The authors acknowledge funding from the National Institutes of Health R21CA182333.

고분자 수성 2 단계 시스템 1. 준비 (ATPS) <ol><li> 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) (MW : 35,000) 0.5 g을 달아 수성 PEG 단계 (/ V W) 5 % 10 ㎖를 제조 멸균 15ml의 원뿔에서 완전 성장 배지 9.5 ml의 추가. 주 : 제 중합체를 추가하고 그 다음에 원뿔형 배지의 절반을 추가하는 것은 그 다음 매체의 잔량이 원추형 벽 중합체의 접착 성을 최소화하고, 중합체가 더 빨리 용해 돕는다. </li><li> 덱스 트란 (DEX) 0.128 g (MW : 500,000)를 달아 12.8 % (w / v)의 수용액 DEX 상 1 ㎖를 제조 멸균 1.5 ㎖의 마이크로 원심 분리 튜브에 완전 성장 배지의 0.872 ml의 추가. </li><li> 약 1 분 동안 와동 두 솔루션 배지에서 중합체를 용해. </li><li> 용해 및 균질 혼합물을 보장하기 위해 1 시간 동안 37 ℃에서 수욕에서 두 솔루션 유지. 목욕의 솔루션의 오염 가능성을 방지하기 위해 물 수준의 위 뚜껑을 유지물. </li><li> 멸균 플라스틱 주사기 내로 PEG 상 용액을로드 및 불순물을 제거하기 위해 0.2 ㎛의 공극 크기의 주사기 필터를 통해 전달한다. 천천히 필터를 통해 솔루션을 밀어, PEG 용액을 주사기를 채우기 원뿔 튜브의 상단과 힘을 사용하는 방법에 대한 필터의 삽입에 배치 참고. 그것은 주사기 플런저의 움직임에 대한 저항을 경험하는 정상입니다. 용액의 일부는 필터에 남아 있지만, 중합체의 농도가 변화하지 않으므로 중합체 용액 경미한 손실이 발생한다. </li><li> 피펫 10 DEX 위상 솔루션의 μL 및 별도의 튜브에 매체의 10 μL에 희석은 6.4 % (w / v)의 DEX 단계 솔루션을 초래할 수 있습니다. 대기음 100 PEG 상 용액 μL 및 페트리 접시로 분배. <ol><li> PEG 용액 상으로 DEX 상 용액 (V / w) 6.4 % 0.5 μl를 분배. 시각적으로 현미경 DEX 강하를 관찰하여 성공적인 ATPS 형성을 확인합니다. 드롭 경계두 안정, 별도의 수성 단계의 존재를 나타내는, 계속 표시해야합니다. </li></ol></li><li> 사용할 때까지 4 ° C에서의 주식 수성 PEG와 DEX 단계 솔루션을 저장합니다. 주 : 폴리머 솔루션은 이전에 각 실험에 신선한 준비 및 보관 24 시간 내에 사용하는 것이 좋습니다. </li></ol> 인쇄 암의 세포 타원체 2. 준비 <ol><li> 90 % -100 %의 융합 성 단층 관심 (예를 들면, MDA-MB-157 유방암 세포)의 암세포 성장. MDA-MB-157 세포, DMEM은 10 % FBS, 1 %의 글루타민, 및 1 % 항생 물질을 함유 이루어지는 매체를 사용한다. <ol><li> (제조사의 프로토콜에 따라)과 15 ML 원뿔에 서스펜션을로드 셀 분리 버퍼를 사용하여 수확 세포. , 173.3 XG에서 5 분 정도 원심 분리기 뜨는을 제거하고, 재현 탁 세포 완전한 성장 배지 1 ㎖에. </li></ol></li><li> 로드셀 상 혈구 계산하고이를 원하는 숫자를 계산하는원하는 회전 타원체 세포 밀도에 대한 세포의. T75 플라스크에 성장 MDA-MB-157 세포의 합류 단층은 보통 ~ 7 × 10 6 세포를 제공합니다. 주 :. 1.5 × 104 또는 MDA-MB-157 세포에 대한 큰 방울 체적에 필요한 세포 밀도가 단일 회전 타원체는 세포 유형에 의존 할 것이다 생성하기 위해 예를 들어 22, 밀도는 0.3 μL DEX 위상 드롭 당 권장 단일 회전 타원체의 형성을 보장합니다. </li><li> 173.3 XG에서 5 분 동안 원심 분리 두번째 세포 및 원하는 세포 밀도로 현탁 집중 성장 배지의 적당한 용적에 재현 탁 그들을. 참고 : 7 × 106 암세포 수확 예를 들어, 0.3 μL의 DEX 위상 강하는 1.5 × 104 세포 밀도의 타원체를 형성하는데 필요한 세포 현탁액의 총 부피는 140 μL 것이다. 그러나 인해 다음 단계에서 DEX 상 용액으로 희석 만 세포를 재현 탁하는 세포 배양 배지의 70 μl를 사용한다. </li><li&gt; 12.8 %의 동일 부피 (w / v)의 수용액 DEX 상 용액 1.2에서 제조 얻어진 세포 현탁액에 추가. 1.5 × 104 세포 밀도 타원체의 예를 들면, 위상 DEX 용액 70 μl의 세포 현탁액 70 μL를 첨가한다. </li><li> 철저히 세포 DEX 혼합 용액의 균일 한 분포를 보장하기 위해 세포 현탁액을 혼합한다. 피펫 위아래로 거품 형성을 방지하기 위해 조심스럽게 수행해야합니다. </li></ol> 공동 배양 타원체의 인쇄 3. 준비 <ol><li> 암 세포 성장 (예를 들어, MDA-MB-157 인간 유방암 세포) 및 90 % -100 %의 융합 성 단층을지지 세포 (예, 인간 섬유 아세포). (제조사의 프로토콜에 따라) 세포 해리 완충액을 이용하여 각 세포 유형 수확. <ol><li> 각 원뿔형 5 173.3 XG에 분하고, 흡인 상등액을 위해 그들을 원심 분리기, 15 ML 원뿔로 각각의 서스펜션을로드합니다. 완전한 g 1 ml의 각 원뿔의 재현 탁 세포rowth 매체. 참고 : 예컨대 칼 세인 AM (생균 얼룩) 핵 염색 (훽스트) 형광 염료는 두 종류의 세포를 구별하는데 사용될 수있다. </li></ol></li><li> 혈구에 별도로 각 세포 유형을로드하고 공 배양 세포 타원체를 지원하는 암세포의 원하는 비율에 대한 각각의 세포 유형의 필요한 개수를 계산하도록 계산. T75 플라스크에서 재배 합류 MDA-MB-157 세포의 단층 및 섬유 아 세포는 일반적으로 각각 ~ 7 × 10 6 ~ 6 × 10 6 세포를 제공합니다. </li><li> 두 종류의 세포 수의 바람직한 비율을 제공하는 암 세포에 세포 현탁액을지지 현탁액으로부터 정확한 볼륨. 예를 들어, 하나의 섬유 아세포 세포에 암 세포를 50의 비율을 사용한다. </li><li> 원심 적절한 부피 173.3 XG 재현 탁하고 세포에서 5 분 동안 혼합 세포 현탁액을 함유하는 수성 원추형 DEX (/ V W)와 동일한 성장 배지의 부피를 12.8 %의 최종 농도로 포함하는 결과(1.2에서 준비) 단계 솔루션입니다. </li><li> 부드럽게 현탁액의 균질성을 확인하기 위해 위아래로 얻어진 세포 현탁액을 피펫. </li></ol> 96- 웰 플레이트 종양 타원체 4. 인쇄 <ol><li> 어느 날 이전에 실험에, 1 % 코트 비 처리 된 둥근 바닥 96 웰 플레이트 24 시간 동안 37 ° C에서 (w는 / v)의 플루로 닉. 이 코팅은 배양 기간 동안 세포 부착을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 여과하고, 5 %의 50 μl를 분주를 96 웰 플레이트 (대상 판)의 각 웰에 PEG 수성 상 (/ V w). </li><li> 피펫을 사용하여, 세포 현탁액을 혼합 (2 단계 또는 각각 모노와 공동 문화에 대해 단계 3에서 제조) 및 384 웰 플레이트의 하나의 열 (소스 판)에서 잘 모든 다른 서스펜션의 20 μl를 추가 . </li><li> 액체 핸들러와 &quot;홈&quot;좌표를 등록하는 피펫 팅 머리를 켭니다. 그런 다음 실험 실용을 보장하기 위해 (4.6 이하) 이전에 정의 된 프로토콜을 컴파일하고 매개 변수가 올바른 정의LY. 이 &quot;원점 복귀&quot;단계는 다른 액체 핸들러 다를 수 있습니다. 참고 : 프로토콜의 흐름, 단계별로 아래 4.6에 관계없이 사용되는 로봇 액체 핸들러의 유사합니다 표시; 그러나, 프로그래밍 인터페이스는 다른 의한 소프트웨어의 사용으로 다르​​게 보일 수있다. </li><li> 도 1에 도시 된 바와 같이 액체 핸들러의 워크 스테이션의 위치에 정의 된 소스 플레이트, 대상 판, 피펫 팁 및 박스를 배치. </li><li> 다음 단계를 포함하는 프로토콜을 실행 <ol><li> 로드 워크 스테이션 (그림 1)에서 피펫 팁 (8 팁) 믹싱 액체 핸들러의 피펫 팅 헤드로부터 배럴 중 하나 열입니다. </li><li> 소스 플레이트 (도 1)의 웰에 세포 현탁액을 혼합한다. 기포 형성을 방지하기 웰에 세포 현탁액의 부피보다 작은 혼합 볼륨을 선택. </li><li> 빈 폐기물 팁 상자 (그림 1)에 팁을 꺼냅니다. </li&gt; <li> 부하 10 μL 분배 피펫 팁 피펫 헤드로부터 배럴의 하나의 열 (그림 1). </li><li> 대기음 각 피펫 팁으로 소스 플레이트에서 세포 현탁액 0.3 μL (도 1). </li><li> 대상 판의 하나의 열 (도 1)의 웰에 세포 현탁액을 분배. 0.5 mm의 높이 및 분배 미만 1 μL / sec의 분사 유량을 사용한다. </li><li> 전체 대상 플레​​이트에 컬럼 별 인쇄가 완료 될 때까지 반복 4.6.6을 통해 4.6.1 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 조심스럽게 워크 스테이션 표면에서 대상 플레이트를 제거하고 CO 2를 37 ° C에서 습기가 인큐베이터에 배치하고 5 %. 세포를 포함하는 위상 DEX 방울의 교란을 방지하기 인큐베이터로 운반시 접시 수평을 유지한다. </li><li> DEX 단계 드롭 내에서 회전 타원체로 세포의 응집을 할 수 있도록 24 시간 동안 접시를 품어. </li></ol> &lt;P 클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. 암 세포 타원체의 약물 치료 다음 프로토콜은 4 일간의 약물 치료이며, 그것은 다른 치료 기간을 수정할 수 있습니다 일 2. 후 신선한 약물과 갱신이 포함되어 있습니다. <ol><li> 시각 24 시간 후 96 웰 플레이트의 회전 타원체의 형성을 확인합니다. 각 회전 타원체의 최소 및 최대 직경을 평균하여 타원체의 크기 측정을위한 이미지 우물을 필요로합니다. </li><li> 소정의 용해도 농도 제조사 권장 용매 및 원하는 약물의 원액을 준비한다. 예를 들어, ㎖ / 2 mg을 물에 시스플라틴을 용해. 주 : 약물이 빛에 민감한 경우 빛으로부터 약물의 원액을 보호합니다. </li><li> 시리얼 희석 기술을 사용하여, 이전 단계에서 제조 스톡 용액으로부터 세포 배양 배지로 희석 약물 농도를 준비한다. 각 회 희석하여 원하는 농도가 이루어져야한다. DIL의 ution 비율은 시작 재고 농도에 따라 달라질 수 및 작업 농도를 원하는 것입니다. </li><li> 각 웰에 이전 단계에서 제조 된 약물 용액 50 μL를 추가한다. 이 로봇 또는 수동 피펫 팅하여 수행 할 수 있습니다. 주 : 각 약물 농도는 각 웰에 50 ㎕의 이미 PEG 수성 상으로 원하는 농도로 반으로 희석한다. <ol><li> 각 농도 96 웰 플레이트 (N = 16)의 두 개의 열에서 타원체를 사용합니다. </li><li> 대조군 웰에서, PEG 수성상의 기존 50 μL 신선한 배지의 50 μL를 추가한다. </li></ol></li><li> 빛으로부터 보호 된 37 ° C에서 48 시간 및 5 % CO 2,위한 약물과 타원체 부화. </li><li> 배양 48 시간 후, 소정 농도의 신선한 약물 희석액을 제조하고 각 웰에 신선한 약물 용액 50 μl를 첨가하여 약제를 갱신. 주 : 웰이 이미 제 약물 t에서 원하는 약물 농도를 포함reatment. 더 희석이 발생하지 않는 것이므로 따라서 갱신이 단계에서, 각각의 농도가 목적하는 농도로 제조한다. </li><li> 빛으로부터 보호 37 ° C에서 또 다른 48 시간 동안 약 5 % CO 2와 타원체를 품어. </li></ol> 6. 타원체의 세포 생존 능력의 분석 <ol><li> 갱신 약물 (즉, 약물과 타원체의 처리의 총 시간 4 일)와 배양 48 시간 후, 잘 매뉴얼 피펫 팅에 의해 하나의 매체의 총 부피를 측정한다. 참고 : 하나 잘 일반적인 볼륨이 140 μl의 (작은 감소는 증발로 인해 발생) ~이다. </li><li> 웰 총 부피의 10 % 농도 세포 생존 시약 (예 PrestoBlue)의 체적을 계산한다. 각 웰에 세포 생존 시약이 볼륨을 추가합니다. 주 : 웰 140 μL의 기존 미디어 부피, 15.6 μL의 부피는 웰의 총 농도 10 %를 제공 할 필요가있다. 이 계산됩니다9 (140 μL / 9 = 15.6 μL)에 의해 기존의 미디어 볼륨을 분할. </li><li> 빛으로부터 보호 된 37 ° C에서 6 시간 동안 각각의 웰에 첨가 세포 생존 시약, 접시를 인큐베이션. </li><li> 마이크로 플레이트 리더에서 접시를 놓고 각각 560 nm에서 590 nm의 여기 및 방출 파장에서 형광 신호를 읽어보십시오. </li><li> 동일한 처리 조건에서 값을 평균 한 후 대조군 웰의 처리함으로써 웰로부터 형광 신호를 정규화하여 타원체에서 세포의 생존 비율을 계산한다. </li></ol>

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Chem. 86, 4052-4057 (2014).</li><li>Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+spatio-temporally+controlled+cell+microprinting+with+polymeric+aqueous+biphasic+system.">Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system.</a> Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).</li><li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanolitre+liquid+patterning+in+aqueous+environments+for+spatially+defined+reagent+delivery+to+mammalian+cells.">Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells.</a> Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).</li><li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+aqueous+biphasic+system+rehydration+facilitates+high+throughput+cell+exclusion+patterning+for+cell+migration+studies.">Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies.</a> Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).</li><li>Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+aqueous+biphasic+systems+for+non-contact+cell+printing+on+cells:+engineering+heterocellular+embryonic+stem+cell+niches.">Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches.</a> Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).</li><li>Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprinted+feeder+cells+guide+embryonic+stem+cell+fate.">Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).</li><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).</li><li>Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mammary+fibroblasts+stimulate+invasion+of+breast+cancer+cells+in+a+three-dimensional+culture+and+increase+stroma+development+in+mouse+xenografts.">Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts.</a> BMC Cancer. 10, 444 (2010).</li><li>Ozdemir, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+carcinoma-associated+fibroblasts+and+fibrosis+induces+immunosuppression+and+accelerates+pancreas+cancer+with+reduced+survival.">Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival.</a> Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).</li><li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+formation+of+PC-3+prostate+cancer+co-culture+spheroids.">Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids.</a> Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).</li><li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer.">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).</li><li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer.">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).</li><li>Bissell, M. J., Radisky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+tumours+in+context.">Putting tumours in context.</a> Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

스페 로이드 잘 종양 생리학 및 약물 효능을 이해하고 항암 약물 개발을위한 유용한 도구를 제공하는 실제적인 모델을 제시한다. 이러한 응용 프로그램은 크게 만 표준 실험 실용 액체 처리 도구 및 선별 장비를 필요로 간단한 회전 타원체 생성 및 유지 보수 기술 혜택을 누릴 것입니다. 수성 개의 상 시스템 드롭 위상 내로 자발적 집합체 암세포의 사용은 효율적인 생산과 로봇 액체 핸들러 타원?...

세포 기반 분석법을 개발 및 새로운 항암 약물의 발견을위한 중요한 도구를 제공한다. 1,2 역사적으로, 암 세포의 단층 배양 물은 암 세포의 특정 유형에 대한 후보 화합물의 효과를 조사하기 위해 사용되어왔다. 표준 배양 플레이트에 단층 문화의 유지 보수의 용이성, 시약을 첨가 한 상용 로봇 도구와 표준 플레이트의 호환성 및 화학 물질에 대한 세포 반응의 다운 스트림 분석을위한 검사 장비와는 2D 문화에게 매력적인 도구를 렌더링의 주요 장점은 약물 테스트를 위해. 3 불행하게도, 단층 세포 분석은 종종 신약 개발과 발견을 매우 비용이 많이 드는 과정을, 생체 내에서 화합물의 효능을 예측하지 못한다. 4,5 제약 회사 학술 단위, 만 ~ 1 %로 상당한 투자와 노력에도 불구하고 항암제의 임상 시험에서 약물이 승인되었다지난 20 년간 FDA에 의해. 차원 배양 및 생체 내에서 암세포의 복잡한 3D 환경 사이 6 격차가 단층 배양 시스템의 주요 단점이다. (7) 따라서, 설정에서 종양 세포에 대한 후보 화합물 스크리닝은 더 밀접하게 닮았다 3D 종양 환경은 새로운 화학 요법 약물의 개발을 촉진 할 수있다. (8) 암세포 타원체는 시험관 내에서 중요한 3D 종양 모델을 제시한다. 9,10 타원체는 비 - 부착 표면 또는 스피너 플라스크, 액체 오버레이, 미세 마이크로 같은 기법을 사용하여 현탁액 중의 암세포의 자발 또는 유도 조립체를 통해 형성 컴팩트 클러스터 아르 . 어레이, 미세 유체 및 매달려 방울도 11 ~ 16 타원체는 형상과 중앙 영역에 산소, 영양분, 약물 화합물의 제한으로 전송을 포함한 고형 종양의 주요 기능을 모방; 따라서, 그들은 더 밀접하게 약물 respon를 재생단층 문화에 비해 고형 종양의 자체.이 현저한 이점에도 불구하고 17 ~ 19, 타원체 정기적으로 암 세포에 대한 화학 물질의 스크리닝에 사용되지 않습니다. 상업적으로 이용 가능한 로봇 및 심사 / 이미징 도구와 호환되는 표준 높은 처리량 설정에서 균일 한 크기의 타원체를 생산 난이도는 신약 개발 파이프 라인으로 회전 타원체 문화의 결합을 방해. 사용자 정의 재료와 플레이트는 최근 이러한 요구를 해결하기 위해 시중에서 판매되고 있지만, 비용을 고려은 광범위한 사용을 방지. 새로운 매달려 드롭 플랫폼과 미세 마이크로 우물을 사용하여 높은 처리량의 일관된 크기의 타원체를 생산하는 기능이있는 두 가지 주요 기술. 13,16,20 그러나, 두 가지 접근 방식은 특별한 접시와 제작이 비싸고 엔드 포인트 사용자를위한 불편 장치가 필요 핵심 연구 센터 및 제약 산업 대부분의 주요 EF에서새로운 항암 약물의 발견을위한 요새가 만들어진다. 드롭 플레이트 매달려의 최근 디자인 세포 함유 방울의 안정성에 약간의 개선에도 불구하고, 판 매 다른 구멍은 여전히 방울의 확산 / 병합을 방지하기 위해 문화 중에 사용됩니다. (16)이 크게 실험 처리량을 감소시킨다. 의약품 추가 및 갱신은 수동 또는 로봇 피펫으로 어려운이 판 구성은 플레이트 리더로 기존의 검사 장비와 쉽게 호환되지 않기 때문에 타원체는 생화학 적 분석을위한 표준 플레이트에 전달 될 ​​필요가있다. (21) 마이크로 웰은 또한 소프트 리소그래피를 사용하여 제작 제어 크기 회전 타원체 생산을 할 수 있습니다. 13, 20을하지만, 표준 피펫 팅 툴이 플랫폼의 호환성은 단일 처리 조건에 모든 구 상체를 노출, 다른 약 화합물 / 농도 개별 타원체의 치료 방지 할 수 있습니다. 따라서,이 방법은 높은 적합하지 않다여러 화합물 / 농도의 동시 테스트를 필요로 처리 화합물 스크리닝. 이러한 장애를 극복하기 위해, 표준 96 웰 플레이트에서 일관 크기 암세포 타원체의 높은 처리량의 생산을위한 새로운 기술이 개발되었다. 22, 23 접근법은 폴리에틸렌 글리콜 중합체 수성 개의 상 시스템 (ATPS ()에 기초 상 형성 중합체와 같은 PEG)과 덱스 트란 (DEX). (24) ATPSs는 최근 셀의 미세화를 가능하게하는 새로운 세포 생물학적 다양한 응용 분야에 활용이 높은 수성 미디어의 셀에 생물학적 시약의 전달을 현지화하고있다. 25 ~ 32을 형성하기 회전 타원체가 암세포 DEX 수성 상과 현탁액의 서브 드롭 마이크로 리터와 혼합이 잘 함유 수성 침지 PEG 용액 상으로 피펫 팅한다. 드롭 타원체의 형성을 용이하게하기 위해 침지 위상 및 경계 셀에서 혼화 남아있다. 꼬마 도깨비ortantly, 높은 수성 침지 단계는 회전 타원체의 세포에 영양분을 제공하며, 미디어 삼투압 변화 및 ​​약물 농도의 변동을 일으키는 다른 분석법에 공통 매체 증발의 잘 알려진 문제를 최소화한다. 이 기술은 회전 타원체 생산에만 표준 96- 웰 플레이트에서 시판 시약 피펫 팅 도구를 사용하여 약물 치료를 가능하게한다. 중요한 것은, 타원체의 세포 반응의 분석은 표준 생화학 검정 및 플레이트 판독기를 사용하여 동일한 플레이트에서 수행된다. 로봇 액체 처리에 대한 접근 방식의 ATPS과 적응성 작업의 용이성 모노 문화 및 공동 문화 모두의 높은 처리량 생성이 간단 실험실 기술을 타원체 있습니다. 이 새로운 접근 방식은 개선 된 테스트 처리량 및 테스트 화합물과 redu의 수가 증가 비용 효율성 (와 약물 개발 및 검색 프로세스에 암 세포 타원체의 통합을 향해 앞으로 중요한 단계가 될 것입니다CED 시약 소비)과 효율성 (시간에 손을 감소). ATPS 접근법을 사용하여 96- 웰 플레이트에서 암세포 타원체의 로봇 제조 상세한 프로토콜 설명한다. 또한, 얻어진 타원체와 상용 생화학 분석을 이용하여 세포 반응의 분석 하류의 약물 치료의 세부 사항이 제시된다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagents and Consumables&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Polyethylene glycol, MW: 35,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94646</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, MW: 500,000</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0500 9007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Clacein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>15663-27-1</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue</td><td>Life Technologies</td><td>A-13261</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-108</td><td>Sigma Aldrich</td><td>542342</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Tips (10 &amp;micro;l)</td><td>Fluotics</td><td>C-P10V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Tips (70 &amp;micro;l)</td><td>Fluotics</td><td>C-P70V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>Round-bottom 96-well plates</td><td>Nunc</td><td>268200</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Liquid Handler</td><td>Agilent Technologies</td><td>SRT Bravo</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Biotek Instruments</td><td>Synergy H1M</td><td></td></tr></tbody></table>

robotic production of cancer cell spheroids with an aqueous two-phase system for drug testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

로봇 액체 핸들러의 워크 스테이션. 그림 1의 피펫 팅 헤드와 4.6에서 타원체의 로봇 인쇄에 사용 된 모든 방송국이 표시되어있다. 이미지는 팁 상자에 대한 두 개의 서로 다른 스테이션 (한 믹싱 팁 세트와 세포 현탁액 수성 DEX 상 혼합물의 / 분배를 흡입에 대한 두 번째 세트)를 사용하는 방법을 보여줍니다. 전체 셋업은 무균 상태를 유지하기 위해 표준 생물학적 안전 캐비닛 내에 수?...

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Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

약물 테스트를위한 수성 2 단계 시스템으로 암 세포 타원체의 로봇 생산

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.9K 조회수.  The University of Akron. A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

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Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with or without surgery. While platinum-based chemotherapy regimens currently represent the gold standard in terms of efficacy and are given in the vast majority of cases, new chemotherapy regimens, namely immunotherapy are emerging. However, the response rates and therapy resistance mechanisms for either chemo regimen are hard to predict and remain insufficiently understood. Broad variations of chemo and radiation resistance mechanisms are known to date. This study describes the development of a standardized, high-throughput in vitro assay to assess HNSCC cell line&#39;s response to various therapy regimens, and hopefully on primary cells from individual patients as a future tool for personalized tumor therapy. The assay is designed to being integrated into the quality-controlled standard algorithm for HNSCC patients at our tertiary care center; however, this will be subject of future studies. Technical feasibility looks promising for primary cells from tumor biopsies from actual patients. Specimens are then transferred into the laboratory. Biopsies are mechanically separated followed by enzymatic digestion. Cells are then cultured in ultra-low adhesion cell culture vials that promote the reproducible, standardized and spontaneous formation of three-dimensional, spheroid-shaped cell conglomerates. Spheroids are then ready to be exposed to chemo-radiation protocols and immunotherapy protocols as needed. The final cell viability and spheroid size are indicators of therapy susceptibility and therefore could be drawn into consideration in future to assess the patients&#39; likely therapy response. This model could be a valuable, cost-efficient tool towards personalized therapy for head and neck cancer.

We describe the evolution of a spheroid-based, three-dimensional in vitro model that enables us to test the current standard of experimental therapy regimens for head and neck squamous cell carcinoma on cell lines, aiming at evaluating therapy susceptibility and resistance on primary cells from human specimens in the future.

머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 회전 타원 체 기반 3D 셀 문화 모델에서 테스트 하는 치료

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

연구

암 연구학

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is exposed to in vivo. Solid tumors grow not as a sheet attached to plastic, but instead as a collection of clonal cells in a three-dimensional (3D) space interacting with their neighbors, and with distinct spatial properties such as the disruption of normal cellular polarity. These interactions cause 3D-cultured cells to acquire morphological and cellular characteristics which are more relevant to in vivo tumors. Additionally, a tumor mass is in direct contact with other cell types such as stromal and immune cells, as well as the extracellular matrix from all other cell types. The matrix deposited is comprised of macromolecules such as collagen and fibronectin.
In an attempt to increase the translation of research findings in oncology from bench to bedside, many groups have started to investigate the use of 3D model systems in their drug development strategies. These systems are thought to be more physiologically relevant because they attempt to recapitulate the complex and heterogeneous environment of a tumor. These systems, however, can be quite complex, and, although amenable to growth in 96-well formats, and some now even in 384, they offer few choices for large-scale growth and screening. This observed gap has led to the development of the methods described here in detail to culture tumor spheroids in a high-throughput capacity in 1536-well plates. These methods represent a compromise to the highly complex matrix-based systems, which are difficult to screen, and conventional 2D assays. A variety of cancer cell lines harboring different genetic mutations are successfully screened, examining compound efficacy by using a curated library of compounds targeting the Mitogen-Activated Protein Kinase or MAPK pathway. The spheroid culture responses are then compared to the response of cells grown in 2D, and differential activities are reported. These methods provide a unique protocol for testing compound activity in a high-throughput 3D setting.

Across a wide variety of disease indications, more physiologically relevant models are being developed and implemented into drug discovery programs. The new model system described here demonstrates how three-dimensional tumor spheroids can be cultured and screened in a high-throughput 1536-well plate-based system to search for new oncology drugs.

마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric antigen receptor (CAR) redirected T cells obtained the most spectacular results, in particular with pediatric B-acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Classical validation methods of CAR T cells rely on the use of specificity and functionality assays of the CAR T cells against target cells in suspension and in xenograft models. Unfortunately, observations made in vitro are often decoupled from results obtained in vivo and a lot of effort and animals could be spared by adding another step: the use of 3D culture. The production of spheroids out of potential target cells that mimic the 3D structure of the tumor cells when they are engrafted into the animal model represents an ideal alternative. Here, we report an affordable, reliable and easy method to produce spheroids from a transduced colorectal cell line as a validation tool for adoptive cell therapy (exemplified here by CD19 CAR T cells). This method is coupled with an advanced live imaging system that can follow spheroid growth, effector cells cytotoxicity and tumor cell apoptosis.

This protocol is designed to assess immunotherapeutic redirected T-cell (CAR T-cell) cytotoxicity against 3D structured cancerous cells (spheroids) in real time.

자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically relevant than conventional adherent-sheet cultures, they more accurately recapitulate the complexity and interactions present in real tumors. In order to harness this model to better assess tumor biology, or the efficacy of novel therapeutic agents, it is necessary to be able to generate spheroids reproducibly, in a controlled manner and in significant numbers.
The AggreWell system consists of a high-density array of pyramid-shaped microwells, into which a suspension of single cells is centrifuged. The numbers of cells clustering at the bottom of each microwell, and the number and ratio of distinct cell types involved depend only on the properties of the suspension introduced by the experimenter. Thus, we are able to generate tumor spheroids of arbitrary size and composition without needing to modify the underlying platform technology. The hundreds of microwells per square centimeter of culture surface area in turn ensure that extremely high production levels may be attained via a straightforward, nonlabor-intensive process. We therefore expect that this protocol will be broadly useful to researchers in the tumor spheroid field.

We introduce a protocol for the generation of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of uniform size- and composition-controlled tumor spheroids, using commercially available microwell plates.

마이크로 웰 플레이트를 사용하여 크기 조절 종양 상체 많은 수의 생산

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

생체공학

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of anti-cancer therapeutics in a physiologically representative microenvironment. We outline the formation of patient derived cancer stem cell spheroids, as well as, the manipulation of these spheroids for thorough analysis following drug treatment. Specifically, we describe collection of spheroid morphology, proliferation, viability, drug toxicity, cell phenotype and cell localization data. This protocol focuses heavily on analysis techniques that are easily implemented using the 384-well hanging drop platform, making it ideal for high throughput drug screening. While we emphasize the importance of this model in ovarian cancer studies and cancer stem cell research, the 384-well platform is amenable to research of other cancer types and disease models, extending the utility of the platform to many fields. By improving the speed of personalized drug screening and the quality of screening results through easily implemented physiologically representative 3D cultures, this platform is predicted to aid in the development of new therapeutics and patient-specific treatment strategies, and thus have wide-reaching clinical impact.

This protocol describes generation of patient-derived spheroids, and downstream analysis including quantification of proliferation, cytotoxicity testing, flow cytometry, immunofluorescence staining and confocal imaging, in order to assess drug candidates&#8217; potential as anti-neoplastic therapeutics. This protocol supports precision medicine with identification of specific drugs for each patient and stage of disease.

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the evaluation of anticancer drugs. However, the conventional culture methods lack the ability to manipulate the tumor spheroids in a homogeneous manner at the three-dimensional level. To address this limitation, in this paper, we present a convenient and effective method of constructing average-sized tumor spheroids. Additionally, we describe a method of image-based analysis using artificial intelligence-based analysis software that can scan the whole plate and obtain data on three-dimensional spheroids. Several parameters were studied. By using a standard method of tumor spheroid construction and a high-throughput imaging and analysis system, the effectiveness and accuracy of drug tests performed on three-dimensional spheroids can be dramatically increased.

This article demonstrates a standardized method for constructing three-dimensional tumor spheroids. A strategy for spheroid observation and image-based deep-learning analysis using an automated imaging system is also described.

약물 평가 연구를 위한 3D 종양 스페로이드 생성

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell cultures. The clinostat mimics an environment where cells can assemble as highly reproducible spheroids with low shear forces and active nutrient diffusion. We demonstrate that both cancer and non-cancer hepatocytes (HepG2/C3A and THLE-3 cell lines) require 3 weeks of growth prior to achieving functionalities comparable to liver cells. This protocol highlights the convenience of utilizing incubators for 3D cells with cameras monitoring the cell growth, as snapshots can be taken to count and measure spheroids upon treatment. We describe the comparison of THLE-3 and HepG2/C3A cell lines, showing how non-cancerous cell lines can be grown as well as immortalized cancer cells. We demonstrate and illustrate how proteomics experiments can be conducted from a few spheroids, which can be collected without perturbing cell signaling, i.e., no trypsinization required. We show that proteomics analysis can be used to monitor the typical liver phenotype of respiratory chain metabolism and the production of proteins involved in metal detoxification and describe a semi-automated system to count and measure the spheroid's area. Altogether, the protocol presents a toolbox that comprises a phenotypic characterization via image capture and a proteomics pipeline to experiment on 3D cell culture models.

We present a protocol for growing high-reproducible spheroids and their phenotypic characterization using image capture and proteomics.

기능적 3D 스페로이드 세포 배양의 반자동 표현형 분석

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

생화학

FLIM 기반 대사 및 저산소증 분석을 위한 다세포 스페로이드 형성

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

저자 스포트라이트: Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy를 사용한 대사 및 산소화 분석을 위한 스페로이드 형성 방법 표준화

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

약물 테스트를위한 수성 2 단계 시스템으로 암 세포 타원체의 로봇 생산

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 회전 타원 체 기반 3D 셀 문화 모델에서 테스트 하는 치료

마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

마이크로 웰 플레이트를 사용하여 크기 조절 종양 상체 많은 수의 생산

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

약물 평가 연구를 위한 3D 종양 스페로이드 생성

기능적 3D 스페로이드 세포 배양의 반자동 표현형 분석

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)