저자 그의 지원 및이 분석 실험의 초기 개발에 대 한 지침에 대 한 변환 과학 발전, 건강의 국가 학회에 대 한 국립 센터에서 페 러 마크를 인정 하 고 싶습니다. 또한, 우리는 그들의 과학적인 입력 및 토론으로 프로젝트 팀 구성원에 대 한 앨리슨 프리먼, Mariela Jaskelioff, 마이클 애 커, Jacob Haling, 및 Vesselina 쿡을 감사 하 고 싶습니다.

1. 1536-좋은 3D 종양 Spheroids의 배양
<ol><li>Dulbecco의 수정 이글스 매체 (DMEM/F12)의 500 mL를 다음과 같은 시 약을 추가 하 여 신선한 3D 종양 회전 타원 체 중간 줄기 (셀 매체 녹아웃 혈 청 교체 + 인슐린-처리가-셀레늄) 준비: 1 x 페니실린/스, 인간의 10 ng/mL 기본적인 섬유 아 세포 성장 요소 (bFGF), 인간 표 피 성장 인자 (EGF), 0.4% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) (분수 V), 인슐린-처리가-셀레늄, 및 1% 녹아웃 (KO) 혈 청 교체 (할 하지 동결-해 동) x 1의 20 ng/mL.</li>
	<li>필터-소독 0.4 µ m 병 상단 필터 시스템을 통해 보충 교재를 가진 전체 매체.</li>
	<li>그들을 세척 하 여 전통적인 세포 배양 플라스 크에서 권장된 일상적인 문화 조건에 따라 성장 암 세포 라인 분리 3 x 1 x 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 0.25 %trypsin (1 mL의 적절 한 금액을 추가 5 cm2) 당 5 분 셀 위에 얇은 레이어를 만듭니다. 혈 청을 포함 하는 매체의 금액 x 5 트립 신을 중화 하 고는 셀 이동 합니다. 예를 들어 5 ml의 트립 신 매체의 25 mL를 사용 합니다.</li>
	<li>씨앗 잘 회전 타원 체 매체의 8 µ L 당 500 세포의 총 1536-잘 조직 문화 취급 판으로 위해 104 셀/mL x 62.5에 셀 용액의 농도 조정 합니다.</li>
	<li>생물 안전 캐비닛, 연동 펌프-기반 시스템으로 소독, 작은 스테인레스 스틸 밀고 카세트를 사용 하 여 셀을 시드하십시오. 다른 셀 라인 사이 PBS와 70% x 1 카세트의 튜브를 플러시 에탄올 10 s.</li>
	<li>또는, 종자 소독, 작은 스테인레스 스틸 밀고 카세트와 연동 펌프 또는 셀 줄 필요 번호판의 번호에 따라 연결 된 주사기 펌프를 사용 하 여 HEPA 필터 룸 내에 있는 액체 처리기를 사용 하 여 셀.</li>
	<li>수동으로 사용 하 여 통기성 접착 판 도장 중 또는 접시 마감재를 사용 하 여 접시를 봉인.</li>
	<li>10 rpm와 5% 이산화탄소 (CO2)와 95% 상대 습도 37 ° C에서 설정 회전 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 3 d 형태를 spheroids 수 있습니다.</li>
</ol>2. 1536-잘 2D 암 라인의 경작
참고: 1536-잘 2D 암 라인 3D 판 화합물의 추가 하기 전에 24 시간 배양 한다.
<ol><li>선택한 라인에 대 한 적절 한 성장 매체의 500 mL를 다음과 같은 시 약을 추가 하 여 2D 암 세포 매체를 준비: 페니실린/스와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) x 1.</li>
	<li>필터-소독 0.4 µ m 병 상단 필터 시스템을 통해 보충 교재를 가진 전체 매체.</li>
	<li>분리 그들을 세척 하 여 전통적인 세포 배양 플라스 크에서 권장된 일상적인 문화 조건에 따라 성장 암 세포 선, PBS와 0.25 %trypsin (5 c m2당 1 mL)의 적절 한 금액을 추가 하는 5 분 x 1 3 x 셀 위에 얇은 레이어를 만듭니다. 혈 청을 포함 하는 매체의 금액 x 5 트립 신을 중화 하 고는 셀 이동 합니다. 예를 들어 5 ml의 트립 신 매체의 25 mL를 사용 합니다.</li>
	<li>씨앗 잘 완전 한 매체의 8 µ L에서 당 500 세포의 총 1536-잘 조직 문화 취급 판으로 위해 104 셀/mL x 62.5에 셀 용액의 농도 조정 합니다.</li>
	<li>생물 안전 캐비닛, 연동 펌프-기반 시스템으로 소독, 작은 스테인레스 스틸 밀고 카세트를 사용 하 여 셀을 시드하십시오. 다른 셀 라인 사이 살 균 PBS와 70% x 1 카세트의 튜브를 플러시 에탄올 10 s.</li>
	<li>또는, 종자 소독, 작은 스테인레스 스틸 밀고 카세트와 연동 펌프 또는 셀 당 격판덮개의 볼륨에 따라 연결 된 주사기 펌프를 사용 하 여 HEPA 필터 로봇 룸 내에 있는 액체 처리기를 사용 하 여 셀 선 필요입니다.</li>
	<li>수동으로 사용 하 여 통기성 접착 판 도장 중 또는 접시 마감재를 사용 하 여 접시를 봉인.</li>
	<li>10 rpm 및 복합 추가, 5% CO2 와 95% 상대 습도와 이전 24 시간 동안 37 ° C 설정 회전 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
</ol>3. 복합 추가
<ol><li>10 m m 최고 농도와 액체 처리 로봇에 100% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 MAPK 억제제의 8 포인트, 3-fold 직렬 희석을 준비 합니다. 프로테아좀 억제제 Bortezomib 분석 결과의 동적 범위를 결정 하기 위해 죽이 완전 한 셀에 대 한 긍정적인 컨트롤로 사용 됩니다.</li>
	<li>빠른 스핀 모든 시험 접시와 든 수집을 100 x g에서 복합 플레이트. 각 접시에서 접착 씰을 제거 하 고 8 총을 추가 하는 음향 분배기 설정에 접시를 놓고 각 화합물/희석 대표 하는 잘 당 0.1 %DMSO 최종 농도 10 µ M의 최고 복합 복용량의 nL.</li>
	<li>화합물의 추가 완료 되 면, 주문 품, 스테인레스 스틸 셀 문화 뚜껑 접시에 증발을 방지 하 고 5d, 5% CO2 와 95% 상대 습도 대 한 37 ° C에서 회전 인큐베이터에 접시를 장소를 장소.</li>
</ol>4. 검출 시 약 추가 및 원시 데이터의 취득
<ol><li>전 따뜻한 실내 온도에서 세포 증식 또는 37 ° C 물 욕조에 아데닌 3 인산 염 (ATP)에서 변화 하 고, 따라서, 변화를 감지 하는 소를 포함 하는 셀 세포 시 약의 적절 한 볼륨. 검출 시 약의 3 µ L의 총 각 잘 연동 펌프를 사용 하 여를 추가 하 고 적어도 15 분 동안 실내 온도에 격판덮개를 품 어.</li>
	<li>플레이트 루미 노에 발광을 캡처하십시오.</li>
</ol>5입니다. 데이터 처리
<ol><li>악기에서 원시 데이터를 추출 하 고 중립 제어로 혼자 DMSO를 포함 하는 모든 우물의 평균 시험 화합물을 포함 하는 모든 필드를 정상화. 이 값에서 각 화합물의 백분율 성장 저해를 계산 합니다. 이 Microsoft Excel에서 수식 함수를 사용 하 여 완료 되 면 어디 f (x) = {(샘플 값은 상대적인 빛 단위 (RLUs) / (평균 DMSO 값 RLUs) * 100)}.</li>
	<li>그래프 프로그램을 사용 하 여 복합 농도 대 한 단계로 5.1에서 정규화 된 데이터의 값을 그래프에 의해 복용량 응답 곡선 및 금지 IC50s를 생성 합니다. 참고: 우리는 헬 리오스, 내부 NIBR 소프트웨어 도구를 사용 하 여 데이터를 분석. 이 기능을 완료 하려면 우리는 비패라메트릭 곡선 분석 도구를 선택.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lee, M., Vasioukhin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+polarity+and+cancer--cell+and+tissue+polarity+as+a+non-canonical+tumor+suppressor.">Cell polarity and cancer--cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor.</a> Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).</li><li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research:+Focus+on+tumor+spheroid+model.">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 163, 94-108 (2016).</li><li>Weigelt, B., Ghajar, C. 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Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice.</a> PLoS One. 5 (5), e10786 (2010).</li><li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth.">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li><li>Bhargava, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Registered+report:+RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth.">Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Elife. 5, e09976 (2016).</li><li>Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+CpG+promoter+methylation+in+invasive+prostate+cancer+cells.">Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells.</a> Molecular Cancer. 9, 267 (2010).</li><li>Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+gene+regulation+in+stem+cells+and+correlation+to+cancer.">Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer.</a> Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).</li><li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+DNA+repair+genes+in+invasive+human+pancreatic+cancer+cells.">Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells.</a> Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).</li><li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1536-well+quantitative+high-throughput+screen+to+identify+compounds+targeting+cancer+stem+cells.">A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).</li><li>Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+culture+of+murine+primordial+germ+cells+and+embryonic+germ+cells.">Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells.</a> Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+SOX9+by+the+NF-kappaB+signaling+pathway+in+pancreatic+cancer+stem+cells.">Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells.</a> Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).</li><li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1536-well+quantitative+high-throughput+screen+to+identify+compounds+targeting+cancer+stem+cells.">A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).</li><li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+combinatorial+screening+identifies+drugs+that+cooperate+with+ibrutinib+to+kill+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells.">High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).</li><li>Herter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three-dimensional+heterotypic+spheroid+model+for+the+assessment+of+the+activity+of+cancer+immunotherapy+agents.">A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).</li></ol>

저자는 노바 티 스의 직원 그리고 일부 직원 들도 주주.

여기에 제시 된 방법을 대규모 복합 검 진을 위해 1536-잘 접시에 종양 spheroids를 생산 하는 방법에 대 한 상세한 프로토콜을 보여 줍니다. 이러한 방법은 종양 spheroids 유전 종속성 및 복합 감도13, 에 대 한 질문 6-잘, 96 잘 접시에 낮은 처리량 분석 실험에서 성장 했다 국립 암 연구소에 직장에서 처음 적응 했다 14 , 15.이 프로토콜...

지난 10 년간에서 점점 더 많은 연구는 성장 하는 세포 차원에서 플라스틱에 의해 완전히 지 하지 개념 이해 3D 셀 문화 모델의 사용을 구현 했습니다. 이러한 개념의 예 생존 및 세포 운명 조절에 세포 외 매트릭스의 역할 뿐 아니라 정상 상피 세포 극성1 셀의 꼭대기와 기저 계층의 공간적 방향이 손실에 교대를 포함 합니다. 종양학 연구, 특히, 암 세포와 2D 및 3D 셀 문화 시스템3,4간의 차이의 기본적인 생물학을 이해 하 3D 모델을 사용 했다. 더 정교한 셀 문화 기술과 멀티 잘 포맷을 더 그들의 적응의 개발은 3D 설정에서 새로운 약물에 대 한 검색을 활성화 하 고 있다. 셀과 달리 성장 조건 하에서 2D, 3D 모델 종양 범위 복잡 한 계층화 된 셀룰러 시스템5 에서 다양 한 크기의 단일 셀 유형 분야에서에서의 복잡 한 cell 타입 분야6,7, 8. 소설 화합물 또는 potently 이러한 3D 모델 시스템에 세포 죽음을 유도 하는 생물 의약품의 발견은, 따라서, 약물 개발 캠페인에 높은 관심의. 이 분석 실험의 끝점 종종 세포 증식에 변화를 평가 하기 위해 2D 문화에서 그와 동일 하지만 더 순수 관련 설정에서 실시 하는 때 그들은 대상 유전자 나 통로가 되는 종속성의 진정한 수준을 드러낼 수 있습니다. 심문.
대부분 중 96 또는 384-잘 결정 접시를 사용 하 고 높은 처리량 검열 (HTS) 형식에서 자주 사용 한다에 쉽게 적응 하지 않습니다 하지만 모델 시스템의 다양 한 3D 문화 시스템에 약물 응답 공부 하 개발 되어 위의 도입, 약물 발견 심사 캠페인입니다. 이러한 시스템 물방울 기술, 회전 타원 체 문화, 공중 부양, 그리고 자연 또는 합성 젤 콜라겐, Matrigel, 또는 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)2 등을 통합 하는 문화를 유도 하기 위해 마그네틱 입자와 셀 pulsating 매달려의 사용을 포함 . 여기, 우리는 1536-잘 접시 형태로 설립된 암 세포 선에서 3D 회전 타원 체 문화 생산 이전 개발 기술의 상세한 방법 제시. 이 프로토콜 높은 정의 매체 사용 일반적으로 부착 셀 라인9의 부착을 방지 합니다. 이 시스템에 제한 사항 (즉, 그것은 완전히 암의 복잡 한 모델 시스템 정리 수 없습니다), 하지만 그럼에도 불구 하 고,이 분석 실험 작은 분자의 대규모 컬렉션 및 약 응답의 십자로 비교의 높은 처리량 검열 다양 한 세포 및 화합물에 대 한 2D 및 3D 문화 사이
셀 라인 MAPK 신호 통로, 통로 높은 암, dysregulated에 관련 된 유전자의 모든 항구 돌연변이 들이 문서의 방법 보여 선택 하 고 있는 많은 치료제에 대 한 사용할 수 있습니다. 라인의 많은 키 얼 스 틴 쥐 육 종 바이러스 라고도 KRA, 신경 RAS 또는 NRAS, 하 비 쥐 육 종 바이러스 oncogene 또는 HRA, 및 관련된 kinases 빠르게 가속 Fibrosarcomas, 일컬어 종양 돌연변이 활성화 Raf는. 최근 문학이이 통로의 다른 노드의 억제제 셀 라인 3D 조건9,10에서 성장 될 때의 하위 집합에 고유 하 게 더 효능을 제안 합니다. 때 활성 RAS와 암 세포 차원에서 교양 있었다, 그들은 증가 감도 MAPK 억제제를 시연 하 고 또한,이 접근 경로 확인할 수 및 전통적인 2D에서 놓친 억제제를 대상으로 한 연구 발견 설정합니다. 이 연구의 목표는 이러한 셀 라인 문화 하는 데 사용 하는 방법을 제시 하 고 또한, 차등을 보여 주기 위해 3D를 사용 하는 경우에 관찰 될 수 있는 이러한 억제제에 대 한 응답 문화 시스템 세포.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td>Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors.</td></tr><tr><td>DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td>Purchased as a prepared solution.</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)</td><td>Lonza</td><td>12-115Q</td><td>Purchased as a prepared solution.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td>Purchased as a prepared solution.</td></tr><tr><td>1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Hyclone</td><td>SH30042.01</td><td>Purchased as a prepared solution.</td></tr><tr><td>1x Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>Purchased as a prepared solution.</td></tr><tr><td>10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF)</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>Resuspend in sterile water.</td></tr><tr><td>20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>Resuspend in sterile water.</td></tr><tr><td>0.4% Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td>Resuspend in sterile PBS and filter.</td></tr><tr><td>1x Insulin Transferrin Selenium (ITS)</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>1% KnockOut (KO) Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>Add fresh right before use.</td></tr><tr><td>100% Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7573</td><td>Purchased as a prepared solution.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small Combi Cassette</td><td>ThermoFisher</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Small Multiflow Cassette</td><td>BioTek</td><td>294085</td><td></td></tr><tr><td>1536-well sterile TC plates (white)</td><td>Corning</td><td>3727</td><td></td></tr><tr><td>1536-well sterile TC plates (black)</td><td>Corning</td><td>3893</td><td></td></tr><tr><td>Scivax Plates</td><td>MBL International</td><td>NCP-LH384-10</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhesives seals</td><td>ThermoFisher</td><td>AB0718</td><td></td></tr><tr><td>Spinning Incubator</td><td>LiCONiC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Lids</td><td>The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATS Acoustic Dispensor</td><td>EDS Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Echo Acoustic Dispensor</td><td>Labcyte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Envision-Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Pump- Multidrop Combi</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Handler-Multiflow FX</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation of high-throughput three-dimensional tumor spheroids for drug screening

암 세포는 정기적으로 플라스틱 표면에 2 차원 (2D)에서 경작 되었습니다. 그러나이 기술은,, 부족 진정한 환경 종양 질량에 비보에 노출 됩니다. 단단한 종양 시트 플라스틱, 첨부로 성장 하지만 3 차원 (3d) 클론 셀의 컬렉션으로 대신 그들의 이웃, 그리고 정상적인 세포 극성의 파괴와 같은 독특한 공간 속성의 상호 작용 공간. 이러한 상호 작용 종양 vivo에서 더 관련 된 형태학 및 세포 특성을 얻으려고 3 차원 배양 세포를 발생할. 또한, 종양 질량은 다른 세포 유형 stromal 및 면역 세포 뿐만 아니라 다른 모든 세포 유형에 서 세포 외 매트릭스와 직접 접촉에. 입금 매트릭스 고분자 콜라겐과 fibronectin 같은 구성 되어 있습니다.
머리 맡에 벤치에서 종양학에서 연구 결과의 번역을 증가 하는 시도에 많은 그룹 그들의 약 개발 전략에서 3D 모델 시스템의 사용을 조사 하기 시작 했습니다. 이러한 시스템은 종양의 복잡 하 고 이기종 환경 정리 하려고 하기 때문에 더 많은 생리 적으로 관련 된 것으로 생각 된다. 그러나 이러한 시스템은,, 매우 복잡할 수, 그리고, 비록 의무가 96 잘 형식과 384에도 지금 일부에서 성장, 그들은 대규모 성장 및 심사에 대 한 몇 가지 옵션 제공. 이 관찰 간격 여기 문화 종양 spheroids 1536-잘 접시의 높은 처리량 용량에 세부 사항에서 설명 하는 방법의 개발을 주도하 고 있다. 이 메서드는 매우 복잡 한 매트릭스 기반 시스템, 화면, 그리고 기존의 2D 분석 하기 어려운 타협을 나타냅니다. 은닉 다른 유전자 돌연변이 암 세포 라인의 다양 한은 성공적으로 상영 Mitogen-Activated 단백질 키 니 아 제 또는 MAPK 통로 대상으로 하는 화합물의 큐레이터 라이브러리를 사용 하 여 복합 효능을 검사. 회전 타원 체 문화 응답 그런 다음 2d, 성장 하는 세포의 응답에 비교 하 고 차동 활동 보고 됩니다. 이 메서드는 복합 활동 높은 처리량 3D 설정에서 테스트를 위한 고유 프로토콜을 제공 합니다.

여기에 설명 된 방법을 사용 하 여 2D 문화 조건 하에서 잘 성장 하는 것으로 알려져 라인 테스트 설립된 암 세포의 다양 한. 대표 이미지 MAPK 돌연변이 암의 다양 한 세포 라인 (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-멜-30:NRAS, 및 학회-62:HRAS) 그림 1에서 볼 수 있습니다. 이러한 이미지는 셀 라인을가지고 있지만 다양 한 형태학, 각각 형성 3D 구조 분석 결과 1536-잘 접?...

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Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

다양 한 질병의 표시 더 순수 관련 모델 개발 및 구현에 약물 발견 프로그램 되. 여기에 설명 된 새로운 모델 시스템 spheroids를 경작 하 고 종양학 신약에 대 한 검색 하는 높은 처리량 1536-잘 접시 기반 시스템에서 상영 될 수 방법을 3 차원 종양을 보여 줍니다.

마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.5K 조회수.  Novartis Institutes for Biomedical Research. 다양 한 질병의 표시 더 순수 관련 모델 개발 및 구현에 약물 발견 프로그램 되. 여기에 설명 된 새로운 모델 시스템 spheroids를 경작 하 고 종양학 신약에 대 한 검색 하는 높은 처리량 1536-잘 접시 기반 시스템에서 상영 될 수 방법을 3 차원 종양을 보여 줍니다.

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Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, high-throughput imaging modalities utilizing bright field or fluorescence detection, are unable to resolve the overall 3D structure of the tumor spheroid due to limited light penetration, diffusion of fluorescent dyes and depth-resolvability. Recently, our lab demonstrated the use of optical coherence tomography (OCT), a label-free and non-destructive 3D imaging modality, to perform longitudinal characterization of multicellular tumor spheroids in a 96-well plate. OCT was capable of obtaining 3D morphological and physiological information of tumor spheroids growing up to about 600 &#181;m in height. In this article, we demonstrate a high-throughput OCT (HT-OCT) imaging system that scans the whole multi-well plate and obtains 3D OCT data of tumor spheroids automatically. We describe the details of the HT-OCT system and construction guidelines in the protocol. From the 3D OCT data, one can visualize the overall structure of the spheroid with 3D rendered and orthogonal slices, characterize the longitudinal growth curve of the tumor spheroid based on the morphological information of size and volume, and monitor the growth of the dead-cell regions in the tumor spheroid based on optical intrinsic attenuation contrast. We show that HT-OCT can be used as a high-throughput imaging modality for drug screening as well as characterizing biofabricated samples.

Optical coherence tomography (OCT), a three-dimensional imaging technology, was used to monitor and characterize the growth kinetics of multicellular tumor spheroids. Precise volumetric quantification of tumor spheroids using a voxel counting approach, and label-free dead tissue detection in the spheroids based on intrinsic optical attenuation contrast, were demonstrated.

경도 형태 및 생리 적인 광학 일관성 단층 촬영을 사용 하 여 3 차원 종양 Spheroids의 모니터링

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

연구

암 연구학

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically relevant than conventional adherent-sheet cultures, they more accurately recapitulate the complexity and interactions present in real tumors. In order to harness this model to better assess tumor biology, or the efficacy of novel therapeutic agents, it is necessary to be able to generate spheroids reproducibly, in a controlled manner and in significant numbers.
The AggreWell system consists of a high-density array of pyramid-shaped microwells, into which a suspension of single cells is centrifuged. The numbers of cells clustering at the bottom of each microwell, and the number and ratio of distinct cell types involved depend only on the properties of the suspension introduced by the experimenter. Thus, we are able to generate tumor spheroids of arbitrary size and composition without needing to modify the underlying platform technology. The hundreds of microwells per square centimeter of culture surface area in turn ensure that extremely high production levels may be attained via a straightforward, nonlabor-intensive process. We therefore expect that this protocol will be broadly useful to researchers in the tumor spheroid field.

We introduce a protocol for the generation of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of uniform size- and composition-controlled tumor spheroids, using commercially available microwell plates.

마이크로 웰 플레이트를 사용하여 크기 조절 종양 상체 많은 수의 생산

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

생체공학

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of anti-cancer therapeutics in a physiologically representative microenvironment. We outline the formation of patient derived cancer stem cell spheroids, as well as, the manipulation of these spheroids for thorough analysis following drug treatment. Specifically, we describe collection of spheroid morphology, proliferation, viability, drug toxicity, cell phenotype and cell localization data. This protocol focuses heavily on analysis techniques that are easily implemented using the 384-well hanging drop platform, making it ideal for high throughput drug screening. While we emphasize the importance of this model in ovarian cancer studies and cancer stem cell research, the 384-well platform is amenable to research of other cancer types and disease models, extending the utility of the platform to many fields. By improving the speed of personalized drug screening and the quality of screening results through easily implemented physiologically representative 3D cultures, this platform is predicted to aid in the development of new therapeutics and patient-specific treatment strategies, and thus have wide-reaching clinical impact.

This protocol describes generation of patient-derived spheroids, and downstream analysis including quantification of proliferation, cytotoxicity testing, flow cytometry, immunofluorescence staining and confocal imaging, in order to assess drug candidates&#8217; potential as anti-neoplastic therapeutics. This protocol supports precision medicine with identification of specific drugs for each patient and stage of disease.

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

약물 테스트를위한 수성 2 단계 시스템으로 암 세포 타원체의 로봇 생산

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver cancer, rationalize its rank as the second most common cause of cancer-related death. Preclinical models need to be adapted to recapitulate the human conditions to select the best therapeutic candidates for clinical development and aid the delivery of personalized medicine. Three-dimensional (3D) cellular spheroid models show promise as an emerging in vitro alternative to two-dimensional (2D) monolayer cultures. Here, we describe a 3D tumor spheroid&#160;model which exploits the ability of individual cells to aggregate when maintained in hanging droplets, and is more representative of an in vivo environment than standard monolayers. Furthermore, 3D spheroids can be produced by combining homotypic or heterotypic cells, more reflective of the cellular heterogeneity in vivo, potentially enabling the study of environmental interactions that can influence progression and treatment responses. The current research optimized the cell density to form 3D homotypic and heterotypic tumor spheroids by immobilizing cell suspensions on the lids of standard 10 cm3 Petri dishes. Longitudinal analysis was performed to generate growth curves for homotypic versus heterotypic tumor/fibroblasts spheroids. Finally, the proliferative impact of fibroblasts (COS7 cells) and liver myofibroblasts (LX2) on homotypic tumor (Hep3B) spheroids was investigated. A seeding density of 3,000 cells (in 20 &#181;L media) successfully yielded Huh7/COS7 heterotypic spheroids, which displayed a steady increase in size up to culture day 8, followed by growth retardation. This finding was corroborated using Hep3B homotypic spheroids cultured in LX2 (human hepatic stellate cell line) conditioned medium (CM). LX2 CM triggered the proliferation of Hep3B spheroids compared to control tumor spheroids. In conclusion, this protocol has shown that 3D tumor spheroids can be used as a simple, economical, and prescreen in vitro tool to study tumor-stromal interactions more comprehensively.

Comprehensive in vitro models that faithfully recapitulate the relevant human disease are lacking. The current study presents three-dimensional (3D) tumor spheroid creation and culture, a reliable in vitro tool to study the tumor-stromal interaction in human hepatocellular carcinoma.

간세포 암에서 종양-기질 상호 작용을 조사하는 3차원 스페로이드 모델

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the evaluation of anticancer drugs. However, the conventional culture methods lack the ability to manipulate the tumor spheroids in a homogeneous manner at the three-dimensional level. To address this limitation, in this paper, we present a convenient and effective method of constructing average-sized tumor spheroids. Additionally, we describe a method of image-based analysis using artificial intelligence-based analysis software that can scan the whole plate and obtain data on three-dimensional spheroids. Several parameters were studied. By using a standard method of tumor spheroid construction and a high-throughput imaging and analysis system, the effectiveness and accuracy of drug tests performed on three-dimensional spheroids can be dramatically increased.

This article demonstrates a standardized method for constructing three-dimensional tumor spheroids. A strategy for spheroid observation and image-based deep-learning analysis using an automated imaging system is also described.

약물 평가 연구를 위한 3D 종양 스페로이드 생성

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

Quantifying Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity in a Tumor Spheroid Model: Application for Drug Discovery

Monoclonal antibody-based immunotherapy targeting tumor antigens is now a mainstay of cancer treatment. One of the clinically relevant mechanisms of action of the antibodies is antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), where the antibody binds to the cancer cells and engages the cellular component of the immune system, e.g., natural killer (NK) cells, to kill the tumor cells. The effectiveness of these therapies could be improved by identifying adjuvant compounds that increase the sensitivity of the cancer cells or the potency of the immune cells. In addition, undiscovered drug interactions in cancer patients co-medicated for previous conditions or cancer-associated symptoms may determine the success of the antibody therapy; therefore, such unwanted drug interactions need to be eliminated. With these goals in mind, we created a cancer ADCC model and describe here a simple protocol to find ADCC-modulating drugs. Since 3D models such as cancer cell spheroids are superior to 2D cultures in predicting in vivo responses of tumors to anticancer therapies, spheroid co-cultures of EGFP-expressing HER2+ JIMT-1 breast cancer cells and the NK92.CD16 cell lines were set up and induced with Trastuzumab, a monoclonal antibody clinically approved against HER2-positive breast cancer. JIMT-1 spheroids were allowed to form in cell-repellent U-bottom 96-well plates. On day 3, NK cells and Trastuzumab were added. The spheroids were then stained with Annexin V-Alexa 647 to measure apoptotic cell death, which was quantitated in the peripheral zone of the spheroids with an automated microscope. The applicability of our assay to identify ADCC-modulating molecules is demonstrated by showing that Sunitinib, a receptor tyrosine kinase inhibitor approved by the FDA against metastatic cancer, almost completely abolishes ADCC. The generation of the spheroids and image acquisition and analysis pipelines are compatible with high-throughput screening for ADCC-modulating compounds in cancer cell spheroids.

Here, we present a method to identify compounds that modulate the ADCC mechanism, an important cancer cell-killing mechanism of antitumor antibodies. The cytotoxic effect of NK cells is measured in breast cancer cell spheroids in the presence of Trastuzumab. Image analysis identifies live and dead killer and target cells in spheroids.

종양 스페로이드 모델에서 항체 의존성 세포 독성 정량화: 약물 발견을 위한 응용

Monoclonal antibody-based immunotherapy targeting tumor antigens is now a mainstay of cancer treatment. One of the clinically relevant mechanisms of ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

의학

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Kinomic 프로파일 의약품 응답 테스트를위한 3D 인간의를 Biogel 문화 시스템을 사용 Microtumors 및 환자 유래 아교 모세포종 세포의 생성

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...