Name: robotic production of cancer cell spheroids with an aqueous two-phase system for drug testing
Uploaded: 2015-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing at JoVE.com

The authors acknowledge funding from the National Institutes of Health R21CA182333.

1. Preparazione di polimerici acquosa Due sistema Phase (ATPS) <ol><li> Pesare 0,5 g di polietilene glicole (PEG) (MW: 35.000) e aggiungerlo al 9,5 ml di terreno di coltura completo in una sterile 15 ml conica per preparare 10 ml di 5% (w / v) di fase acquosa PEG. Nota: Aggiungendo la metà del mezzo alla conica per prima, seguita dalla aggiunta il polimero e quindi la quantità rimanente di supporto minimizza l&#39;adesione del polimero alle pareti coniche e aiuta il polimero sciogliere velocemente. </li><li> Pesare 0,128 g di destrano (DEX) (MW: 500.000) e aggiungerlo al 0,872 ml di terreno di coltura completo in una provetta sterile da 1,5 ml microcentrifuga per preparare 1 ml del 12,8% (w / v) fase DEX acquosa. </li><li> Soluzioni Vortex entrambi per circa 1 minuto per sciogliere i polimeri nel mezzo. </li><li> Tenere entrambe le soluzioni in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 1 ora per assicurare dissoluzione e miscele omogenee. Tenere i tappi sopra il livello dell&#39;acqua per evitare la possibilità di contaminazione delle soluzioni dal bagnoacqua. </li><li> Caricare la soluzione fase PEG in una sterile, siringa di plastica e farla passare attraverso un filtro siringa da 0,2 micron dimensione dei pori per rimuovere le impurità. Nota: Riempire la siringa con la soluzione di PEG, posizionarlo nell&#39;inserto del filtro sopra un tubo conico e usando la forza, spingere lentamente la soluzione attraverso il filtro. È normale che si verifichi resistenza contro il movimento dello stantuffo della siringa. Minor perdita della soluzione polimerica si verifica come parte della soluzione rimarrà nel filtro, ma la concentrazione di polimero non cambierà. </li><li> Pipettare 10 microlitri della soluzione di fase DEX e diluire a 10 ml di mezzo in un tubo separato per provocare 6,4% (w / v) di fase DEX. Aspirare 100 ml di soluzione di fase PEG e versare in una capsula di Petri. <ol><li> Pipettare 0,5 ml di 6,4% (w / v) di fase nella soluzione di DEX fase di PEG. Visivamente confermare successo formazione ATPS osservando una goccia DEX al microscopio. Il confine gocciadovrebbe rimanere visibile, indicando la presenza di due fasi, distinte acquose stabili. </li></ol></li><li> Conservare lo stock acquosa PEG e soluzioni di fase DEX a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. Nota: Si raccomanda di soluzioni polimeriche sono preparati freschi prima di ogni esperimento e utilizzati entro 24 ore di archiviazione. </li></ol> 2. Preparazione per la stampa di cancro Spheroids Cellulari <ol><li> Crescere le cellule tumorali di interesse (ad esempio, le cellule MDA-MB-157 cancro al seno) per un 90% -100% confluenti monostrato. Per MDA-MB-157 cellule, usare un mezzo costituito di DMEM contenente 10% FBS, 1% glutammina e 1% di antibiotici. <ol><li> Celle di raccolta con un tampone di dissociazione cellulare (secondo il protocollo del produttore) e caricare la sospensione in una conica da 15 ml. Centrifugare per 5 min a 173,3 xg, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di terreno di coltura completo. </li></ol></li><li> Le celle di carico su un emocitometro e contare di calcolare il numero richiestodi cellule per una densità cellulare sferoidale desiderato. Un monostrato confluente di MDA-MB-157 cellule cresciute in un pallone T75 solito dà ~ 7 x 10 6 cellule. Nota:. Densità cellulare Richiesto per un volume di goccia per generare un singolo sferoide dipenderà dal tipo cellulare 22 Per esempio, una densità di 1,5 x 10 4 o maggiore per MDA-MB-157 cellule è raccomandato in 0,3 ml di fase DEX drop garantire la formazione di un unico sferoide. </li><li> Cellule di centrifugazione per una seconda volta per 5 minuti a 173,3 xg e risospendere in un volume adeguato di terreno di crescita per concentrare la sospensione ad una densità cellulare desiderata. Nota: Ad esempio, se sono state raccolte 7 x 10 6 cellule tumorali, il volume totale della sospensione cellulare richiesta per formare uno sferoide di densità di 1,5 x 10 4 cellule in 0,3 ml DEX fase goccia sarà di 140 microlitri. Tuttavia a causa della diluizione con soluzione di fase DEX nella fase successiva, utilizzare solo 70 ml di mezzo di coltura cellulare per risospendere le cellule. </li><li&gt; Aggiungere alla sospensione cellulare risultante un volume uguale del 12,8% (w / v) Soluzione acquosa fase DEX preparato in 1.2. Per l&#39;esempio di 1,5 x 10 4 cellule di densità sferoidale, 70 microlitri della soluzione di fase DEX viene aggiunto a 70 ml di sospensione cellulare. </li><li> Mescolare bene la sospensione cellulare per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule e miscelazione di soluzione DEX. Pipettando su e giù dovrebbe essere fatto con delicatezza per evitare la formazione di bolle. </li></ol> 3. Preparazione per la stampa di Spheroids Co-coltura <ol><li> Crescere cellule tumorali (per esempio, MDA-MB-157 cellule di cancro al seno umano) e le cellule di supporto (ad esempio, fibroblasti umani) ad un 90% -100% confluenti monostrato. Raccogliere ogni tipo di cellula con un buffer di dissociazione cellulare (secondo il protocollo del produttore). <ol><li> Caricare ogni sospensione in un conica 15 ml, li centrifugare per 5 min a 173,3 xg, e aspirare il surnatante da ciascun conica. Risospendere le cellule di ogni conica in 1 ml di completo grescita media. Nota: Coloranti fluorescenti come calceina AM (macchia cellule vive) e coloranti nucleari (Hoechst) possono essere utilizzati per distinguere i due tipi di cellule. </li></ol></li><li> Caricare ciascun tipo di cellula separatamente su un emocitometro e contarli per calcolare il numero di ciascun tipo di cellula per un rapporto desiderato di cellule tumorali di cellule di supporto in sferoidi co-coltura. Monostrati confluenti di MDA-MB-157 cellule e fibroblasti coltivate in fiasche T75 solito danno ~ 7 x 10 6 e ~ 6 x 10 6 cellule, rispettivamente. </li><li> Aggiungere il volume corretto dalla sospensione di cellule di supporto alle cellule tumorali sospensione invia un rapporto desiderato del numero di due tipi di cellule. Ad esempio, utilizzare un rapporto di 50 cellule tumorali a 1 fibroblasti. </li><li> Centrifugare la conica contenente la sospensione cellulare mista per 5 min a 173,3 XG e risospendere le cellule in un volume adeguato al risultato della densità finale comprendente dei volumi uguali di mezzo di crescita e l&#39;12,8% (w / v) DEX acquosaSoluzione fase (preparato in 1.2). </li><li> Pipettare delicatamente la sospensione cellulare risultante su e giù per assicurare l&#39;omogeneità della sospensione. </li></ol> 4. La stampa di Spheroids tumorali in una piastra a 96 pozzetti <ol><li> Un giorno prima esperimenti, cappotto lastre non trattate, a fondo tondo da 96 pozzetti con 1% (w / v) Pluronic a 37 ° C per 24 ore. Questo rivestimento impedisce l&#39;adesione delle cellule durante il periodo della cultura. </li><li> Pipettare 50 ml di filtrato 5% (w / v) fase acquosa PEG in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti (piastra di destinazione). </li><li> Utilizzando una pipetta, mescolare la sospensione cellulare (preparata al punto 2 o 3 step per mono e co-coltura, rispettivamente) e aggiungere 20 ml di sospensione di ogni altro bene da una colonna di una piastra 384 pozzetti (targa fonte) . </li><li> Accendere il gestore liquido e &quot;casa&quot; il capo di pipettaggio per registrare le coordinate. Quindi compilare un protocollo già definito (di seguito in 4.6) al fine di garantire da laboratorio e parametri sono definiti correttoly. Questo passo &quot;homing&quot; può essere diverso per i diversi gestori di liquidi. Nota: Il flusso del protocollo, mostrato passo-passo di seguito in 4.6, sarà simile a prescindere dal gestore liquido robotica utilizzato; Tuttavia, l&#39;interfaccia di programmazione può differire a causa dell&#39;uso di diversi software. </li><li> Posizionare la piastra di origine, la piastra di destinazione, e scatole di tip pipetta in posizioni definite sulla workstation del gestore liquido come mostrato in Figura 1. </li><li> Eseguire il protocollo che prevede le seguenti fasi: <ol><li> Caricare una colonna di barili dalla testa pipettaggio del gestore liquido con miscelazione punte per pipette (8 punte) dalla stazione di lavoro (Figura 1). </li><li> Mescolare la sospensione cellulare in pozzetti della piastra di sorgente (Figura 1). Selezionare un volume di miscelazione inferiore al volume di sospensione cellulare in pozzetti per evitare la formazione di bolle. </li><li> Espellere punte in una scatola discariche vuota (Figura 1). </li&gt; <li> Caricare una colonna di barili dalla testa pipettaggio con 10 microlitri di erogazione punte per pipette (Figura 1). </li><li> Aspirare 0,3 ml di sospensione cellulare dalla piastra sorgente (Figura 1) in ciascuna punta della pipetta. </li><li> Distribuire la sospensione cellulare nei pozzetti di una colonna della piastra di destinazione (Figura 1). Utilizzare un&#39;altezza erogazione di 0,5 mm e una portata di erogazione inferiore a 1 ml / sec. </li><li> Ripetere i passaggi attraverso 4.6.1 4.6.6 finché la stampa di colonna per colonna nella intera piastra destinazione è completa. </li></ol></li><li> Rimuovere con cautela la piastra di destinazione dalla superficie workstation e collocarlo in un incubatore umido a 37 ° C e 5% di CO 2. Mantenere la piastra orizzontale durante il trasporto in incubatrice per evitare di interrompere di DEX gocce fase contenenti cellule. </li><li> Incubare la piastra per 24 ore per permettere l&#39;aggregazione di cellule in uno sferoide all&#39;interno della goccia fase DEX. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Trattamento farmacologico della Cancer Spheroids Cellulari Si noti che il seguente protocollo è per un trattamento farmacologico 4 giorni e comprende un rinnovamento con farmaco fresco dopo giorno 2. Può essere modificato per altri periodi di trattamento. <ol><li> Confermare visivamente formazione sferoide in piastre da 96 pozzetti dopo 24 ore. Se necessario, pozzi di immagine per la misurazione di dimensioni di sferoidi dalla media dei diametri più piccoli e più grandi di ogni sferoide. </li><li> Preparare la soluzione madre di un farmaco desiderato sciogliendolo in un solvente raccomandato dal costruttore, ad una concentrazione di solubilità predeterminata. Ad esempio, sciogliere cisplatino in acqua a 2 mg / ml. Nota: Proteggere la soluzione madre del farmaco dalla luce, se il farmaco è sensibile alla luce. </li><li> Utilizzando la tecnica di diluizione in serie, preparare concentrazioni di farmaco diluito con mezzo di coltura cellulare dalla soluzione madre preparata nella fase precedente. Ogni diluizione dovrebbe essere fatta due volte la concentrazione desiderata. DilRapporti ution variano a seconda della concentrazione della partenza e desiderata concentrazione di lavoro. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione medicinale preparata nella fase precedente in ciascun pozzetto. Questo può essere fatto tramite macchina o pipettando manuale. Nota: Ogni concentrazione farmaco sarà diluito in mezzo alla concentrazione voluta dal 50 microlitri acquosa fase PEG già in ciascun pozzetto. <ol><li> Utilizzare sferoidi da due colonne di una piastra a 96 pozzetti (n = 16) per ciascuna concentrazione. </li><li> In pozzetti di controllo, aggiungere solo 50 ml di terreno di coltura fresco alle attuali 50 microlitri della fase acquosa PEG. </li></ol></li><li> Incubare sferoidi con il farmaco per 48 ore a 37 ° C e 5% CO 2, al riparo dalla luce. </li><li> Dopo 48 h di incubazione, preparare diluizioni fresche del farmaco, alle concentrazioni desiderate e rinnovare farmaco aggiungendo 50 ml di soluzione medicinale fresca a ciascun pozzetto. Nota: I pozzi contengono già la concentrazione del farmaco desiderato dal primo farmaco tRATTAMENTO. Pertanto in questa fase di rinnovo, ciascuna concentrazione viene preparata alla concentrazione desiderata in quanto si verificherà alcuna diluizione. </li><li> Incubare sferoidi con il farmaco per un altro 48 ore a 37 ° C e 5% CO 2, al riparo dalla luce. </li></ol> 6. Analisi della Cellular Viabilità in Spheroids <ol><li> Dopo 48 ore di incubazione con rinnovata farmaco (cioè, il tempo totale del trattamento di sferoidi con un farmaco è 4 giorni), misurare il volume totale del mezzo in un pozzetto pipettando manuale. Nota: il volume tipico in un bene è ~ 140 microlitri (un piccolo calo si verifica a causa di evaporazione). </li><li> Calcolare il volume della cella di reagente vitalità (ad esempio, PrestoBlue) come concentrazione del 10% del volume totale bene. Aggiungere questo volume di reagente vitalità cellulare in ciascun pozzetto. Nota: Con un volume di supporto esistente di 140 microlitri in un pozzo, un volume di 15,6 microlitri è necessaria per ottenere una concentrazione del 10% del totale bene. Questo è calcolatodividendo il volume del supporto esistente 9 (140 ml / 9 = 15,6 ml). </li><li> Incubare la piastra con il reagente vitalità cellulare aggiunti a ciascun pozzetto per 6 ore a 37 ° C, al riparo dalla luce. </li><li> Porre la piastra in un lettore di micropiastra e leggere il segnale di fluorescenza a 560 nm e 590 nm di eccitazione e di emissione, rispettivamente. </li><li> Calcolare la vitalità percentuale di cellule in sferoidi normalizzando il segnale fluorescente da pozzi trattati a quella di pozzetti di controllo dopo la media dei valori delle stesse condizioni di trattamento. </li></ol>

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	<li>Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+in+drug+discovery.">Systems biology in drug discovery.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).</li><li>Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+for+anticancer+drug+discovery--a+novel+approach+based+on+engineered+mammalian+cell+lines.">In vitro assays for anticancer drug discovery--a novel approach based on engineered mammalian cell lines.</a> Anticancer Drugs. 16, 223-228 (2005).</li><li>Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. A., Gidrol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+microarrays+in+drug+discovery.">Cell microarrays in drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).</li><li>Gidrol, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D+cell+microarrays+in+pharmacology.">2D and 3D cell microarrays in pharmacology.</a> Current Opin. Pharmacol. 9, 664-668 (2009).</li><li>LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multicellular+tumor+spheroid+model+for+high-throughput+cancer+drug+discovery.">The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery.</a> Expert Opin. Drug Discov. 7, 819-830 (2012).</li><li>Ward, D. J., Martino, O. I., Simpson, S., Stevens, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decline+in+new+drug+launches:+myth+or+reality?+Retrospective+observational+study+using+30+years+of+data+from+the+UK.">Decline in new drug launches: myth or reality? Retrospective observational study using 30 years of data from the UK.</a> BMJ Open. 3, (2013).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li><li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+An+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).</li><li>Ghajar, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+engineering:+the+other+face+of+tissue+engineering.">Tumor engineering: the other face of tissue engineering.</a> Tissue Eng. A. 16, 2153-2156 (2010).</li><li>Kenny, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphologies+of+breast+cancer+cell+lines+in+three-dimensional+assays+correlate+with+their+profiles+of+gene+expression.">The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression.</a> Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).</li><li>Carlsson, J., Yuhas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-overlay+culture+of+cellular+spheroids.">Liquid-overlay culture of cellular spheroids.</a> Rec. Results Cancer Res. 95, 1-23 (1984).</li><li>Wartenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-induced+angiogenesis+studied+in+confrontation+cultures+of+multicellular+tumor+spheroids+and+embryoid+bodies+grown+from+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells.</a> FASEB J. 15, 995-1005 (2001).</li><li>Tekin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli-responsive+microwells+for+formation+and+retrieval+of+cell+aggregates.">Stimuli-responsive microwells for formation and retrieval of cell aggregates.</a> Lab chip. 10, 2411-2418 (2010).</li><li>Patra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+uniform-sized+cell+spheroids+formation,+culture,+harvesting+and+flow+cytometry+analysis.">A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis.</a> Biomicrofluidics. 7, 54114 (2013).</li><li>Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconfigurable+microfluidic+hanging+drop+network+for+multi-tissue+interaction+and+analysis.">Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis.</a> Nat. Commun. 5, 4250 (2014).</li><li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-ring+structures+stabilize+microdroplets+to+enable+long+term+spheroid+culture+in+384+hanging+drop+array+plates.">Micro-ring structures stabilize microdroplets to enable long term spheroid culture in 384 hanging drop array plates.</a> Biomed. Microdev. 14, 313-323 (2012).</li><li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy.">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> J. Control. Release. 164, 192-204 (2012).</li><li>Mueller-Klieser, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+cultures:+from+molecular+mechanisms+to+clinical+applications.">Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications.</a> Am. J. Physiol. 273, C1109-C1123 (1997).</li><li>Minchinton, A., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumors.">Drug penetration in solid tumors.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li><li>Jeong, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+tension-mediated,+concave-microwell+arrays+for+large-scale,+simultaneous+production+of+homogeneously+sized+embryoid+bodies.">Surface tension-mediated, concave-microwell arrays for large-scale, simultaneous production of homogeneously sized embryoid bodies.</a> Adv. Healthc. Mater. 2, 119-125 (2013).</li><li>Cavnar, S. P., Salomonsson, E., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+imaging,+and+analysis+plate+for+facile+handling+of+384+hanging+drop+3D+tissue+spheroids.">Transfer imaging, and analysis plate for facile handling of 384 hanging drop 3D tissue spheroids.</a> JALA. 19, 208-214 (2014).</li><li>Atefi, E., Lemmo, S., Fyffe, D., Luker, G. D., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput,+polymeric+aqueous+two-phase+printing+of+tumor+spheroids.">High throughput, polymeric aqueous two-phase printing of tumor spheroids.</a> Adv. Func. Mater. 24, 6509-6515 (2014).</li><li>Lemmo, S., Atefi, E., Luker, G. D., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+aqueous+biphasic+tumor+spheroid+microtechnology+for+anti-cancer+drug+testing+in+3D+culture.">Optimization of aqueous biphasic tumor spheroid microtechnology for anti-cancer drug testing in 3D culture.</a> Cell. Mol. Bioeng. 7, 344-354 (2014).</li><li>Albertsson, P. -. A., Tjerneld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+diagrams.">Phase diagrams.</a> Methods Enzym. 228, 3-13 (1994).</li><li>Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+co-culture+patterning+using+aqueous+two-phase+systems.">Cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems.</a> J. Vis. Exp. (73), (2013).</li><li>Frampton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+two-phase+system+patterning+of+detection+antibody+solutions+for+cross-reaction-free+multiplex+ELISA.">Aqueous two-phase system patterning of detection antibody solutions for cross-reaction-free multiplex ELISA.</a> Sci. Rep. 4, 4878 (2014).</li><li>Lai, D., Frampton, J. P., Tsuei, M., Kao, A., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+direct+visual+analysis+of+hydrolytic+enzyme+activity+using+aqueous+two-phase+system+droplet+phase+transitions.">Label-free direct visual analysis of hydrolytic enzyme activity using aqueous two-phase system droplet phase transitions.</a> Anal. Chem. 86, 4052-4057 (2014).</li><li>Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+spatio-temporally+controlled+cell+microprinting+with+polymeric+aqueous+biphasic+system.">Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system.</a> Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).</li><li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanolitre+liquid+patterning+in+aqueous+environments+for+spatially+defined+reagent+delivery+to+mammalian+cells.">Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells.</a> Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).</li><li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+aqueous+biphasic+system+rehydration+facilitates+high+throughput+cell+exclusion+patterning+for+cell+migration+studies.">Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies.</a> Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).</li><li>Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+aqueous+biphasic+systems+for+non-contact+cell+printing+on+cells:+engineering+heterocellular+embryonic+stem+cell+niches.">Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches.</a> Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).</li><li>Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprinted+feeder+cells+guide+embryonic+stem+cell+fate.">Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).</li><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).</li><li>Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mammary+fibroblasts+stimulate+invasion+of+breast+cancer+cells+in+a+three-dimensional+culture+and+increase+stroma+development+in+mouse+xenografts.">Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts.</a> BMC Cancer. 10, 444 (2010).</li><li>Ozdemir, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+carcinoma-associated+fibroblasts+and+fibrosis+induces+immunosuppression+and+accelerates+pancreas+cancer+with+reduced+survival.">Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival.</a> Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).</li><li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+formation+of+PC-3+prostate+cancer+co-culture+spheroids.">Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids.</a> Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).</li><li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer.">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).</li><li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer.">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).</li><li>Bissell, M. J., Radisky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+tumours+in+context.">Putting tumours in context.</a> Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Spheroids presentano un modello realistico per capire meglio la fisiologia del tumore e l&#39;efficacia dei farmaci e di fornire uno strumento utile per la scoperta di nuovi farmaci anti-cancro. Tali applicazioni potrebbero trarre grandi vantaggi da semplici tecniche di generazione e di manutenzione sferoidale che richiedono solo da laboratorio standard strumenti di gestione dei liquidi e vagliatura. L&#39;uso di un sistema a due fasi acquosa cellule tumorali di aggregati spontaneamente entro la fase goccia permette una...

Saggi cellulari forniscono uno strumento importante per lo sviluppo e la scoperta di nuovi farmaci anti-cancro. 1,2 Storicamente, colture monostrato di cellule tumorali sono stati impiegati per studiare l&#39;efficacia di composti candidati contro particolari tipi di cellule tumorali. La facilità di manutenzione delle colture monostrato in piastre di coltura standard, la compatibilità di piatti standard con strumenti robotici commerciali per l&#39;aggiunta dei reagenti, e con attrezzature di screening per l&#39;analisi a valle di risposte cellulari a composti chimici sono i principali vantaggi che rendono le culture 2D uno strumento interessante per test anti-droga. 3 Purtroppo, saggi cellulari monostrato spesso non riescono a prevedere l&#39;efficacia di composti in vivo, rendendo lo sviluppo di farmaci e la scoperta di un processo estremamente costoso. 4,5 Nonostante investimento significativo e lo sforzo da aziende farmaceutiche e unità accademiche, solo ~ 1% di anti-cancro sono stati approvati i farmaci negli studi clinicidalla FDA negli ultimi due decenni. 6 Disparità tra culture 2D e l&#39;ambiente 3D complesso di cellule tumorali in vivo è una grave lacuna di sistemi di coltura monostrato. 7 Pertanto, lo screening di composti candidati contro le cellule tumorali in un ambiente che assomiglia più da vicino l&#39;ambiente tumore 3D potrebbe accelerare lo sviluppo di nuovi farmaci chemioterapici. 8 Sferoidi di cellule di cancro presentano un rilevante modello di tumore 3D in vitro. 9,10 Spheroids sono gruppi compatti che si formano attraverso l&#39;assemblaggio spontanea o indotta delle cellule tumorali su superfici non aderenti o in sospensione utilizzando tecniche come pallone filatore, overlay liquido, micro- microfabbricazione . ben array, microfluidica, e gocce appesi 11-16 Spheroids imitano le caratteristiche principali di tumori solidi, tra cui la geometria e il trasporto limitata di ossigeno, sostanze nutritive, e composti di droga nella zona centrale; di conseguenza, hanno più da vicino rigenerano respon drogase di tumori solidi rispetto a colture monostrato. 17-19 Nonostante questo notevole vantaggio, sferoidi non sono comunemente usate per lo screening di composti chimici contro le cellule tumorali. Difficoltà di produrre sferoidi uniformi dimensioni in un ambiente standard elevato rendimento che è compatibile con la robotica disponibili in commercio e strumenti di screening / immagini impedisce l&#39;incorporazione della cultura sferoide in pipeline di sviluppo di farmaci. Anche se i materiali personalizzati e piastre hanno recentemente resi disponibili in commercio per rispondere a questa esigenza, le considerazioni sui costi scoraggiare il loro uso diffuso. Due importanti tecniche con la capacità di produrre sferoidi dimensioni consistenti in un throughput elevato utilizzare una nuova piattaforma goccia pendente e microfabbricati micro-pozzetti. 13,16,20 Tuttavia, entrambi gli approcci richiedono piatti e dispositivi che sono costosi da produrre e scomodo per gli utenti endpoint speciali in centri di ricerca di base e le industrie farmaceutiche, dove la più grande efforti per la scoperta di nuovi farmaci anti-cancro sono fatti. Nonostante alcuni miglioramenti nella stabilità di gocce di cellule contenenti un recente disegno di appendere piastre goccia, solo ogni foro della piastra è ancora usato durante la coltura per evitare la diffusione / fusione di gocce. 16 Ciò riduce significativamente il throughput sperimentale. Inoltre e rinnovamento della droga è difficile con manuale o robotizzato pipettaggio e sferoidi devono essere trasferiti in una piastra standard per l&#39;analisi biochimica, perché questa configurazione targa non è facilmente compatibile con gli apparecchi tradizionali, come lettori di piastre. 21 micro-pozzetti fabbricati usando litografia soft anche consentire dimensione controllata produzione sferoide. 13,20 Tuttavia, l&#39;incompatibilità di questa piattaforma con strumenti di pipettaggio standard di trattamento impedisce di sferoidi individuali con composti farmacologici / concentrazioni diverse, esponendo tutti sferoidi a una sola condizione di trattamento. Così, questo metodo non è appropriato per altalo screening composti rendimento che richiede il test simultaneo di più composti / concentrazioni. Per superare questi ostacoli, è stata sviluppata una nuova tecnica per la produzione ad alta velocità di costantemente dimensioni sferoidi di cellule di cancro in piastre a 96 pozzetti standard. 22,23 L&#39;approccio si basa su un sistema polimerico acquoso bifase (ATPS) con polietilene glicole ( PEG) e destrano (DEX) polimeri in fase di formatura. 24 ATPSs sono state recentemente utilizzato in una varietà di applicazioni biologiche romanzo cellulari per consentire micropatterning cellulare e localizzata consegna dei reagenti biologici alle cellule in mezzi acquosi altamente. 25-32 Per formare un sferoide, le cellule tumorali sono mescolati con la fase acquosa DEX e un calo sub-microlitri della sospensione risultante viene pipettato in una immersione soluzione fase PEG acquosa contenente bene. La goccia rimane immiscibile dalla fase di immersione e cellule limita a facilitare la formazione di uno sferoide. Diavolettoortantly, la fase di immersione molto acquosa fornisce sostanze nutritive alle cellule della sferoide e minimizza il problema ben noto dei media evaporazione comune ad alcuni altri test che causano i cambiamenti nei mezzi osmolalità e le fluttuazioni delle concentrazioni di droga. Questa tecnica permette la produzione sferoide e trattamento farmacologico solo utilizzando reagenti disponibili in commercio e strumenti di dispensazione in piastre da 96 pozzetti standard. È importante sottolineare che l&#39;analisi delle risposte cellulari di sferoidi viene eseguita nella stessa piastra utilizzando saggi biochimici standard e lettori di piastre. La facilità di lavorare con ATPS e adattabilità del approccio alla gestione dei liquidi robotizzato fa generazione ad alto rendimento sia mono-cultura e di co-coltura sferoidi una tecnica di laboratorio semplice. Questo nuovo approccio sarà un importante passo avanti verso l&#39;integrazione di sferoidi di cellule di cancro nei processi di sviluppo di farmaci e di scoperta con una migliore velocità di test e di costo-efficacia (un numero crescente di composti e Redu testaticonsumo di reagente ced) e l&#39;efficienza (riduzione hands-on tempo). Un protocollo dettagliato per la produzione robotizzata di sferoidi di cellule di cancro in piastre da 96 pozzetti utilizzando l&#39;approccio ATPS è descritto di seguito. Inoltre, i dettagli di trattamento farmacologico di sferoidi conseguenti e analisi a valle delle risposte cellulari utilizzando un test biochimico commerciale sono presentati.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagents and Consumables&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Polyethylene glycol, MW: 35,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94646</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, MW: 500,000</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0500 9007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Clacein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>15663-27-1</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue</td><td>Life Technologies</td><td>A-13261</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-108</td><td>Sigma Aldrich</td><td>542342</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Tips (10 &amp;micro;l)</td><td>Fluotics</td><td>C-P10V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Tips (70 &amp;micro;l)</td><td>Fluotics</td><td>C-P70V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>Round-bottom 96-well plates</td><td>Nunc</td><td>268200</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Liquid Handler</td><td>Agilent Technologies</td><td>SRT Bravo</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Biotek Instruments</td><td>Synergy H1M</td><td></td></tr></tbody></table>

robotic production of cancer cell spheroids with an aqueous two-phase system for drug testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

La workstation del gestore liquido robotizzato è mostrato in Figura 1. La testa di pipettaggio e tutte le stazioni utilizzati nella stampa robotico di sferoidi nella sezione 4.6 sono etichettati. L&#39;immagine mostra l&#39;uso di due diverse stazioni per scatole di tip (una serie di punte per la miscelazione e la seconda serie di aspirazione / erogazione di cellula miscela fase DEX sospensione acquosa). L&#39;intera configurazione è alloggiato all&#39;interno di un armadio standard di sicurezza biolo...

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Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Produzione robotica di Cancer Cell Spheroids con un sistema acquoso bifase per Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

robotic-production-cancer-cell-spheroids-with-an-aqueous-two-phase

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.0K Views.  The University of Akron. A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Video: Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is exposed to in vivo. Solid tumors grow not as a sheet attached to plastic, but instead as a collection of clonal cells in a three-dimensional (3D) space interacting with their neighbors, and with distinct spatial properties such as the disruption of normal cellular polarity. These interactions cause 3D-cultured cells to acquire morphological and cellular characteristics which are more relevant to in vivo tumors. Additionally, a tumor mass is in direct contact with other cell types such as stromal and immune cells, as well as the extracellular matrix from all other cell types. The matrix deposited is comprised of macromolecules such as collagen and fibronectin.
In an attempt to increase the translation of research findings in oncology from bench to bedside, many groups have started to investigate the use of 3D model systems in their drug development strategies. These systems are thought to be more physiologically relevant because they attempt to recapitulate the complex and heterogeneous environment of a tumor. These systems, however, can be quite complex, and, although amenable to growth in 96-well formats, and some now even in 384, they offer few choices for large-scale growth and screening. This observed gap has led to the development of the methods described here in detail to culture tumor spheroids in a high-throughput capacity in 1536-well plates. These methods represent a compromise to the highly complex matrix-based systems, which are difficult to screen, and conventional 2D assays. A variety of cancer cell lines harboring different genetic mutations are successfully screened, examining compound efficacy by using a curated library of compounds targeting the Mitogen-Activated Protein Kinase or MAPK pathway. The spheroid culture responses are then compared to the response of cells grown in 2D, and differential activities are reported. These methods provide a unique protocol for testing compound activity in a high-throughput 3D setting.

Across a wide variety of disease indications, more physiologically relevant models are being developed and implemented into drug discovery programs. The new model system described here demonstrates how three-dimensional tumor spheroids can be cultured and screened in a high-throughput 1536-well plate-based system to search for new oncology drugs.

Generazione di sferoidi tumore tridimensionale High-Throughput per lo Screening di stupefacenti

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor cells into neighboring tissue. Thus, invasion is a crucial step in metastasis, making the invasion process research and development of anti-metastatic drugs, highly significant. To address this demand, there is a need to develop 3D in vitro models which imitate the architecture of solid tumors and their microenvironment most closely to in vivo state on one hand, but at the same time be reproducible, robust and suitable for high yield and high content measurements. Currently, most invasion assays lean on sophisticated microfluidic technologies which are adequate for research but not for high volume drug screening. Other assays using plate-based devices with isolated individual spheroids in each well are material consuming and have low sample size per condition. The goal of the current protocol is to provide a simple and reproducible biomimetic 3D cell-based system for the analysis of invasion capacity in large populations of tumor spheroids. We developed a 3D model for invasion assay based on HMCA imaging plate for the research of tumor invasion and anti-metastatic drug discovery. This device enables the production of numerous uniform spheroids per well (high sample size per condition) surrounded by ECM components, while continuously and simultaneously observing and measuring the spheroids at single-element resolution for medium throughput screening of anti-metastatic drugs. This platform is presented here by the production of HeLa and MCF7 spheroids for exemplifying single cell and collective invasion. We compare the influence of the ECM component hyaluronic acid (HA) on the invasive capacity of collagen surrounding HeLa spheroids. Finally, we introduce Fisetin (invasion inhibitor) to HeLa spheroids and nitric oxide (NO) (invasion activator) to MCF7 spheroids. The results are analyzed by in-house software which enables semi-automatic, simple and fast analysis which facilitates multi-parameter examination.

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

A HMCA-based imaging plate is presented for invasion assay performance. This plate facilitates the formation of three-dimensional (3D) tumor spheroids and the measurement of cancer cell invasion into the extracellular matrix (ECM). The invasion assay quantification is achieved by semi-automatic analysis.

Analisi di invasione della cellula tumorale e anti-metastatica utilizzando Hydrogel Micro-camera matrice (HMCA) di Screening di stupefacenti-piastre di base

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric antigen receptor (CAR) redirected T cells obtained the most spectacular results, in particular with pediatric B-acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Classical validation methods of CAR T cells rely on the use of specificity and functionality assays of the CAR T cells against target cells in suspension and in xenograft models. Unfortunately, observations made in vitro are often decoupled from results obtained in vivo and a lot of effort and animals could be spared by adding another step: the use of 3D culture. The production of spheroids out of potential target cells that mimic the 3D structure of the tumor cells when they are engrafted into the animal model represents an ideal alternative. Here, we report an affordable, reliable and easy method to produce spheroids from a transduced colorectal cell line as a validation tool for adoptive cell therapy (exemplified here by CD19 CAR T cells). This method is coupled with an advanced live imaging system that can follow spheroid growth, effector cells cytotoxicity and tumor cell apoptosis.

This protocol is designed to assess immunotherapeutic redirected T-cell (CAR T-cell) cytotoxicity against 3D structured cancerous cells (spheroids) in real time.

Un'analisi di uccisione di sferoide dalle cellule di T di auto

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically relevant than conventional adherent-sheet cultures, they more accurately recapitulate the complexity and interactions present in real tumors. In order to harness this model to better assess tumor biology, or the efficacy of novel therapeutic agents, it is necessary to be able to generate spheroids reproducibly, in a controlled manner and in significant numbers.
The AggreWell system consists of a high-density array of pyramid-shaped microwells, into which a suspension of single cells is centrifuged. The numbers of cells clustering at the bottom of each microwell, and the number and ratio of distinct cell types involved depend only on the properties of the suspension introduced by the experimenter. Thus, we are able to generate tumor spheroids of arbitrary size and composition without needing to modify the underlying platform technology. The hundreds of microwells per square centimeter of culture surface area in turn ensure that extremely high production levels may be attained via a straightforward, nonlabor-intensive process. We therefore expect that this protocol will be broadly useful to researchers in the tumor spheroid field.

We introduce a protocol for the generation of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of uniform size- and composition-controlled tumor spheroids, using commercially available microwell plates.

Produzione di grandi numeri di-Size controllata Tumore Spheroids Uso micropiastra

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

Bioingegneria

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of anti-cancer therapeutics in a physiologically representative microenvironment. We outline the formation of patient derived cancer stem cell spheroids, as well as, the manipulation of these spheroids for thorough analysis following drug treatment. Specifically, we describe collection of spheroid morphology, proliferation, viability, drug toxicity, cell phenotype and cell localization data. This protocol focuses heavily on analysis techniques that are easily implemented using the 384-well hanging drop platform, making it ideal for high throughput drug screening. While we emphasize the importance of this model in ovarian cancer studies and cancer stem cell research, the 384-well platform is amenable to research of other cancer types and disease models, extending the utility of the platform to many fields. By improving the speed of personalized drug screening and the quality of screening results through easily implemented physiologically representative 3D cultures, this platform is predicted to aid in the development of new therapeutics and patient-specific treatment strategies, and thus have wide-reaching clinical impact.

This protocol describes generation of patient-derived spheroids, and downstream analysis including quantification of proliferation, cytotoxicity testing, flow cytometry, immunofluorescence staining and confocal imaging, in order to assess drug candidates&#8217; potential as anti-neoplastic therapeutics. This protocol supports precision medicine with identification of specific drugs for each patient and stage of disease.

Paziente fisiologico Derivato da spheroid 3D per lo screening farmacologico anti-neoplastico per colpire le cellule staminali tumorali

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

Stabilire sferoidi 3-dimensionali da campioni tumorali derivati dal paziente e valutare la loro sensibilità ai farmaci

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the evaluation of anticancer drugs. However, the conventional culture methods lack the ability to manipulate the tumor spheroids in a homogeneous manner at the three-dimensional level. To address this limitation, in this paper, we present a convenient and effective method of constructing average-sized tumor spheroids. Additionally, we describe a method of image-based analysis using artificial intelligence-based analysis software that can scan the whole plate and obtain data on three-dimensional spheroids. Several parameters were studied. By using a standard method of tumor spheroid construction and a high-throughput imaging and analysis system, the effectiveness and accuracy of drug tests performed on three-dimensional spheroids can be dramatically increased.

This article demonstrates a standardized method for constructing three-dimensional tumor spheroids. A strategy for spheroid observation and image-based deep-learning analysis using an automated imaging system is also described.

Generazione di sferoidi tumorali 3D per studi di valutazione dei farmaci

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell cultures. The clinostat mimics an environment where cells can assemble as highly reproducible spheroids with low shear forces and active nutrient diffusion. We demonstrate that both cancer and non-cancer hepatocytes (HepG2/C3A and THLE-3 cell lines) require 3 weeks of growth prior to achieving functionalities comparable to liver cells. This protocol highlights the convenience of utilizing incubators for 3D cells with cameras monitoring the cell growth, as snapshots can be taken to count and measure spheroids upon treatment. We describe the comparison of THLE-3 and HepG2/C3A cell lines, showing how non-cancerous cell lines can be grown as well as immortalized cancer cells. We demonstrate and illustrate how proteomics experiments can be conducted from a few spheroids, which can be collected without perturbing cell signaling, i.e., no trypsinization required. We show that proteomics analysis can be used to monitor the typical liver phenotype of respiratory chain metabolism and the production of proteins involved in metal detoxification and describe a semi-automated system to count and measure the spheroid's area. Altogether, the protocol presents a toolbox that comprises a phenotypic characterization via image capture and a proteomics pipeline to experiment on 3D cell culture models.

We present a protocol for growing high-reproducible spheroids and their phenotypic characterization using image capture and proteomics.

Analisi fenotipica semi-automatizzata di colture cellulari sferoidi 3D funzionali

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

Biochimica

Formazione di sferoidi multicellulari per analisi metaboliche e ipossia basate su FLIM

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

Autore in primo piano: Standardizzazione dei metodi di formazione degli sferoidi per l'analisi metabolica e dell'ossigenazione mediante microscopia per imaging a fluorescenza

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

Produzione e microscopia multiparametrica per imaging a fluorescenza su cellule vive (FLIM) di sferoidi multicellulari

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

Produzione robotica di Cancer Cell Spheroids con un sistema acquoso bifase per Drug Testing

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Generazione di sferoidi tumore tridimensionale High-Throughput per lo Screening di stupefacenti

Analisi di invasione della cellula tumorale e anti-metastatica utilizzando Hydrogel Micro-camera matrice (HMCA) di Screening di stupefacenti-piastre di base

Un'analisi di uccisione di sferoide dalle cellule di T di auto

Produzione di grandi numeri di-Size controllata Tumore Spheroids Uso micropiastra

Paziente fisiologico Derivato da spheroid 3D per lo screening farmacologico anti-neoplastico per colpire le cellule staminali tumorali

Stabilire sferoidi 3-dimensionali da campioni tumorali derivati dal paziente e valutare la loro sensibilità ai farmaci

Generazione di sferoidi tumorali 3D per studi di valutazione dei farmaci

Analisi fenotipica semi-automatizzata di colture cellulari sferoidi 3D funzionali

Produzione e microscopia multiparametrica per imaging a fluorescenza su cellule vive (FLIM) di sferoidi multicellulari

Produzione e microscopia multiparametrica per imaging a fluorescenza su cellule vive (FLIM) di sferoidi multicellulari