Name: comet assay as an indirect measure of systemic oxidative stress
Uploaded: 2015-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress at JoVE.com

우리는 재정적으로 산화 스트레스에 우리의 연구를 지원하기 위해, 트리 젠 리히텐슈타인, LHW 재단에게 감사의 말씀을 전합니다.

바젤 대학에서 수행 혜성 분석에 관한 연구는, 안과학 교실은 바젤의 지역 윤리위원회에 의해 승인되었다 시약 1. 준비 <ol><li> 둘 베코 인산염 완충 식염수 (PBS) (칼슘 + +, 마그네슘 + + 무료), PBS (1 패 패킷)과 미디어에 DH 2 O의 990 ml에 추가하여 솔루션을 준비합니다. 7.4 pH를 조정합니다. 실온에서 보관하십시오. </li><li> 용균 솔루션을 준비 : 1,000 ml의 DH 2 O에서 2.5 M의 NaCl (146.1 g)을, 100 mM의 EDTA (37.2 g) 및 10 mM의 후, Trizma베이스 (1.2 g)을 추가 준비하려면 </li><li> 1,500 ml의 DH 2 O 10 M의 NaOH 30 ml의 7.5 ml를 0.2M EDTA, QS를 추가하여 전기 영동 버퍼 (300 mM의 수산화 나트륨 / 1 mM의 EDTA)를 준비하고 잘 섞는다. 총 부피는 겔 상자 용량에 의존한다. 앞서&gt; (13)의 pH가되도록 버퍼의 pH를 측정하고, 사용하기. </li><li> 0.4 M 트리스 함유 중화 버퍼 준비 (# 농축 (GM는 48.5 ~ 800 ml의 DH 2 O는, pH를 7.5로 조정하기 위해 첨가)62, DH 2 O 10 M의 HCl) 1,000 ㎖의 실온에서 솔루션을 저장합니다. </li><li> 염색 솔루션을 준비합니다. 에티 디움 브로마이드 (EtBr이, 10 배 주식, 20 μg의 / ㎖)에 실온에서 50 ml의 DH 2 O 및 저장소에 EtBr이 10 mg을 추가합니다. 1X 주식 - 9 ml의 DH 2 O와 함께 1 ml의 혼합 신중한! 이 알려진 발암 물질로 적절한 예방 조치와 EtBr이를 처리합니다. </li></ol> 백혈구 2. 분리 <ol><li> 정맥 천자를 사용하여 헤파린과 같은 항응고제와 인간의 혈액 샘플 (20 ㎖)을 구합니다. </li><li> 이러한 Histopaque 같은 밀도 구배 전지 세퍼레이터를 사용하여 림프구를 분리. <ol><li> 600 μL 세포 분리 액체를 통해 1 PBS 또는 (FBS)없이 RPMI와 비율과 층 : 간단히, 1에 혈액을 희석. </li><li> 4 ℃에서 20 분 동안 원심 분리기 1,800 XG. PBS / RPMI의 3-5 ml의에 &#39;버피&#39;코트를 기음과 림프구 펠렛 10 분 동안 300 XG에 원심 분리 하였다. </li><li> (단지 PBS 사이의 경계 위에서 RPMI를 림프구 검색피펫을 이용) 및 세포 분리 액. 플라즈마 및 각 튜브의 액체 전지 세퍼레이터 층과의 계면으로부터 백혈구를 제거하고 대역 한 50 ㎖ 튜브에 수집한다. </li></ol></li><li> 감기 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM)과 50 ㎖에 총 볼륨을 가져와. 10 분 동안 300 XG에 세포 현탁액을 DMEM로 3 회 세척 할 것. </li><li> 혈구 계를 사용하여 세포의 총 수를 카운트. PBS의 세포를 일시 중단하고 10 7 세포 / 튜브의 microcentrifuge 튜브에 aliquote. </li><li> 피펫 5 ㎖ 일회용 플라스틱 튜브에 0.4 ml의 세포. 40 ℃에서 1.2 ml의 1 % 낮은 겔화 온도 아가로 오스를 추가합니다. 믹스 및 신속하고 미리 코팅 된 슬라이드의 아가로 덮인 표면에 세포 현탁액 1.2 ml의 피펫. 거품을 생산하지 마십시오. </li><li> 아가로 오스는 약 2 분 동안 젤을 허용합니다. 겔화에 사용되는 시간과 온도와 일치하고, 그 아가로 오스가 완전히 분해 용액에 침지하기 전에 설정되어 있는지 확인하십시오. 의 완전 후등은 4 ~ ºC에서 솔루션을 용균에 잠수함. </li></ol> 3. 용해 및 전기 영동 참고 : 설명하는 절차는 pH가&gt; (13) 알칼리 조건에서 전기입니다. <ol><li> ~ 4 ºC에서 최소 2 시간 후, 부드럽게 용균 솔루션에서 슬라이드를 제거합니다. 장소는 가능한 한 함께 그들을 가깝게 슬라이딩, 하나의 끝 부분에 수평 젤 상자에 나란히 슬라이드. </li><li> 액체 레벨이 완전히 슬라이드 (아가로 오스를 통해 거품을 피하기) 커버까지 갓 산도&gt; (13) 전기 영동 버퍼와 버퍼 저수지를 입력합니다. </li><li> 20 분은 DNA의 풀림 및 알칼리 불안정한 손상의 표현을 허용하는 슬라이드 알칼리 버퍼에 앉아 보자. </li><li> 25 볼트 (~ 0.75 V / ㎝)에 전원을 켜고 높이거나 버퍼 수준을 낮춤으로써 300 밀리 암페어의 전류를 조정합니다. 30 분간 슬라이드를 Electrophorese. </li><li> 전원을 끄십시오. 조심스럽게 버퍼와 P에서 슬라이드를 올려드레인 트레이에 레이스. 현명한 코트를 중화 버퍼와 슬라이드를 삭제합니다. 슬라이드가 적어도 5 분 동안 앉아 있도록 허용합니다. 슬라이드를 배출하고 두 번 더 반복한다. </li><li> 80 μL 1X 에티 디움 브로마이드 (EtBr이)와 슬라이드를 얼룩 5 분간 방치 한 후 과잉 얼룩을 제거하기 위해 냉각 된 증류수에 담근다. 그런 다음 슬라이드를 통해 커버 슬립을 배치하고 즉시 저장합니다. 스토어는 건조한 상태에서 실온에서 한 달 동안 슬라이드. 주의 : 다른 DNA 얼룩 (예를 들면, SYBR 그린)도 사용될 수있다. 주의! 대부분의 염료가 돌연변이이기 때문에 보호 장갑을 착용하십시오. </li></ol> DNA 나누기 4. 정량 <ol><li> DNA 손상을 시각화하기 위해, 40X 목적 형광 현미경 EtBr이 묻은 DNA 슬라이드를 관찰합니다. </li><li> DNA 이동의 길이와 이주 DNA (도 1A)의 비율을 측정함으로써 세포의 DNA 손상을 정량적으로 평가. Tail- 모멘트와 올리브-mome에 의한 DNA 손상 (그림 1B)를 정량화NT. 꼬리 순간 올리브 -Moment의 정의는 이전에 8-10을 부여하고있다. 참고 : 우리의 경험에서이 매개 변수 중 하나에 의해 충실하기에 충분하다. 세포는 현미경 슬라이드와 사진 세포를 통해 검사 자동화 된 도구를 설정하여 촬영됩니다. DNA 나누기 정량은 이미지 분석 소프트웨어 패키지에 의해 수행 될 수있다. 커스텀 셀의 이미지를 캡처하고 DNA 손상을 정량화 만들어 여러 소프트웨어 패키지가있다. 우리는 실험을하는 동안 같은 소프트웨어 패키지를 사용하는 것이 좋습니다. 실험실 기술자는 그대로 셀 또는 혜성이 컴퓨터에 득점을 식별하고 그 위에 마우스로 클릭합니다. 혜성 또는 그대로 셀은 자동으로 획득됩니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Phillips, J. L., Singh, N. P., Lai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromagnetic+fields+and+DNA+damage.">Electromagnetic fields and DNA damage.</a> Pathophysiology. 16 (2-3), 79-88 (2009).</li><li>Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet+assay:+a+reliable+tool+for+the+assessment+of+DNA+damage+in+different+models.">Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (1), 5-32 (2009).</li><li>Aiub, C. A., Pinto, L. F., Felzenszwalb, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-repair+genes+and+vitamin+E+in+the+prevention+of+N-nitrosodiethylamine+mutagenicity.">DNA-repair genes and vitamin E in the prevention of N-nitrosodiethylamine mutagenicity.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (4), 393-402 (2009).</li><li>Bartsch, H., Nair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+inflammation+and+oxidative+stress+in+the+genesis+and+perpetuation+of+cancer:+role+of+lipid+peroxidation,+DNA+damage,+and+repair.">Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and perpetuation of cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage, and repair.</a> Langenbecks Arch Surg. 391 (5), 499-510 (2006).</li><li>Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair:+relevance+to+mechanisms+of+neurodegeneration.">DNA damage and repair: relevance to mechanisms of neurodegeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (5), 377-387 (2008).</li><li>Choy, C. K., Benzie, I. F., Cho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV-mediated+DNA+strand+breaks+in+corneal+epithelial+cells+assessed+using+the+comet+assay+procedure.">UV-mediated DNA strand breaks in corneal epithelial cells assessed using the comet assay procedure.</a> Photochem Photobiol. 81 (3), 493-497 (2005).</li><li>Mozaffarieh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet+assay+analysis+of+single-stranded+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes+of+glaucoma+patients.">Comet assay analysis of single-stranded DNA breaks in circulating leukocytes of glaucoma patients.</a> Mol Vis. 14, 1584-1588 (2008).</li><li>Mozaffarieh, M., Konieczka, K., Hauenstein, D., Schoetzau, A., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half+a+pack+of+cigarettes+a+day+more+than+doubles+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes.">Half a pack of cigarettes a day more than doubles DNA breaks in circulating leukocytes.</a> Tob Induc Dis. 8 (14), (2010).</li><li>Mozaffarieh, M., Schotzau, A., Josifova, T., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ranibizumab+versus+photodynamic+therapy+on+DNA+damage+in+patients+with+exudative+macular+degeneration.">The effect of ranibizumab versus photodynamic therapy on DNA damage in patients with exudative macular degeneration.</a> Mol Vis. 15, 1194-1199 (2009).</li><li>Pertynska-Marczewska, M., Merhi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+Advanced+Glycation+End+Products+With+Cardiovascular+Disease+in+Menopausal+Women.">Relationship of Advanced Glycation End Products With Cardiovascular Disease in Menopausal Women.</a> Reprod Sci. , (2014).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells).">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells).</a> Exp Cell Res. 175, 184-191 (1988).</li><li>Gaiv&#227;o, I., Sierra, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+comet+assay:+insights,+uses,+and+future+perspectives.">Drosophila comet assay: insights, uses, and future perspectives.</a> Front Genet. 5, 304 (2014).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+in+lens+epithelial+cells+and+peripheral+lymphocytes+from+age-related+cataract+patients.">DNA damage in lens epithelial cells and peripheral lymphocytes from age-related cataract patients.</a> Ophthalmic Res. 51 (3), 124-128 (2014).</li><li>Huet, S. A., Vasseur, L., Camus, S., Chesn&#233;, C., Fessard, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+comet+and+micronucleus+assays+in+metabolic+competent+HepaRG+cells+to+predict+in+vivo+genotoxicity.">Performance of comet and micronucleus assays in metabolic competent HepaRG cells to predict in vivo genotoxicity.</a> Toxicol Sci. 138 (2), 300-309 (2014).</li><li>Danson, S., Ranson, M., Denneny, O., Cummings, J., Ward, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+comet-X+assay+as+a+pharmacodynamic+assay+for+measuring+DNA+cross-linking+produced+by+the+novel+anticancer+agent+RH1+during+a+phase+I+clinical+trial.">Validation of the comet-X assay as a pharmacodynamic assay for measuring DNA cross-linking produced by the novel anticancer agent RH1 during a phase I clinical trial.</a> Cancer chemotherapy and pharmacology. 60, 851-861 (2007).</li><li>Moller, P., Moller, L., Godschalk, R. W., Jones, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+and+reduction+of+comet+assay+variation+in+relation+to+DNA+damage:+studies+from+the+European+Comet+Assay+Validation+Group.">Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group.</a> Mutagenesis. 25, 109-111 (2010).</li><li>Chan, S. W., Chevalier, S., Aprikian, A., Chen, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+mitochondrial+DNA+damage+and+copy+number+in+circulating+blood:+a+sensitive+approach+to+systemic+oxidative+stress.">Simultaneous quantification of mitochondrial DNA damage and copy number in circulating blood: a sensitive approach to systemic oxidative stress.</a> BioMed Res Int. , 157-547 (2013).</li><li>Sanchez-Quesada, J. L., Perez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+lipoproteins+as+biomarkers+of+cardiovascular+risk+in+diabetes+mellitus.">Modified lipoproteins as biomarkers of cardiovascular risk in diabetes mellitus.</a> Endocrinol Nutr. 60, 518-528 (2013).</li><li>Gandhi, G., Kaur, G., Nisar, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+case+control+study+on+genetic+damage+in+individuals+residing+in+the+vicinity+of+a+mobile+phone+base+station.">Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station.</a> Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).</li><li>Cabarkapa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+dry+olive+leaf+extract+in+adrenaline+induced+DNA+damage+evaluated+using+in+vitro+comet+assay+with+human+peripheral+leukocytes.">Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes.</a> Toxicol In Vitro. 28 (3), 451-456 (2014).</li></ol>

스웨덴어 과학자 Ostling 및 요한슨은 세포 하나에서 DNA 손상을 정량화하는 혜성 분석을 사용하여 자신의 분야에서 처음이었다. 중성 조건은 두 과학자들이 사용한다는 점만을 이중 가닥 DNA 나누기의 검출을 허용했다. 싱 등은. 나중에 단일 및 이중 가닥 DNA 나누기를 평가하고 알칼리 불안정한 사이트 (12)을 감지 할 수있는 민감한 버전을 생산 알칼리 조건에서 사용하기위한 분석을 적용. 초기 개발 이후, 분석은 상이한 세포 유형에서 13-15 DNA 손상의 유형을 평가하기에 적합하도록 다양한 단계에서 수정되었다. 모든 기술에서와 같이, 기술 정보에 엄격한주의를 기울이지 16 것은 정확한 결과를 얻기 위해 중요하다. 우리의 경험을 바탕으로 최상의 결과를 얻을 경우 모든 방법 론적 스텝에서 정량-되는 전문 실험실 TECHN에 의해​​ 혜성 수행에 솔루션 준비icians. 신선하고 정확하게 준비된 용지 적절한 피펫 기법 정확한 타이밍과 새로 제조 한 백혈구 (이전 결과 섹션에서 언급 된 바와 같이)의 사용 용도는 정확한 결과 (17)를 얻기 위해 분해 및 겔 전기 영동을 위해서는 필수적이다. 이 분석에서 모든 개별 단계는 신뢰할 수있는 결과를 얻기위한 동등하게 중요하다. 일반적으로 가장 좋은 결과에서 (16)를 얻을 수있다 혜성 정량화까지 솔루션 준비에서 매 방법 론적 단계는 전문 실험실 technicians.Important에 의해 수행되는 경우 것 같다 신선하고 제대로 준비 미디어의 사용 적절한 피펫 기법, 정확한 타이밍은 이미 결과 분석 부 (17)로부터 적절한 결과를 얻기 위해 분해 및 겔 전기 영동 새로 제조 한 백혈구 사용 함. 다른 방법을 할 때, 혜성 분석 기술은 ADVAN이의 tages과 단점. 민감한 방법이기 때문에, 분석은 DNA 휴식을 증가 때문에 결과에 영향을 미칠 수있는 요소 (예를 들면, 자외선)에 취약합니다. 연구되고있는 것을 제외하고, 산화 스트레스를 향상시킬 수있다 상관 계수는 피해야한다. 스트레스는 산화 스트레스 백혈구에서뿐만 아니라 다른 모든 혈액 매체와 림프구에서뿐만 아니라의 수준을 높일 수 있습니다. 앞서 언급 한 바와 같이 산화 스트레스 18,19 측정 다양한 더 직접적인 방법이있다. 혜성 분석은 어떤 장점이 많은 방법 중 하나입니다. 이들은 상대적 저비용 (&lt;10,000 세포)에 필요한 세포의 수가 적은 환자 당 필요한 피 따라서 작은 시료 세포 (약 3 일간)에서 DNA 손상을 계량하는 데 필요한 시간의 상대적인 짧은 기간, 그 감도를 포함 서로 다른 세포 유형에서 엉덩이의 DNA 손상에 넓은 확산 적용. 우리는이 경험을 가지고 있기 때문에 과거에 우리는 백혈구와 함께 작동하도록 선택세포 형과 계획, 특정 연구에 적용했다. 혜성 분석법의 또 다른 장점은 서로 다른 유형 및 DNA 손상의 레벨을 검출하는데 사용될 수 있으며, 따라서 이러한 DNA 복구 과정, 보충 실험 또는 유전 독성 연구와 같은 산화 적 스트레스 또한 연구의 다양한 분야에 적용 할 수 있다는 것이다. 산화 스트레스는 이제 여러 질환의 발병 기전에서 중요한 역할을 인식한다. 혜성 분석 방법은 산화 스트레스 18,19 측정 많은 방법 중 하나를하면서, 비교적 간단하고 저렴한 다재다능하다. 습득하면,이 방법은 산화 스트레스가 역할을 담당 8-10,20,21되는 의학의 모든 분야에서 사용될 수있다.

혜성 분석은 처음 스웨덴어 과학자 Ostling 및 요한슨 (1)에 의해 개발되었다. DNA는 음전하 분자이다. 전기 영동시, 작은 손상, DNA 단편을 빠르게 양전하 양극 (2)을 향해 이동한다. DNA 단편 작을 양극쪽으로 빠르게 자신 마이그레이션 손상, DNA 손상과 손상된 DNA 단편 (3)으로 이루어지는 &quot;꼬리&quot;구성된 &quot;헤드&quot;전형적인 &quot;혜성&quot;을 형성한다. 손상된 DNA를 5 매우 균형 잡힌 DNA 나누기의 생성을 유지 본체 (4) 다른 메커니즘에 의해 복구 할 수 있습니다. 그러나, 저울이 DNA 바꿈 대신 경우 나누기 쌓일 수 궁극적 질환의 발전에 기여한다. 우리의 DNA는 주어진 시간 6 약 0.000165 % 손상을 겪고있다. 단일 가닥 DNA 나누기는 DNA 이중 나선의 두 가닥 중 하나에 결함 참조DNA 이중 나선의 두 가닥이 손상되면 이중 가닥 DNA 나누기가 발생하는 반면. 이러한 세포의 연령, 담배 연기, 다양한 약물 또는 산화 스트레스 7-9으로 주어진 시간에 DNA 나누기의 양을 향상시킬 수있다 여러가지 요인이있다. 향상된 DNA 파손으로 이어지는 모든 요인들이 일정하게 유지된다면, 혜성 분석법에 의해 DNA 나누기 부량은 산화 스트레스 좋은 간접 파라미터이다. 혜성 분석의 방법을 포함한 안과 의학에서 점점 오늘날 사용된다. 그 이유 중 하나는 산화 스트레스가 더욱 더 한 방법 간접적으로 정량 할 수있는 산화 스트레스와 각종 질병 8-11 및 혜성 분석 용기구 병인으로 인식한다는 것이다.

<table><tbody><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Qualigens</td><td>(CPW59)</td><td></td></tr><tr><td>Disodium EDTA</td><td>HiMedia</td><td>(RM1370)</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Sigma</td><td>(E-8751)</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>(1077-1)</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free)</td><td>HiMedia</td><td>(TS1006)</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Ranbaxy Rankem</td><td>(S0160)</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>BDH-Merck</td><td>(89021)</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>HiMedia</td><td>(RM 845)</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Spectrochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materials required for gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Normal Melting Agarose (NMA)</td><td>HiMedia</td><td>(RM273)</td><td></td></tr><tr><td>Low Melting Point Agarose (LMPA)</td><td>Sigma</td><td>(A9414)</td><td></td></tr><tr><td>Methanol - Qualigens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm)</td><td>Blue Star</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes</td><td>Tarsons</td><td>(500010)</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor and Tips</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

comet assay as an indirect measure of systemic oxidative stress

산소없이 살 수없는 높은 진핵 생물; 그러나 역설적으로, 산소는 그들에게 해가 될 수 있습니다. 그것이 다른 파이 * 고결 궤도에있는 두 개의 비공유 전자를 가지고 있기 때문에, 산소 분자는 화학적으로 비교적 불활성이다. 이 두 전자들은 자신의 축에 대한 동일 방향으로 회전 즉, 평행 한 스핀을 갖는다. 산소 분자가없는 매우 반응성 이유이다. 산소의 활성화는 두 개의 서로 다른 메커니즘에 의해 발생할 수 있습니다; 어느 시간 (가의 감소)를 통해 하나의 전자 환원을 통해, 또는 충분한 에너지의 흡수를 통해 부대 전자 중 하나의 회전을 반대로. 이것은 반응성 산화 화학 종 (ROS)의 생성을 초래한다. 인체 생리 학적 상태에서 ROS를 제거하는 여러 가지 방법이있다. ROS 생성은 보수 능력, 산화 스트레스의 결과 및 다른 손상 분자를 초과하는 경우. 산화 스트레스는 저를 할 수있는 여러 가지 방법이 있습니다asured. 이 논문은 또한 DNA 나누기의 측정을 허용한다 &quot;혜성 분석법&quot;로 알려진 세포 겔 전기 영동,라는 방법 중 하나에 초점을 맞춘다. 산화 스트레스 이외의 DNA 손상을 유발하는 것으로 알려진 모든 요인들이 일정하게 유지되는 경우, 혜성 분석법에 의해 측정 된 DNA 손상의 양이 산화 스트레스 좋은 파라미터이다. 원리는 간단하며, DNA 분자가 음으로 하전된다는 사실에 의존한다. 완전한 DNA 분자는 전기 영동시 이동하지 않도록 큰 크기를 갖는다. DNA 나누기 그러나 양극쪽으로 전계 이동 작은 단편으로 존재하는 경우 결과. 작은 조각 빠르게 이동한다. 단편은 서로 다른 크기를 가지고 전기의 최종 결과는 별개 라인 오히려 혜성의 형상으로 연속이 아니다. 시스템은 세포의 DNA 나누기 얻어진 &quot;혜성&quot;및 이와의 정량을 허용한다.

혜성 분석의 방법은 재현 가능한 결과를 렌더링 아니지만, 다양한 요인에 의해 영향을받을 수있다. 하나의 이러한 인자는 백혈구 전에 용해하고, 겔 전기 영동 또는이 단계는 새롭게 제조 된 백혈구를 수행할지 여부를 동결 보존되어 있는지의 여부이다. 도시도 2를 그 백혈구가 용해 및 겔 전기 SS- DNA 전에는 동결 보존 하였다 그룹 2에 휴식은 용해 및 젤 -electrophoresis 갓 준비 세포에서 수행 한 그룹 1보다 유의하게 높았다. 분석은 간접적 전신 산화 스트레스를 평가하는데 사용될 수있다. 표 1은 흡연자와 건강한 과목에서 Tail- 모멘트와 올리브 ... 순간에 대한 설명이 통계를 보여줍니다. 데이터는보다 매일 더 담배의 절반 팩을 흡연하는 순환 백혈구 9 ssDNA를 나누기를 두 배로 것으로 나타났다. <img alt="그림 1A" src= &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52763 / 52763fig1A.jpg&quot;/&gt; <img alt="그림 1B" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig1B.jpg" /> 도 1 (A)는 혜성 시험 분석 동안 사용 된 현미경을 도시한다. (B) Δ 밝은 머리와 꼬리 (작은 DNA 조각을 손상) 전형적인 &quot;혜성&quot;을 보여줍니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52763/52763fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig2.jpg" /> 백혈구가 새로 제조 된 백혈구가 용해 및 겔 전기 이전에 사용 된 경우보다 (그룹 2) 동결 보존 때 그림 2. ssDNA를 나누기는 유의하게 높았다. <imgALT = &quot;표 1&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52763 / 52763table1.jpg&quot;/&gt; 표 1. 흡연자의 ssDNA를 두 배 이상 수가 건강한 비 흡연자 일치 연령과 성별에 비해 중단했다.

Watch this Scientific Journal Video about Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress at JoVE.com

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

혜성 분석은 다른 요인에 의해 유도 된 DNA 나누기를 측정한다. DNA 손상을 유발 (산화 스트레스를 제외한) 모든 요인들이 일정하게 유지되는 경우, DNA 손상의 양이 산화 스트레스 좋은 간접 파라미터이다. 이 프로토콜의 목적은 산화 적 스트레스의 간접적 인 측정에 혜성 분석을 사용하는 것이다.

전신 산화 스트레스의 간접 측정으로 혜성 분석

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

comet-assay-as-an-indirect-measure-of-systemic-oxidative-stress

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

29.3K 조회수.  University of Basel.  혜성 분석은 다른 요인에 의해 유도 된 DNA 나누기를 측정한다. DNA 손상을 유발 (산화 스트레스를 제외한) 모든 요인들이 일정하게 유지되는 경우, DNA 손상의 양이 산화 스트레스 좋은 간접 파라미터이다. 이 프로토콜의 목적은 산화 적 스트레스의 간접적 인 측정에 혜성 분석을 사용하는 것이다. 

비디오: Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer therapies, such as radio- and chemotherapy, introduce enormous amount of additional DNA damage, leading to cell cycle arrest and apoptosis to limit cancer progression. Quantitative assessment of DNA damage during experimental cancer therapy is a key step to justify the effectiveness of a genotoxic agent. In this study, we focus on a single cell electrophoresis assay, also known as the comet assay, which can quantify single and double-strand DNA breaks in vitro. The comet assay is a DNA damage quantification method that is efficient and easy to perform, and has low time/budget demands and high reproducibility. Here, we highlight the utility of the comet assay for a preclinical study by evaluating the genotoxic effect of olaparib/temozolomide combination therapy to U251 glioma cells.

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

The comet assay is an efficient method to detect DNA damage including single and double-stranded DNA breaks. We describe alkaline and neutral comet assays to measure DNA damage in cancer cells to evaluate the therapeutic effect of chemotherapy.

DNA 손상 생체 외에서 혜성 분석 결과 사용 하 여 평가

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

연구

암 연구학

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip : Microarrayed 인간의 세포에서 DNA 손상을 측정하기위한 높은 처리량 96 글쎄 플랫폼

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

생체공학

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

라이트 농도의 변화에​​ Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

생물학

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other environmental stressors. Use of the comet assay in regulatory testing for genotoxic potential in rodents has been driven by adoption of an Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline in 2014. Comet assay slides are typically prepared from fresh tissue at the time of necropsy; however, freezing tissue samples can avoid logistical challenges associated with simultaneous preparation of slides from multiple organs per animal and from many animals per study. Freezing also enables shipping samples from the exposure facility to a different laboratory for analysis, and storage of frozen tissue facilitates deferring a decision to generate DNA damage data for a given organ. The alkaline comet assay is useful for detecting exposure-related DNA double- and single-strand breaks, alkali-labile lesions, and strand breaks associated with incomplete DNA excision repair. However, DNA damage can also result from mechanical shearing or improper sample processing procedures, confounding the results of the assay. Reproducibility in collection and processing of tissue samples during necropsies may be difficult to control due to fluctuating laboratory personnel with varying levels of experience in harvesting tissues for the comet assay. Enhancing consistency through refresher training or deployment of mobile units staffed with experienced laboratory personnel is costly and may not always be feasible. To optimize consistent generation of high quality samples for comet assay analysis, a method for homogenizing flash frozen cubes of tissue using a customized tissue mincing device was evaluated. Samples prepared for the comet assay by this method compared favorably in quality to fresh and frozen tissue samples prepared by mincing during necropsy. Moreover, low baseline DNA damage was measured in cells from frozen cubes of tissue following prolonged storage.

This protocol describes several procedures for preparing high quality frozen tissue samples at the time of necropsy for use in the comet assay to assess DNA damage: 1) minced tissue, 2) scraped epithelial cells from the gastrointestinal tract, and 3) cubed tissue samples, requiring homogenization using a tissue mincing device.

DNA 손상의 평가를 위한 혜성 분석에서 냉동 조직의 사용

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...

유전학

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

혜성 분석을 사용하여 Hippocampal 뉴런의 DNA 손상을 시금

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

신경과학

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of aerobic life. Molecular oxygen is essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many damaging reactions within living organisms. The combination of aerobic metabolism and iron, which is another vital compound for life, is enough to produce radicals through Fenton chemistry and degrade cellular components. DNA degradation is arguably the most damaging process involving intracellular radicals, as DNA repair is far from trivial. The assay presented in this article offers a quantitative technique to measure and visualize the effect of molecules and enzymes on radical-mediated DNA damage.
The DNA protection assay is a simple, quick, and robust tool for the in vitro characterization of the protective properties of proteins or chemicals. It involves exposing DNA to a damaging oxidative reaction and adding varying concentrations of the compound of interest. The reduction or increase of DNA damage as a function of compound concentration is then visualized using gel electrophoresis. In this article we demonstrate the technique of the DNA protection assay by measuring the protective properties of the DNA-binding protein from starved cells (Dps). Dps is a mini-ferritin that is utilized by more than 300 bacterial species to powerfully combat environmental stressors. Here we present the Dps purification protocol and the optimized assay conditions for evaluating DNA protection by Dps.

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

The DNA-binding protein from starved cells (Dps) plays a crucial role in combating bacterial stress. This article discusses the purification of E. coli Dps and the protocol for an in vitro assay demonstrating Dps-mediated protection of DNA from degradation by reactive oxygen species.

의 적용<em&gt; 체외</emDPS 단백질의 스트레스 중재 속성을 시각화&gt; DNA 보호 분석

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

쥐 간에서 DNA 가닥 나누기 및 산화 적 DNA 손상을 측정하기위한 생체 알카라인 혜성 분석 및 효소 수정 알카라인 혜성 분석에서

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

A High-Throughput Comet Assay Approach for Assessing Cellular DNA Damage

Cells are continually exposed to agents arising from the internal and external environments, which may damage DNA. This damage can cause aberrant cell function, and therefore DNA damage may play a critical role in the development of, conceivably, all major human diseases, e.g., cancer, neurodegenerative and cardiovascular disease, and aging. Single-cell gel electrophoresis (i.e., the comet assay) is one of the most common and sensitive methods to study the formation and repair of a wide range of types of DNA damage (e.g., single- and double-strand breaks, alkali-labile sites, DNA-DNA crosslinks, and, in combination with certain repair enzymes, oxidized purines, and pyrimidines), in both in vitro and in vivo systems. However, the low sample throughput of the conventional assay and laborious sample workup are limiting factors to its widest possible application. With the "scoring" of comets increasingly automated, the limitation is now the ability to process significant numbers of comet slides. Here, a high-throughput (HTP) variant of the comet assay (HTP comet assay) has been developed, which significantly increases the number of samples analyzed, decreases assay run time, the number of individual slide manipulations, reagent requirements, and risk of physical damage to the gels. Furthermore, the footprint of the electrophoresis tank is significantly decreased due to the vertical orientation of the slides and integral cooling. Also reported here is a novel approach to chilling comet assay slides, which conveniently and efficiently facilitates the solidification of the comet gels. Here, the application of these devices to representative comet assay methods has been described. These simple innovations greatly support the use of the comet assay and its application to areas of study such as exposure biology, ecotoxicology, biomonitoring, toxicity screening/testing, together with understanding pathogenesis.

The comet assay is a popular means of detecting DNA damage. This study describes an approach to running slides in representative variants of the comet assay. This approach significantly increased the number of samples while decreasing assay run-time, the number of slide manipulations, and the risk of damage to gels.

세포 DNA 손상 평가를 위한 고처리량 혜성 분석 접근법

Cells are continually exposed to agents arising from the internal and external environments, which may damage DNA. This damage can cause aberrant cell ...

Comet Assay for DNA Damage Detection in Cells

To begin, prepare 0.6% low melting point agarose in PBS, and place it in a water bath at 37 degrees Celsius. Labeled the frosted end of the pre-coated slides with name, date, and treatment information using a permanent marker or pencil.
Place a chilling plate on a flat bench, and insert two frozen cooling packs into the sliding drawer below the metal surface. Then, place the slides on the chilling plate to pre-chill for 1 to 2 minutes. Centrifuge and remove the supernatant from the sample tubes, and place them immediately back on ice. Resuspend the cell pellet with 200 microliters of 0.6% low melting point agarose, and mix by pipetting.
Next, add 80 microliters of agarose-containing cells onto a chilled slide, and quickly place a coverslip on the gel. Allow the gel to set on the chilling plate for 1 to 2 minutes. In the meantime, prepare 500 milliliters of working solution of lysis buffer, and pour it into the lysis dish.
After the gels have set, remove the coverslips quickly by gently holding the slide between thumb and forefinger, and sliding the coverslip off the gel. Then, place the slides inside a slide carrier, with all the black dot marks on the slides facing in the same direction. Place the slide carrier inside the lysis dish. Close the lid of the lysis dish, and put it for incubation.
Carefully remove the slide carrier from the lysis dish without disturbing the gels. Gently, place the slide carrier in a washing dish pre-loaded with ice-cold double-distilled water. Ensure that the slides are completely submerged, and leave the setup for 30 minutes.
Place a frozen cooling pack under the electrophoresis tank to maintain optimal buffer temperature. Then, add ice-cold electrophoresis working solution to the tank, and transfer the slide carrier into it. Orient the slides, such that the cell containing gels point toward the cathode.
Incubate the slides in the electrophoresis tank for 20 minutes, to allow the DNA to unwind. Then, turn on the power supply to perform electrophoresis for 20 minutes at 1.19 volts per centimeter. After the electrophoresis is complete, turn off the power supply, and remove the slide carrier from the electrophoresis tank. Allow the slide carrier to drain on tissue paper for 30 seconds.
Next, place the slide carrier into a dish containing neutralization buffer, and leave it for 20 minutes. Following this, place it in a washing dish containing ice-cold double-distilled water, and leave it for 20 minutes. After washing, remove the slide carrier from the water, and allow the slides to dry in an incubator at 37 degrees Celsius for 1 hour.
To rehydrate the slides, transfer the slide carrier to a washing dish containing ice-cold double-distilled water and leave it for 30 minutes. Then, place the slide carrier into a staining dish containing 2.5 micrograms per milliliter propidium iodide solution.
Close the lid of the staining dish, and incubate it for 20 minutes in the dark at room temperature. After incubation, transfer the slide carrier to a separate dish, and wash it with ice-cold double-distilled water for 20 minutes.
Remove the slide carrier from the dish, and dry it completely in the dark, either in a 37 degrees Celsius incubator or at room temperature. After the slides dry completely, store them in a slide box in the dark until ready for image analysis.

세포의 DNA 손상 감지를 위한 Comet Assay

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Assay Techniques

Cell-based assays

EoE Sub Articles

Thiobarbituric Acid-Reactive Substances Assay to Assess Oxidative Stress in Human Serum

Label the glass tubes for the samples to be analyzed, then, add 100 microliters of the prepared sample to each tube. Add 200 microliters of 8.1% SDS to each sample, and gently swirl the glass tube in a circular motion to mix.
Add 1.5 milliliters of 3.5 molar sodium acetate buffer to each sample. Then, add 1.5 milliliters of aqueous 0.8% thiobarbituric acid solution. Bring the final volume in each tube to 4 milliliters by adding 700 microliters of deionized water. Tightly cap the glass tubes, and incubate them in a heating block set to 95 degrees Celsius for 1 hour. Cover the tubes with aluminum foil to prevent condensation. Then, remove the tubes from the block and incubate them on ice for 30 minutes.
After the incubation, centrifuge the samples and standards at 1,500 x g for 10 minutes at 4 degrees Celsius. Transfer 150 microliters of supernatant from each tube to a well in a 96-well plate, removing any air bubbles with a pipette tip.
Measure the absorbance of the samples at 532 nanometers. Then, subtract the average absorbance reading of the blank samples from all other absorbance readings.
Create a standard curve and use it to calculate unknown sample concentrations.

전신 산화 스트레스의 간접 측정으로 혜성 분석

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

DNA 손상 생체 외에서 혜성 분석 결과 사용 하 여 평가

CometChip : Microarrayed 인간의 세포에서 DNA 손상을 측정하기위한 높은 처리량 96 글쎄 플랫폼

라이트 농도의 변화에 Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

DNA 손상의 평가를 위한 혜성 분석에서 냉동 조직의 사용

혜성 분석을 사용하여 Hippocampal 뉴런의 DNA 손상을 시금

의 적용

쥐 간에서 DNA 가닥 나누기 및 산화 적 DNA 손상을 측정하기위한 생체 알카라인 혜성 분석 및 효소 수정 알카라인 혜성 분석에서

세포 DNA 손상 평가를 위한 고처리량 혜성 분석 접근법

세포의 DNA 손상 감지를 위한 Comet Assay

인간 혈청의 산화 스트레스를 평가하기 위한 티오바르비투르산 반응성 물질 분석

전신 산화 스트레스의 간접 측정으로 혜성 분석

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

DNA 손상 생체 외에서 혜성 분석 결과 사용 하 여 평가

CometChip : Microarrayed 인간의 세포에서 DNA 손상을 측정하기위한 높은 처리량 96 글쎄 플랫폼

라이트 농도의 변화에​​ Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

DNA 손상의 평가를 위한 혜성 분석에서 냉동 조직의 사용

혜성 분석을 사용하여 Hippocampal 뉴런의 DNA 손상을 시금

의 적용

쥐 간에서 DNA 가닥 나누기 및 산화 적 DNA 손상을 측정하기위한 생체 알카라인 혜성 분석 및 효소 수정 알카라인 혜성 분석에서

세포 DNA 손상 평가를 위한 고처리량 혜성 분석 접근법

세포의 DNA 손상 감지를 위한 Comet Assay

인간 혈청의 산화 스트레스를 평가하기 위한 티오바르비투르산 반응성 물질 분석

라이트 농도의 변화에 Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이