We are grateful for the contributions of Yolanda Tafuri in optimizing conditions for SH-SY5Y differentiation, and for the support of Dr. Lynn Enquist, in whose lab this work was initiated. Y. Tafuri contributed the images shown in Figure 3. This work was supported by the NIH-NIAID Virus Pathogens Resource (ViPR) Bioinformatics Resource Center (MLS and L. Enquist) and K22 AI095384 (MLS).

1.一般的な考慮事項<ol><li>必要な試薬のリストについては、 マテリアル/機器の表を参照してください。厳格な無菌条件下で、すべての手順を実行します。 </li><li> FBSを含むすべてのメディアの準備のための熱不活性化ウシ胎児血清（hiFBS）を使用します。熱-不活性化するために、10分毎に反転、30分間56℃でFBS 50mlのアリコートを温める（ 表 1 参照）。 注：FBSを熱不活性化なしで使用される場合、上皮様表現型は、SH-SY5Y細胞の培養を通してより迅速に進行します。 </li><li>使用前に、メディアが温め、すべてのステップの前に、適切なpHバランスを確立するためのインキュベーターで平衡化することを可能にします。例えば、培地の50mlを完全に平衡化するのに約1時間かかり液（pH 7、37℃、5％CO 2）。 注：このプロトコルは、部分的に分化したSH-SY5Y細胞をトリプシン処理し、再メッキされている必要があり2段階の分割手順を使用しています。これはストレスが多いですこれらの非常に脆弱な細胞のためのプロセス。したがって、最小限の時間のために、トリプシンで細胞をインキュベートすることが重要です。これはまだ皿に付着した上皮様細胞を残して、ニューロンの優先リフトオフが可能になります。 </li><li>細胞を含有する円錐管の底部に対して先端と10ミリリットルプラスチックピペットでゆっくりと分化した細胞のトリチュレーションを実行します。上下ない、低速で5倍以上のトリチュレーションを実行しません。 </li></ol> SH-SY5Yメンテナンス文化の2パッセージ<ol><li>細胞が70-80％コンフルエントに達しており、10〜15継代を超えない分割維持培養。培養物は、典型的には、（培養が分裂中に以上の5倍に希釈されていないと仮定して）3〜5日毎に継代する必要があります。 </li><li> T-75フラスコから継代細胞に、約10ミリリットル1×PBSですすぎ、その後、メディアを吸引します。 注：私たちは、SH-SY5Yメンテナンスの文化のfuを分割することはお勧めしません。1よりrther：5継代の間には、これは、細胞が低い密集度のために死ぬことを引き起こす可能性があるため。 </li><li>吸引し、PBS、その後、2.5ミリリットル0.05％トリプシン-EDTA（1X）を追加します。 </li><li>インキュベーター2-3分でインキュベートし、フラスコの表面から細胞を解放するために穏やかに転倒。 </li><li> 10ミリリットルの基本的な成長培地を追加します（ 表2を参照）、1-2回粉砕します。 </li><li>千×gで2分間スピンダウンし、培地を吸引し、次いで5ミリリットルの基本的な増殖培地でペレットを再懸濁。 </li><li> T-75フラスコ内で、通常のめっき用20ミリリットルの全容量に5、または分化（第5節）のためにカウントし、プレート：3から1：1から細​​胞を希釈します。 </li></ol> 3.凍結SH-SY5Y細胞<ol><li> 5％（v / v）のDMSOを補充した基本的な増殖培地中でSH-SY5Y神経芽腫細胞の早期継代の凍結。 </li><li>当初は、長期保存のために液体窒素に転送した後、24時間-80℃でアリコートを凍結します。 注：参考のために、コンフルエント（75から85パーセント）T-75フラスコは、5を得られます凍結するSH-SY5Y細胞を1mlのアリコート。これらのアリコートのそれぞれが総どこでも2から5万個の細胞が含まれている必要があります。 </li></ol> 4.解凍と文化未分化SH-SY5Y神経芽腫細胞<ol><li>基本的な増殖培地を準備します。 </li><li>急速に37℃の水浴（約2分）で凍結細胞を解凍します。 </li><li> 15ミリリットルコニカルチューブ内の9ミリリットルの基本的な増殖培地中で細胞を再懸濁し、そしてその後、千×gで2分間遠心します。 </li><li>吸引し、ペレット化した細胞を妨害し、そして穏やかに10ミリリットルの基本的な増殖培地中で細胞を再懸濁させないように注意しながら上清。 </li><li> T-25フラスコまたは60ミリメートル2皿にプレート細胞。 </li><li>次の日は、死んだ細胞を除去するためにメディアを交換してください。 </li></ol> 5. 0日：分化のためのめっきセル<ol><li>分化スケジュールについては、図1を参照してください。 </li><li> 1×PBS、吸引と未分化細胞をすすぎ、その後、温めた1〜2ミリリットルを使用してトリプシン処理1倍、0.05％トリプシン-EDTA。 </li><li>細胞はトリプシンである場合に、インキュベーター内で約3分間インキュベートします。 </li><li> 、10ミリリットルの基本的な成長培地を添加することにより、トリプシンをクエンチフラスコまたは皿の側面を洗い流し、そして穏やかに1-3回を粉砕します。 15ミリリットルコニカルチューブにコンテンツを転送します。 </li><li>千×gで2分間遠心分離し、ペレットを乱さないように注意しながら、メディアを吸引除去します。 </li><li> 5ミリリットルの基本的な増殖培地で再懸濁ペレットと1-3回粉砕します。 </li><li> 50,000細胞/ mlに基本的な増殖培地を用いて希釈した後、血球計数器を用いて細胞数を計測します。 </li><li>プレート2皿当たり100,000細胞の合計のための35ミリメートル2ディッシュあたりの細胞mlのインキュベーターに戻し置きます。 </li></ol> 6. 1日目：メディアの変更（分化メディア＃1） <ol><li>分化メディア＃1のアリコート50mlを（ 表2を参照）、37℃の水浴中でインキュベートします。 </li><li>メディアが温められたとき、それは培養器に平衡化させる（37°Cで、5％CO 2）は、少なくとも1時間、使用前に適切なpHバランスを確立します。 </li><li>レチノイン酸（RA）を追加し、すぐに皿にメディアを追加する前に温めし、平衡化した培地（ 表1参照 ）。 注：レチノイン酸は光に敏感であり、4℃で暗所瓶に保存する必要があります</li><li>ゆっくり古いメディアをオフに吸引し、廃棄します。 </li><li> 35ミリメートル2ディッシュあたりRAに2ミリリットル分化メディア＃1を追加し、インキュベーターに戻します。 </li></ol> 7. 3日目：メディアの変更（分化メディア＃1） <ol><li>繰り返しセクション6（1-5ステップ） </li></ol> 8. 5日目：メディアの変更（分化メディア＃1） <ol><li>繰り返しセクション6（1-5ステップ） </li></ol> 9. 7日目：セルの分割1：1 <ol><li>すぐに料理にメディアを追加する前に分化メディア＃1を温めて、平衡化するためにRAを追加します。 </li><li>ゆっくり古いメディアをオフに吸引し、廃棄します。 </li><li> 200μLを加えます35ミリメートル2ディッシュあたり0.05％の1xトリプシンEDTAを温め、約2〜3分または細胞までは目に見えて、顕微鏡下で観察されるようにプレートから持ち上げられるインキュベーターで暖かいです。 </li><li> 35ミリメートル2皿あたりRAに2ミリリットル分化メディア＃1を追加することにより、トリプシンをクエンチ そしてプレートから残りの神経細胞を洗浄するためにメディアを使用しています。次いで、50mLのコニカルチューブにコンテンツを転送します。 注意：トリプシン処理手順の間に、一度にあまりにも多くの料理をトリプシン処理しません。これは、神経細胞培養は、細胞毒性であることができる、あまりにも長い間、トリプシン中でインキュベートされないことを保証するのに役立ちます。 </li><li> 50ミリリットルコニカルチューブに最大10個の皿からのコンテンツを組み合わせて、静かにアップなしの5倍以上ダウン10ミリリットルプラスチックピペットでゆっくりと摩砕。 </li><li> 35ミリメートル2新鮮な料理とインキュベータへの復帰へのアリコート2ミリリットルの細胞懸濁液。 </li></ol> 10. 8日目：変更メディア（分化メディア＃2） <ol><li> RAを追加します（参照&lt;すぐに料理にメディアを追加する前にメディアを温めて、平衡化するための強力な&gt;表1）。 </li><li>ゆっくり古いメディアをオフに吸引し、廃棄します。 </li><li>ゆっくりと2 mLの分化メディア＃2を追加します（ 表2参照 ） 35ミリメートル2皿当たりRAと、インキュベーターに戻します。ニューロンは、彼らはすぐに乾燥させることができるように長期間にわたって大気に曝されないようにしてください。 </li></ol> 11. 9日目：細胞外マトリックス（ECM）を準備コートディッシュ<ol><li>氷上でECMソリューションの1つのバイアルを解凍し、1を希釈：100を冷たいDMEMに。 </li><li>各35ミリメートル2皿に混合物の2ミリリットルを分配し、皿のベース全体が覆われていることを確認します。 </li><li>一晩で1時間またはインキュベーター（37℃、5％CO 2）内の場所。 </li><li>吸引した混合物とフードで約1時間、空気乾燥させ。最大2ヶ月間室温で保管してください。 </li></ol> 12日10：転送細胞にECMコーティングプレート1：1 <ol><li> RAを追加直ちに皿にメディアを追加する前に温めし、平衡化した培地（ 表1参照 ）。 </li><li>静かにメディアをオフに吸引し、廃棄します。 </li><li>各35ミリメートル2皿にトリプシン温め200μlを添加して、約1〜2分間、またはニューロンが目に見えて、顕微鏡下で観察されるように皿から持ち上げられるまで室温でインキュベートすることができます。 注：トリプシンニューロンを過剰インキュベートし、損傷が発生しないように室温でこのトリプシン処理ステップを実行します。ニューロンは、この段階で上皮様細胞よりもはるかに高速プレートから離します。 </li><li> 35ミリメートル2皿当たり2ミリリットル分化メディア＃2を追加することにより、トリプシンをクエンチし、プレートから残りの神経細胞を洗浄するためにメディアを使用しています。次いで、50mLのコニカルチューブにコンテンツを転送します。 </li><li> 50ミリリットルコニカルチューブに最大10個の皿からのコンテンツを組み合わせて、優しくまでととせいぜい5回上下にゆっくりと粉砕します10ミリリットルプラスチックピペット。 </li><li> ECMコーティングされた35ミリメートル2皿に2ミリリットルの細胞懸濁液を分注し、インキュベーターに戻します。 </li></ol> 13.日11：メディアの変更（分化メディア＃3） <ol><li> RAを追加直ちに皿にメディアを追加する前に温めし、平衡化した培地（ 表1参照 ）。 </li><li>ゆっくり古いメディアをオフに吸引し、廃棄します。 </li><li>ゆっくりと35ミリメートル2ディッシュあたりRAと（ 表2参照 ）2ミリリットル分化メディア＃3を追加し、インキュベーターに戻します。ニューロンが長時間空気中に露出することはできません。 </li></ol> 14日14：メディアの変更（分化メディア＃3） <ol><li>繰り返しセクション13（1-3ステップ） </li></ol> 15.日17：最後のメディアの変更（分化メディア＃3） <ol><li>繰り返しセクション13（1-3ステップ） </li></ol> 16.日18：使用する準備ができて神経細胞培養<ol><li>新鮮な差分にメディアを変更3日ごとにRAとerentiationメディア＃3は、ニューロンの健康を維持します。 注：細胞は、神経細胞に分化し、神経細胞の表現型を示すべきです。培養物は、しかし、ニューロンの生存率の持続時間は分化の開始時に未分化細胞の継代回数に依存して、最終分化次の14日まで一般的に安定しています。高い継代数は、より短い耐用寿命と分化したニューロンをもたらします。 </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

上記のプロトコルは、均質かつ実行可能な人間の神経細胞培養を生成するための簡単​​で再現性のある方法を提供します。このプロトコルは、いくつかの以前に公開された方法1-4を統合手法と実践を利用し、それぞれのベストプラクティスを描写することを目指しています。 SH-SY5Y細胞の分化は、緩やかな血清欠乏に依存しています。レチノイン酸、神経栄養因子および細胞外マト...

ビトロモデル系で使用する能力は、神経生物学と神経科学の分野を大幅に強化しました。培養中の細胞は、タンパク質の機能と特定の現象の根底にある分子メカニズムを特徴づけるために病気や感染症の病態を理解するために、予備薬物検査の評価を実施するための効率的なプラットフォームを提供します。神経生物学では、細胞培養モデルの主要なタイプは、ラットB35細胞5、ニューロ2Aマウスセル 6、およびラットPC12細胞を7としてラットおよびマウス、および神経芽細胞腫細胞株に由来する初代神経細胞培養物を含みます。このような細胞株の使用が大幅にフィールドを進めているが、非ヒト細胞および組織を処理に関連するいくつかの交絡因子が存在します。人間と比較した場合、これらは理解種特異的代謝過程の違い、病気の症状、および病原性の表現型が含まれます。ことに注意することも重要です再齧歯類モデルおよび経路は、げっ歯類およびヒト8-11との間で保存されているの理解の重要性の限界を強調し、マウスとヒトの遺伝子発現と転写因子のシグナル伝達の間に有意な差です。他のものはN-テラ-2（NT2）ヒト奇形癌細胞株および誘導多能性幹細胞（iPS細胞）を含むヒト神経細胞株の使用を採用しています。これらの細胞株は、 インビトロでのヒト・システムのための優れたモデルを提供します。しかしながら、レチノイン酸（RA）、ニューロン、星状細胞の混合集団の発生をもたらし、さらなる精製工程を必要と放射状グリア細胞12とNT2細胞の分化は、ニューロンの純粋な集団を得ました。また、NT2細胞は、細胞の72％より大きい60染色体で、非常に可変性核型13を示しています。性IPSCは、異なる細胞株の間の区別の変動を示し、分化効率が変化します<html> 14。これらの選択肢を補完するために一貫して再現性のヒト神経細胞モデルを有することが望ましいです。 SH-SY5Y神経芽細胞のような細胞は、親の神経芽細胞腫細胞株SK-N-SHのサブクローンです。親細胞株は、神経芽細胞様および上皮様細胞15の両方含ま骨髄生検から、1970年に生成されました。 SH-SY5Y細胞は、47の染色体からなる、安定な核型を有し、かつ異なるRAの使用を含む機構、ホルボールエステル、およびそのような脳由来などの特定のニューロトロフィンの様々を通して成熟ヒトニューロンへの神経芽細胞のような状態から区別することができます神経栄養因子（BDNF）。前の証拠は異なる方法の使用は、アドレナリン作動性、コリン作動性、およびドーパミン作動性ニューロン16,17のような特定のニューロンのサブタイプに選択できることを示唆しています。この後者の側面は、神経生物学実験の多数のためのSH-SY5Y細胞が有用となります。 ontent &quot;&gt;いくつかの研究は、未分化および分化した状態で、SH-SY5Y細胞との間の重要な違いを指摘している。SH-SY5Y細胞が未分化である場合、それらは急速に増殖し、非常に少数の、短いプロセスと、非偏光であるように思われる。彼らは多くの場合、成長します塊および分化、これらの細胞は増殖の減少、長く、分枝プロセスを拡張し、場合によっては2,18を偏光する。未成熟ニューロン18,19を示すマーカーを発現する。完全に分化したSH-SY5Y細胞は、以前に発現することが実証されています成長関連タンパク質（GAP-43）、ニューロン核（NeuNの）、シナプトフィジン（SYN）、シナプス小胞タンパク質II（SV2）、ニューロン特異的エノラーゼ（NSE）と微小管関連タンパク質（MAP）を含む成熟ニューロンの異なる様々なマーカー2,16,17,20、および4。SH-SY5Y細胞の分化をさらに支持するものreprese例えばグリア細胞繊維性酸性タンパク質（GFAP）のようなグリアのマーカーの発現を欠いているためにntの均質なニューロン集団は、BDNFの除去は、細胞のアポトーシスを4になります。これは、分化したSH-SY5Y細胞の生存は、成熟ニューロンに類似栄養因子に依存することを示唆しています。 サブクローンは、1978年3に設立されて以来、SH-SY5Y細胞の使用が増加している。その使用のいくつかの例としては、パーキンソン病17、アルツハイマー病21、およびポリオウイルス22などのウイルス感染症の病因、エンテロウイルス71（EV71）23,24を調査含ま、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）1、ヒトサイトメガロウイルス25、および単純ヘルペスウイルス（HSV）2,26。 SH-SY5Y細胞を用いたいくつかの研究は、特に神経ウイルス学27-36の分野において、その未分化形態において、これらの細胞を使用していることに留意することが重要です。分化したSH-SY5Y細胞対未分化の観察された表現型の違いは、WHEの問題を提起しますTHER感染の観察進行が成熟分化したニューロンで異なるだろう。例えば、分化したSH-SY5Y細胞は、原因HSVに結合し、未分化SH-SY5Y細胞2のエントリを調節する表面受容体の欠如にすることができる未分化、増殖するSH-SY5Y細胞に対するHSV-1の取り込みのより高い効率を有します。 in vitroでのニューロンのテストに焦点を当てた実験を設計する際に、SH-SY5Y細胞をin vivoモデルに変換し、比較のために最も正確な結果を得るためには区別されるべきであることが重要です。 ヒトニューロン培養物を生成するための信頼できる方法の開発は、研究者は正確に人間の神経系をモデル化する翻訳実験を実行することを可能にするのに不可欠です。ここで紹介するプロトコルは区別されている人間の神経細胞を濃縮するために、従来の方法1-4由来のベストプラクティスを描く手順ですレチノイン酸を使用。

<table><tbody><tr><td>B-27</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504-044</td><td>See &lt;strong&gt;Table 1&lt;/strong&gt; for preparation</td></tr><tr><td>Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)</td><td>Sigma</td><td>SRP3014 (10 &amp;mu;g)/B3795 (5 &amp;mu;g)</td><td>See &lt;strong&gt;Table 1&lt;/strong&gt; for preparation</td></tr><tr><td>dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>See &lt;strong&gt;Table 1&lt;/strong&gt; for preparation</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ATCC</td><td>4-X</td><td>-</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)</td><td>Sigma</td><td>M5650</td><td>-</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>See &lt;strong&gt;Table 1&lt;/strong&gt; for preparation</td></tr><tr><td>GlutamaxI</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>-</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Hyclone</td><td>SH30034.01</td><td>-</td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-1</td><td>See &lt;strong&gt;Table 1&lt;/strong&gt; for preparation</td></tr><tr><td>MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution</td><td>Sigma</td><td>E0282</td><td>See step 11 of the protocol</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td>-</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>-</td></tr><tr><td>Retinoic acid (RA)</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Should be stored in the dark at 4 &amp;deg;C because this reagent is light sensitive</td></tr><tr><td>SH-SY5Y Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td>-</td></tr><tr><td>0.5% Trypsin + EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td>-</td></tr><tr><td>Falcon 35 mm TC dishes</td><td>Falcon (A Corning Brand)</td><td>353001</td><td>-</td></tr></tbody></table>

differentiation of the sh-sy5y human neuroblastoma cell line

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease. 
The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

現時点では、未分化SH-SY5Y細胞は、ヒトのニューロン27-36のための機能モデルとして使用されている神経生物学と神経ウイルス学の分野で多くのインスタンスがあり、重要なのは、未分化細胞である、そのような最適なウイルスの取り込み2のような表現型を欠いてもよいです正確な解釈のために必要な。 SH-SY5Y細胞または他のin vitroの神経系を使用する場合、細胞は適切?...

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Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

SH-SY5Yヒト神経芽腫細胞株の分化

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

differentiation-of-the-sh-sy5y-human-neuroblastoma-cell-line

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

71.4K ビュー.  The Pennsylvania State University. It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications. 

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Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local microenvironments. In here, we present a set of methods used for three dimensional (3D) differentiation and miRNA analysis of a clonal human neural stem cell (hNSC) line, currently in clinical trials for stroke disability (NCT01151124 and NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs were derived from an ethical approved first trimester human fetal cortex and conditionally immortalized using retroviral integration of a single copy of the c-mycERTAMconstruct. We describe how to measure axon process outgrowth of hNSCs differentiated on 3D scaffolds and how to quantify associated changes in miRNA expression using PCR array. Furthermore we exemplify computational analysis with the aim of selecting miRNA putative targets. SOX5 and NR4A3 were identified as suitable miRNA putative target of selected significantly down-regulated miRNAs in differentiated hNSC. MiRNA target validation was performed on SOX5 and NR4A3 3&#8217;UTRs by dual reporter plasmid transfection and dual luciferase assay.

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

三次元培養、マイクロRNAの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

発生生物学

Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been generally adopted to study the nature of neural stem cells, including those derived from normal and tumorous tissues. However, appreciable amounts of differentiation and cell death are common in cultured neurospheres likely due to sub-optimal condition such as accessibility of all cells within sphere aggregates to culture medium.
Medulloblastoma, the most common pediatric CNS tumor, is characterized by its rapid progression and tendency to spread along the entire brain-spinal axis with dismal clinical outcome. Medulloblastoma is a neuroepithelial tumor of the cerebellum, accounting for 20% and 40% of intracranial and posterior fossa tumor in childhood, respectively1. It is now well established that Shh signaling stimulates proliferation of cerebellar granule neuron precursors (CGNPs) during cerebellar development 2-4. Numerous studies using mouse models, in which the Shh pathway is constitutively activated, have linked Shh signaling with medulloblastoma 5-9.
A recent report has shown that a subset of medulloblastoma cells derived from Patched1LacZ/+ mice are cancer stem cells, which are capable of initiating and propogating tumors 10. Here we describe an efficient method to isolate, enrich and maintain tumor stem cells derived from several mouse models of medulloblastoma, with constitutively activated Shh pathway due to a mutation in Smoothened (11, hereon referred as SmoM2), a GPCR that is critical for Shh pathway activation. In every isolated medulloblastoma tissue, we were able to establish numerous highly proliferative colonies. These cells robustly expressed several neural stem cell markers such as Nestin and Sox2, can undergo serial passages (greater than 20) and were clonogenic. While these cultured tumor stem cells were relatively small, often bipoar with high nuclear to cytoplasmic ratio when cultured under conditions favoring stem cell growth, they dramatically altered their morphology, extended multiple cellular processes, flattened and withdrew from the cell cycle upon switching to a cell culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum. More importantly, these tumor stem cells differentiated into Tuj1+ or NeuN+ neurons, GFAP+ astrocytes and CNPase+ oligodendrocytes, thus highlighting their multi-potency. Furthermore, these cells were capable of propagating secondary medulloblastomas when orthotopically transplanted into host mice.

This protocol describes the isolation, enrichment, and maintenance of medulloblastoma tumor stem cells derived from mutant mice with ectopic Sonic hedgehog pathway activity.

髄芽腫の幹細胞の単離、濃縮、およびメンテナンス

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been ...

神経科学

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median survival following diagnosis is less than 15 months with maximal surgical resection, radiation, and temozolomide chemotherapy. The challenges inherent in developing more effective GBM treatments have become increasingly clear, and include its unyielding invasiveness, its resistance to standard treatments, its genetic complexity and molecular adaptability, and subpopulations of GBM cells with phenotypic similarities to normal stem cells, herein referred to as glioblastoma stem cells (GSCs). Because GSCs are required for tumor growth and progression, differentiation-based therapy represents a viable treatment modality for these incurable neoplasms. 
The following protocol describes a collection of procedures to establish a high throughput screening platform aimed at the identification of small molecules that promote GSC astroglial differentiation. At the core of the system is a glial fibrillary acidic protein (GFAP) differentiation reporter-construct. The protocol contains the following general procedures: (1) establishing GSC differentiation reporter lines; (2) testing/validating the relevance of the reporter to GSC self-renewal/clonogenic capacity; and (3) high-capacity flow-cytometry based drug screening. 
The screening platform provides a straightforward and inexpensive approach to identify small molecules that promote GSCs differentiation. Furthermore, utilization of libraries of FDA-approved drugs holds the potential for the identification of agents that can be repurposed more rapidly. Also, therapies that promote cancer stem cell differentiation are expected to work synergistically with current "standard of care" therapies that have been shown to target and eliminate primarily more differentiated cancer cells.

An efficient screening protocol is presented for the identification of small molecules that promote astroglial differentiation in glioblastoma stem cells (GSCs). The assay is based on a stem cell differentiation reporter whereby the expression of the enhanced GFP (eGFP) is driven by the human GFAP promoter.

流れの Cytometry ベースの医薬品スクリーニング システム神経膠芽腫幹細胞の細胞分化を促進する小さい分子の同定に関する研究

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

がん研究

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

神経芽細胞アッセイ：フローサイトメトリーを用いて神経幹細胞の子孫を差別から神経前駆細胞の生成と濃縮のためのアッセイ

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes

Tau is a microtubule binding protein expressed in neurons and its main known function is related to the maintenance of cytoskeletal stability. However, recent evidence indicated that Tau is present also in other subcellular compartments including the nucleus where it is implicated in DNA protection, in rRNA transcription, in the mobility of retrotransposons and in the structural organization of the nucleolus. We have recently demonstrated that nuclear Tau is involved in the expression of the VGluT1 gene, suggesting a molecular mechanism that could explain the pathological increase of glutamate release in the early stages of Alzheimer&#39;s disease. Until recently, the involvement of nuclear Tau in modulating the expression of target genes has been relatively uncertain and ambiguous due to technical limitations that prevented the exclusion of the contribution of cytoplasmic Tau or the effect of other downstream factors not related to nuclear Tau. To overcome this uncertainty, we developed a method to study the expression of target genes specifically modulated by the nuclear Tau protein. We employed a protocol that couples the use of localization signals and the subcellular fractionation, allowing the exclusion of the interference from the cytoplasmic Tau molecules. Most notably, the protocol is easy and is composed of classic and reliable methods that are broadly applicable to study the nuclear function of Tau in other cell types and cellular conditions.

Tau is a neuronal protein present both in the cytoplasm, where it binds microtubules, and in the nucleus, where it exerts unconventional functions including the modulation of Alzheimer&#39;s disease-related genes. Here, we describe a method to investigate the function of nuclear Tau while excluding any interferences coming from cytoplasmic Tau.

疾患関連遺伝子の発現を調べるツールとしてのタウ小細胞局在の変調

Tau is a microtubule binding protein expressed in neurons and its main known function is related to the maintenance of cytoskeletal stability. However, ...

遺伝学

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real time and dissecting the different steps of exo-endocytosis at the single-vesicle level are crucial for understanding synaptic functions in health and disease.
Genetically-encoded pH-sensitive probes directly targeted to synaptic vesicles and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) provide the spatio-temporal resolution necessary to follow vesicle dynamics. The evanescent field generated by total internal reflection can only excite fluorophores placed in a thin layer (&#60;150 nm) above the glass cover on which cells adhere, exactly where the processes of exo-endocytosis take place. The resulting high-contrast images are ideally suited for vesicles tracking and quantitative analysis of fusion events.
In this protocol, SH-SY5Y human neuroblastoma cells are proposed as a valuable model for studying neurotransmitter release at the single-vesicle level by TIRFM, because of their flat surface and the presence of dispersed vesicles. The methods for growing SH-SY5Y as adherent cells and for transfecting them with synapto-pHluorin are provided, as well as the technique&#160;to perform TIRFM and imaging. Finally, a strategy aiming to select, count, and analyze fusion events at whole-cell and single-vesicle levels is presented.
To validate the imaging procedure and data analysis approach, the dynamics of pHluorin-tagged vesicles are&#160;analyzed under resting and stimulated (depolarizing potassium concentrations) conditions. Membrane depolarization increases the frequency of fusion events and causes a parallel raise of the net fluorescence signal recorded in whole cell. Single-vesicle analysis reveals modifications of fusion-event behavior (increased peak height and width). These data suggest that potassium depolarization not only induces a massive neurotransmitter release but also modifies the mechanism of vesicle fusion and recycling.
With the appropriate fluorescent probe, this technique can be employed in different cellular systems to dissect the mechanisms of constitutive and stimulated secretion.

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

細胞イメージングおよびデータ分析：SH-SY5Y神経芽腫細胞における神経伝達物質小胞のダイナミクスを評価するためにTIRFMとpH感受性GFP-プローブ

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Human Neural Organoids for Studying Brain Cancer and Neurodegenerative Diseases

The lack of relevant in vitro neural models is an important obstacle on medical progress for neuropathologies. Establishment of relevant cellular models is crucial both to better understand the pathological mechanisms of these diseases and identify new therapeutic targets and strategies. To be pertinent, an in vitro model must reproduce the pathological features of a human disease. However, in the context of neurodegenerative disease, a relevant in vitro model should provide neural cell replacement as a valuable therapeutic opportunity. 
Such a model would not only allow screening of therapeutic molecules but also can be used to optimize neural protocol differentiation [for example, in the context of transplantation in Parkinson's disease (PD)]. This study describes two in vitro protocols of 1) human glioblastoma development within a human neural organoids (NO) and 2) neuron dopaminergic (DA) differentiation generating a three-dimensional (3D) organoid. For this purpose, a well-standardized protocol was established that allows the production of size-calibrated neurospheres derived from human embryonic stem cell (hESC) differentiation. The first model can be used to reveal molecular and cellular events occurring during in glioblastoma development within the neural organoid, while the DA organoid not only represents a suitable source of DA neurons for cell therapy in Parkinson's disease but also can be used for drug testing.

This study introduces and describes protocols to derive two specific human neural organoids&#160;as a relevant and accurate model for studying 1) human glioblastoma development within human neural organoids exclusively in humans and 2) neuron dopaminergic differentiation generating a three-dimensional organoid.

脳癌と神経変性疾患を研究するためのヒト神経オルガノイド

The lack of relevant in vitro neural models is an important obstacle on medical progress for neuropathologies. Establishment of relevant cellular models ...

生物工学

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

iPSCマクロファージによる死んだ神経芽細胞の食細胞に対するインビトロ定量イメージングアッセイ

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

STED顕微鏡によるニューロンのミトコンドリア超微細構造の解明

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of reactive oxygen species (ROS). These mitochondria-mediated processes take on specialized roles in neurons, coordinating aerobic metabolism to meet the high energy demands of these cells, modulating Ca2+ signaling, providing lipids for axon growth and regeneration, and tuning ROS production for neuronal development and function. Mitochondrial dysfunction is therefore a central driver in neurodegenerative diseases. Mitochondrial structure and function are inextricably linked. The morphologically complex inner membrane with structural infolds called cristae harbors many molecular systems that perform the signature processes of the mitochondrion. The architectural features of the inner membrane are ultrastructural and therefore, too small to be visualized by traditional diffraction-limited resolved microscopy. Thus, most insights on mitochondrial ultrastructure have come from electron microscopy on fixed samples. However, emerging technologies in super-resolution fluorescence microscopy now provide resolution down to tens of nanometers, allowing visualization of ultrastructural features in live cells. Super-resolution imaging therefore offers an unprecedented ability to directly image fine details of mitochondrial structure, nanoscale protein distributions, and cristae dynamics, providing fundamental new insights that link mitochondria to human health and disease. This protocol presents the use of stimulated emission depletion (STED) super-resolution microscopy to visualize the mitochondrial ultrastructure of live human neuroblastoma cells and primary rat neurons. This procedure is organized into five sections: (1) growth and differentiation of the SH-SY5Y cell line, (2) isolation, plating, and growth of primary rat hippocampal neurons, (3) procedures for staining cells for live STED imaging, (4) procedures for live cell STED experiments using a STED microscope&#160;for reference, and (5) guidance for segmentation and image processing using examples to measure and quantify morphological features of the inner membrane.

著者スポットライト:ミトコンドリア老化の解読 

This protocol presents a workflow for the propagation, differentiation, and staining of cultured SH-SY5Y cells and primary rat hippocampal neurons for mitochondrial ultrastructure visualization and analysis using stimulated emission depletion (STED) microscopy.

生細胞STEDイメージングを用いた神経細胞モデルにおけるミトコンドリア内膜の微細構造の可視化

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...

SH-SY5Yヒト神経芽腫細胞株の分化

要約

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三次元培養、マイクロRNAの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化

髄芽腫の幹細胞の単離、濃縮、およびメンテナンス

流れの Cytometry ベースの医薬品スクリーニングシステム神経膠芽腫幹細胞の細胞分化を促進する小さい分子の同定に関する研究

神経芽細胞アッセイ：フローサイトメトリーを用いて神経幹細胞の子孫を差別から神経前駆細胞の生成と濃縮のためのアッセイ

疾患関連遺伝子の発現を調べるツールとしてのタウ小細胞局在の変調

ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

細胞イメージングおよびデータ分析：SH-SY5Y神経芽腫細胞における神経伝達物質小胞のダイナミクスを評価するためにTIRFMとpH感受性GFP-プローブ

脳癌と神経変性疾患を研究するためのヒト神経オルガノイド

iPSCマクロファージによる死んだ神経芽細胞の食細胞に対するインビトロ定量イメージングアッセイ

生細胞STEDイメージングを用いた神経細胞モデルにおけるミトコンドリア内膜の微細構造の可視化

SH-SY5Yヒト神経芽腫細胞株の分化

要約

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三次元培養、マイクロRNAの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化

髄芽腫の幹細胞の単離、濃縮、およびメンテナンス

流れの Cytometry ベースの医薬品スクリーニング システム神経膠芽腫幹細胞の細胞分化を促進する小さい分子の同定に関する研究

神経芽細胞アッセイ：フローサイトメトリーを用いて神経幹細胞の子孫を差別から神経前駆細胞の生成と濃縮のためのアッセイ

疾患関連遺伝子の発現を調べるツールとしてのタウ小細胞局在の変調

ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

細胞イメージングおよびデータ分析：SH-SY5Y神経芽腫細胞における神経伝達物質小胞のダイナミクスを評価するためにTIRFMとpH感受性GFP-プローブ

脳癌と神経変性疾患を研究するためのヒト神経オルガノイド

iPSCマクロファージによる死んだ神経芽細胞の食細胞に対するインビトロ定量イメージングアッセイ

生細胞STEDイメージングを用いた神経細胞モデルにおけるミトコンドリア内膜の微細構造の可視化

流れの Cytometry ベースの医薬品スクリーニングシステム神経膠芽腫幹細胞の細胞分化を促進する小さい分子の同定に関する研究