with three different protein targets are discussed to illustrate the use of this procedure in the context of lead discovery campaigns. The overall principle of the method described can be easily transferred to other fragment libraries or adapted to other instruments.

Monitoring changes in the melting temperature of a target protein (i.e., thermal shift assay, TSA) is an efficient method for screening fragment libraries of a few hundred compounds. We present a TSA protocol implementing robotics-assisted nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF) for monitoring intrinsic tryptophan fluorescence and light back-scattering for fragment screening.

단편 기반 리드 디스커버리에서 스크리닝을 위한 나노 차분 스캔 형광

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening (HTS) of random small molecule libraries against GPCRs is used by the pharmaceutical industry for target-specific drug discovery. In this study, an HTS was employed to identify novel small-molecule ligands of invertebrate-specific neuropeptide GPCRs as probes for physiological studies of vectors of deadly human and veterinary pathogens.
The invertebrate-specific kinin receptor was chosen as a target because it regulates many important physiological processes in invertebrates, including diuresis, feeding, and digestion. Furthermore, the pharmacology of many invertebrate GPCRs is poorly characterized or not characterized at all; therefore, the differential pharmacology of these groups of receptors with respect to the related GPCRs in other metazoans, especially humans, adds knowledge to the structure-activity relationships of GPCRs as a superfamily. An HTS assay was developed for cells in 384-well plates for the discovery of ligands of the kinin receptor from the cattle fever tick, or southern cattle tick, Rhipicephalus microplus. The tick kinin receptor was stably expressed in CHO-K1 cells.
The kinin receptor, when activated by endogenous kinin neuropeptides or other small molecule agonists, triggers Ca2+ release from calcium stores into the cytoplasm. This calcium fluorescence assay combined with a &#34;dual-addition&#34; approach can detect functional agonist and antagonist &#34;hit&#34; molecules in the same assay plate. Each assay was conducted using drug plates carrying an array of 320 random small molecules. A reliable Z&#39; factor of 0.7 was obtained, and three agonist and two antagonist hit molecules were identified when the HTS was at a 2 &#181;M final concentration. The calcium fluorescence assay reported here can be adapted to screen other GPCRs that activate the Ca2+ signaling cascade.

In this work, a high-throughput, intracellular calcium fluorescence assay for 384-well plates to screen small molecule libraries on recombinant G protein-coupled receptors (GPCRs) is described. The target, the kinin receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, is expressed in CHO-K1 cells. This assay identifies agonists and antagonists using the same cells in one "dual-addition" assay.

재조합 G 단백질 결합 수용체의 고처리량 스크리닝을 위한 "이중 첨가" 칼슘 형광 분석

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different tags, truncations, deletions, fusion partner insertions, and stabilizing mutations to find one that is not aggregated after extraction from the membrane. Furthermore, buffer screening to determine the detergent, additive, ligand, or polymer that provides the most stabilizing condition for the membrane protein is an important practice. The early characterization of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography provides a powerful tool to assess and rank different constructs or conditions without the requirement for protein purification, and this tool also minimizes the sample requirement. The membrane proteins must be fluorescently tagged, commonly by expressing them with a GFP tag or similar. The protein can be solubilized directly from whole cells and then crudely clarified by centrifugation; subsequently, the protein is passed down a size exclusion column, and a fluorescent trace is collected. Here, a method for running FSEC and representative FSEC data on the GPCR targets sphingosine-1-phosphate receptor (S1PR1) and serotonin receptor (5HT2AR) are presented.

The present protocol describes a procedure to perform fluorescent size exclusion chromatography (FSEC) on membrane proteins to assess their quality for downstream functional and structural analysis. Representative FSEC results collected for several G-protein coupled receptors (GPCRs) under detergent-solubilized and detergent-free conditions are presented.

형광 크기 배제 크로마토그래피를 통한 멤브레인 단백질 품질의 신속한 평가

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

면역학 및 감염병학

<meta charset="utf8"></head><body>Quantitative-Irreversible Tethering: 친전자성 리간드를 효율적으로 스크리닝

Covalent Fragment Screening Using the Quantitative Irreversible Tethering Assay

Compounds that form covalent bonds with specific target proteins offer a variety of advantages&#160;as chemical probes and therapeutic agents. Most commonly, mildly reactive, electrophilic small molecules are employed to form covalent bonds with select cysteine side chains in specific proteins. Electrophile-first approaches of ligand discovery, whereby a library of electrophilic small molecules are screened against a protein target, have become popular as they avoid the need for time-consuming downstream installation of an electrophilic warhead. Such screening is complicated, however, as electrophilic ligands can exhibit a wide range of different rates of spontaneous reaction with cysteines. Quantitative-irreversible tethering (qIT) offers a fluorescence-based method for hit identification and development that normalizes data for these differences in intrinsic compound reactivity. Rates of reaction of individual compounds with a target protein are determined and compared to compound reactivity with the unstructured tripeptide glutathione (this being a proxy for spontaneous compound reaction), enabling the identification of compounds that preferentially react with the protein of interest. This methodology has been successfully applied to identify selective covalent fragments against several drug targets, including SARS-CoV-2 main protease, cyclin-dependent kinase 2, and RAP27A. Here, we demonstrate the application of qIT to a target protein to generate a quantitative and robust data set, allowing prioritization of hit ligands for future development.

<meta charset="utf8"></head><body>정량적 비가역적 테더링 분석법을 사용한 공유 분절 스크리닝

The quantitative irreversible tethering (qIT) assay is a fluorescence-based method of identifying covalent fragments that selectively engage with a target protein. Here, a detailed protocol is outlined to describe the qIT assay, with example results included.

정량적 비가역적 테더링 분석법을 사용한 공유 분절 스크리닝

Compounds that form covalent bonds with specific target proteins offer a variety of advantages&#160;as chemical probes and therapeutic agents. Most ...

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation of the drug-protein interactions is highly desirable for not only understanding the molecular mechanisms underlying therapeutic efficacy but also for assessing drug characteristics, such as adsorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity (ADMET) for clinical use. Here, we present a biosensor-based high throughput strategy for the biopanning of T7 phage-displayed short peptides that can be easily displayed on the phage capsid. Subsequent analysis of the amino acid sequences of peptides containing short segments, as &#34;broken relics&#34;, of the drug-binding sites using bioinformatics programs in receptor ligand contact (RELIC) suite, is also shown. By applying this method to two clinically approved drugs, an anti-tumor irinotecan, and an anti-flu oseltamivir, the detailed process for collecting the drug-recognizing peptide sequences and highlighting the drug-binding sites of the target proteins are explained in this paper. The strategy described herein can be applied for any small molecules of interest.

This study aimed to present a strategy for identifying drug-peptide interactions. The strategy involves the biopanning of drug-recognizing short peptides based on a quartz-crystal microbalance (QCM) biosensor, followed by bioinformatics analysis for quantitatively assessing the information obtained for the drug recognition and annotation of the drug-binding sites on proteins.

약물 단백질 상호 작용의 글로벌 검증을 위한 바이오센서 기반 고처리량 바이오패닝 및 생물정보학 분석 전략

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

단백질 표적 소분자 약물 검사를위한 신속하고 정량적적인 형광 방법

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형광 크기 배제 크로마토그래피를 통한 멤브레인 단백질 품질의 신속한 평가

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

정량적 비가역적 테더링 분석법을 사용한 공유 분절 스크리닝

정량적 비가역적 테더링 분석법을 사용한 공유 분절 스크리닝

정량적 비가역적 테더링 분석법을 사용한 공유 분절 스크리닝

약물 단백질 상호 작용의 글로벌 검증을 위한 바이오센서 기반 고처리량 바이오패닝 및 생물정보학 분석 전략