이 작품은 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구위원회 (NSERC) 디스커버리 부여 # 40352에 의해 지원되었다, 캠퍼스 MHM에 혁신 프로그램 의자, 앨버타 알츠하이머 연구 프로그램에 대한 앨버타, 및 NSERC는 MK에 BIF 박사 교제와 AIHS 대학원 교제 CREATE. 우리는이 프로토콜의 개발 및 수술 훈련 푸 민 왕 감사하고, 베루 미르자 아그와 디 샤오 사육.

<html> 다음 프로토콜은 레스 브리지 동물 관리위원회의 대학 (ACC) 가이드 라인을 다음과 동물 관리에 캐나다위원회 (CCAC)의 기준에 따라 수행한다. 1. 준비 <ol><li> 장기간의 연구 기간 동안, 열려있는 모든 수술 소모품을 압력솥하고 불임 수술 동안 유지되어 있는지 확인합니다. 여러 수술이 필요한 경우 수술 사이의 오토 클레이브. </li><li> 한편 뇌 버퍼 많은 (적어도 50 ㎖)가 확인. 용액은 134 mM 염화나트륨, 5.4 mM의 칼륨, 1 mM의 염화 마그네슘 육수화물, 1.8 mM의 염화 칼슘 이수화 물, 및 5 mM의 HEPES 나트륨, 5 M 염화수소 7.4 평형 pH가 이루어진다. </li><li> 유도 챔버에 놓고 마우스를 마취 3 - 4 % 이소 플루 란. 수술하는 동안 유지 보수를 위해 2.0 %의 이소 플루 란 - 1.0 따릅니다. 영상 중 0.8 % - 또한 낮은 0.4로 감소S = &quot;외부 참조&quot;&gt; 5, 13, 14, 15, 제공된 적절한 마취를 유지한다. 마취의 이러한 낮은 수준은 고통스러운 자극에 areflexic 유지하기 위해 마우스 (약 5 분마다)의 경계 빈번한 모니터링이 필요합니다. 참고 : 탈수 마우스의 부피 비율로 인해 높은 표면에 문제가되고 이소 플루 란의 장시간 사용에 의해 악화 할 수 있습니다. <ol><li> 2 시간 - 식염수 피하 주사, 10 g의 체중 당 0.1 ㎖, 1 매 사용한다. 2 시간 - 충분히 수화 때 마우스마다 한 번씩 1 소변됩니다. </li></ol></li><li> 밀접하게 수술과 영상 전반에 걸쳐 일관된 마취을 보장하기 위해 마우스를 모니터링 할 수 있습니다. 무인 마우스를두고는 의식을 회복하지 않도록주의를하지 마십시오. </li><li> 37 ℃로 설정된 항온 조절 가열 패드에 머리 홀더 설정 장소로 ​​마취 된 마우스의 이동. 상단 TEET 보안치아 홀더 시간. </li><li> 약 30 °가 머리의 오른쪽 측면을 노출 왼쪽 방향으로 마우스의 머리를 돌려 귀 바 (그림 1A)의 뭉툭한 끝으로 마우스의 머리를 고정합니다. </li><li> 각막 건조를 방지하기 위해 안과 연고를 적용합니다. </li><li> 뇌부종을 줄이기 위해, (4 밀리그램 / kg)을 근육 주사 덱사메타손. </li><li> 4 % 클로르헥시딘 (3 회) 및 70 % 에탄올 (3 회)에 담근 면봉으로 외과 영역에 걸쳐 피부를 닦아주십시오. 한 번만 각 면봉을 사용합니다. </li><li> 돈 수술 장갑 및 접착제 플라스틱 포장으로 동물을 커버한다. 리도카인 주사하여 마취를 제공 (8-10 ㎎ / ㎏, 2 %의 에피네프린) 피하 개두술 사이트 위에. 약물이 조직에 흡수 될 때까지 5 분 - 3 기다립니다. </li></ol> 2. 피부를 제거하고 두개골에서 근육을 철회 <ol><li> 아래에있는 A 두개골을 보는 동안 거의 모든 절차를 수행해부 현미경 (예 : 0.7 - 4.5X 전력, 상황에 따라). </li><li> 집게로 (단지 귀 뒤에) 정중선의 왼쪽 피부 1mm를 들어 올려 수술 가위로 작은 수평 절개를합니다. </li><li> 오른쪽 귀쪽으로 6mm 측면 절단하고 머리의 주동이의 끝으로 컷 - 5합니다. </li><li> 초기 절개 시점에서, 가위를 삽입하고 rostrally 10mm를 잘라. </li><li> 오른쪽 귀 주위의 피부를 잘라 오른쪽 눈 근처에 두개골과 시간적 근육의 오른쪽을 노출 할 수 있습니다. 노광 영역의 가장 넓은 부분에 적어도 7mm 인 것을 확인. 수술 영역을 확장해야 할 경우 더 피부를 낸다. </li><li> 두개골과 피부 사이에 부틸 시아 노 아크릴 레이트 접착제의 몇 방울을 넣어 절개 주위의 피부를 수정합니다. 조직을 확인하는 것은 이전에 접착제의 효능을 증가시키는면 팁 어플리케이터 롤 또는 조직으로 건조되었다. </li><li> 면봉을 사용하여 표면을 문질러원 운동에 두개골의 두개골에서 골막을 제거한다. 아무도 완전히 두개골을 건조하여 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 스프링 가위 집게를 사용하여, 두개골에서 시간적 근육 분리; 잘라는 squamosal 뼈 (그림 1C)를 도달 할 때까지 옆으로 근육을 수축. 눈 근처는 squamosal 뼈의 수준을 따라 실행하는 표면 시간적 정맥이 손상되지 않도록 세심한주의를 기울 그렇지 않으면 발생할 수있는 출혈. </li><li> 제어 겔 발포체 뇌 완충액에 미리 침지 출혈. 심각한 출혈의 경우 열 cauterizer를 사용합니다. 열 cauterizer 치료 다음과 출혈 사이트에 부틸 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 삭제합니다. 영역은 접착제의 효능을 증가시키는면 팁 어플리케이터 롤 또는 직물을 이용하여 미리 건조 확인. </li></ol> 3. 개두술 주 : 외과 의사는 두개골 제거하는 동안 부지런을 유지해야하며,두라는 불필요한 합병증을 방지 할 수 있습니다. 문제 해결 단계는 합병증이 발생해야 포함되어 있습니다. <ol><li> 브레 그마 마크의 위치에 미세한 팁 마커 또는 하부 뇌 영역의 방향을 (도 2A)를 소형 삼각형 조각 테이프를 절단 정수리에서 코너 포인트 중 하나. </li><li> 헤드 플레이트를 부착하기 전에 두개골이 완전히 건조되어 있는지 확인합니다. 더 건조가 필요한 경우 뇌 완충액에 침지 겔 발포체의 도포 후에, 목화 팁 면봉을 사용하여 두개골 빠르게 공기 건조한다. 이 단계는 헤드 고정 플레이트 (도 1b)에 매우 중요하다. 참고 :이 골막 왼쪽 두개골에, 또는 두개골 머리 판에 접착 전에 건조하지 않은 경우, 그것은 분리 가능성이됩니다. 이 경우, 부드럽게 머리 판을 제거하고 다시 시작. 이 과정에서 발생할 수있는 출혈; 이 응고 할 몇 분을 허용하고 부드럽게 제거합니다. 이 과정은 두 번 이상 반복하지 않는 것이 좋습니다. </li> &lt;리&gt; 헤드 판 (16)의 하단 주위에 에틸 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용하고 영역 개두술 (도 1d 및도 2a) 위에 헤드 판 접착제. </li><li> 치과 용 시멘트 만 개두술 영역 노출 떠나는 두개골 및 헤드 판의 개방 공간을 채운다. 10 분 (도 2B) - 치과 건조 시멘트 경화 일반적 5 기다린다. <ol><li> 시멘트가 설정되면, 간단히 뇌 버퍼 웰을 채우는 3 담가 있도록 - 5 분. (그림 2C)를 시추하기 전에 뇌 버퍼를 제거하는 압연 조직을 사용합니다. </li></ol></li><li> 가볍게 치과 드릴로 두개골의 표면을 득점하여 수술 영역을 설명합니다. FG ¼ 버로 (20 PSI의 최대로 설정) 공기 드릴을 사용하여 가변 속도 풋 페달로 제어. </li><li> 부드럽게를 깊게하는 원래의 점수를 따라 드릴을 추적, 전자드릴을 nsuring하면 뇌 (그림 2D)에 두개골을 관통하지 않습니다. 테이크는 드릴링 및 적신 압연 조직으로 두개골 표면을 뿌리며 마치 사이 몇 분 간격으로 변합니다. 이것은 기계적 마찰 장기간 노출 두개골의 가열 건조를 감소시킬 것이다. 참고 : 두개골 신속하게 젖은 젤 폼의 응용 프로그램 후 공기 건조합니다. 더 건조가 필요한 경우,면 팁 면봉을 사용합니다. 주의 : 두개골 두께가 고르지입니다. 두개골의 정중선 가까운 영역과는 squamosal 최적 비교적 얇고 예를 들면, 정수리 시간적 리지는 가장 두꺼운 영역이다. </li><li> 시추하는 동안 주기적으로 부드럽게 집게 또는 비 이동 드릴 비트와 함께 눌러서 두개골의 좌굴을 확인합니다. 뼈 버클하기 시작하면, 드릴링을 중지하고 뇌 버퍼의 전체 창을 담그지. 참고 : 혈액이 지역에서 러시 경우는 경막이 손상되었다는 것을 제안 할 수 있습니다. 이 경우, 주사 전자 현미경 (SEM)을 배치전 습윤 영역 위로 겔 발포체 부드럽게면 팁 면봉 겔 발포체에 압력을인가하면서 혈액을 흡수하려고. </li><li> 뼈를 부드럽게하고 두개골 제거 프로세스를 쉽게 만들기, 뼈에 부착 경질 가능성을 줄이기 위해 두개골을 제거하기 전에 최소 5 분 동안 기다립니다. </li><li> 두개골은 뇌 버퍼에 잠긴 상태에서 두개골 제거 프로세스를 수행합니다. 참고 : 두개골의 일부가 완고하게 부착 된 상태를 유지한다면, # 11 메스 블레이드가 부드럽게 두개골을 득점하는 데 사용할 수 있습니다. 두개골을 통해 뇌에 블레이드를 뚫지하기 위해 세심한주의를 기울입니다. </li><li> 앞쪽 가장자리에서 시작, 부드럽게 집게를 사용하여 경질의 느슨한 두개골을 들어 올립니다. 참고 : 출혈의 작은 금액이 두개골 제거 과정에서 발생하는 경우, 전송 피펫 또는 주사기로 버퍼를 제거한 다음 새로운 버퍼로 교체. </li><li> 뼈가 느슨하고 나면 집게로 뼈, 경막에 단단히 그립을 &quot;부동&quot;과에서 뼈를 들어 올려두라. 뼈는 결코 뇌에 침투 없어야합니다. </li><li> 출혈을 제어하기 위해 점으로 조직의 모서리를 굴려 두개골 우물에서 버퍼의 대부분을 제거합니다. 목화 팁 면봉으로 매우 가벼운 압력을가하면서 빠르게 출혈 영역 겔 발포체 완충액에 미리 침지를 적용한다. 참고 : 출혈은 일반적으로 뼈 또는 경질의 표면의 가장자리에서 온다; 두 경우 모두 정상이며, 더 중요한 혈관이 손상되지 않은 경우 출혈은 빨리 중지됩니다. 출혈이 계속되면 혈액 이미징 영역 위에 응고 시트를 형성 창 전체를 채울 수도있다. <ol><li> 조심스럽게 응고 시트를 제거하고 파열 된 혈관의 소스 주위 그대로 혈액 응고를 유지하면서 이미징 영역에서 응고 된 혈액의 조각을 선택합니다. 이 훨씬 더 많은 혈액 손실의 원인이 될 수 있습니다 블리드 소스에서 혈전을 제거하지 않도록주의하십시오. 모든 혈액을 씻어 뇌 완충액으로 뇌의 표면 관개. </li><li> 에 손이 닿지 않도록주의하십시오민감한 뇌 조직 또는 이물질을 뇌에 추가; 출혈이 멈출 때까지 약 2 ~ 5 분 동안 반복하십시오 ( 그림 2E ). 참고 :이 시점에서 craniotomy는 cranial 창을 준비 (5 단계 참조) 준비가되었습니다. 필요한 경우, 두개골 창을 이식하기 전에 경질을 제거하십시오 (4 단계 참조). </li></ol></li></ol> 4. 두라 제거 참고 : Dura 제거에는 극도의주의가 필요하며 15 분 이상 걸릴 수 있습니다. <ol><li> craniotomy에서 초과 버퍼를 멀리합니다. 촉촉한 표면을 유지하면서 집게로 작은 경질의 조각을 잡고 경질을 부드럽게 찢어냅니다. </li><li> 경도를 부드럽게 찢어 내고 자르기 위해 집게와 스프링 가위를 사용하십시오. </li><li> 뇌의 표면에 더 많은 뇌 완충액을 떨어 뜨려 두라를 부 풀려 두뇌와 분리되게하십시오. 모든 두라가 두개골 창 사이트에서 제거 될 때까지 계속하십시오. 정확하게 수행하면 두뇌가 뚜렷한 bl로 매우 깨끗하게 보입니다.짐 우드 선박없고 결점 (2 층 그림의 2E를 비교). 주의 : 경질의 일부 지역 (정수리 협회 지역의 중간 선 근위 근처 예) 뇌의 표면에 작은 동맥에 연결되어, 이러한 제거는 세동맥을 파열 할 수 있습니다. 이러한 경우, 세동맥의 정상에 그대로 두라의 작은 조각을 떠나 더 좋을 수 있습니다. 변속 드라이브는 작은 면적을 통과하지 않을 수도 있지만, 이는 대 출혈을 갖는 것이 바람직하다. </li><li> 빨리 맥동으로부터 이동을 최소화하고 상기 팽윤 방지 가능한 아가 뇌 표면을 수정 (공정 5 참조). </li></ol> 5. 두개골 윈도우 준비 <ol><li> 70 % 에탄올로 커버 유리를 스프레이 가볍게 건조 공기를 사용하는 용기. 유리가없는 점이나 먼지가 존재하는 완전히 깨끗한 확인합니다. </li><li> 뇌 완충액 15 ㎖에 녹이고 아가 분말 200 mg을 가열하여 1.3 % 아가로 오스를 준비한다. 전자 레인지, 설정모든 한천이 녹을 때까지 한 번에 10-15 초 동안 고온에서 열을 가하여 부드럽게 저어 준다. 참고 : 이미징을 방해 할 수 있으므로 거품이나 입자가 없어야합니다. </li><li> 뜨거운 아가로 오스에 온도계를 놓고 응고 온도 (~ 40 ° C) 바로 위까지 아가로 오스를 식힌다. 참고 : 아가로 오스 용기 바깥쪽으로 시원한 물을 흐르게하면 냉각 과정이 빨라질 수 있습니다. 거품이나 미립자가 없도록 부드럽게 계속 저어줍니다. </li><li> 한천을 적용하기 직전에 두개의 우물에서 뇌 완충제를 제거하십시오. 전달 피펫으로 아가로 오스를 작성하고 직접 아가로 오스를 두뇌에 떨어 뜨립니다. 커버 슬립을 표면 위에 빠르게 놓고 커버 슬립을 모서리에 아가로 오스 방울로 고정하십시오. </li></ol> 6. 안락사 참고 : 우리의 경험에 따르면,이 절차는 90 % 이상을 달성하기 위해 경험이 풍부한 외과 의사에게 최소 3 ~ 4 번의 수술을 필요로합니다.성공률. 경험이 적은 의사는 더 많은 연습이 필요할 수 있습니다. 개두술 또는 durotomy 동안, 뇌는 뇌에 뼈를 통해 드릴 펀치처럼 손상을 유지 할 수 있습니다. 개두술의 가장자리에 약간의 손상이 허용 될 수 있습니다. 뇌가 밝은 빨간색 손상되지 않은 혈관과 흰색 피질과 &quot;깨끗한&quot;보이지 않는 경우, 실험 종료해야 할 수도 있습니다. 불량한 제제의 예는 데드 혈관을 가진 것들을 포함하거나, 외피가 찢어 지거나 손상된 혈관 표시됩니다. 이러한 징후가있는 경우, 실험은 가능성 높은 품질의 데이터를 얻을 것입니다. 수술 / 실험의 성공 여부와 관계없이 인도적으로 실험이 완료 마우스를 안락사. <ol><li> 깊이 적어도 3.5 % 이소 플루 란 마취. 다음에, 300 ㎎ / ㎏에 펜토 바르 비탈 나트륨의 복강 내 주사를 준다. 바늘간에 삽입되는 경우 이상적 죽음은 매우 급속한 (&lt;1 분) 일 것이다. </li><li> 관류가 필요한 경우, 진행하기 전에 동물이 깊이 마취되었는지 확인하십시오 (1.3 단계 참조). </li><li> 또는 관류가 필요하지 않은 경우 최소 5 분 동안 기다린 다음 마우스가 죽었는지 확인하십시오. 호흡, 심장 박동, 통증 철수 및 각막 반사가 없는지 확인하십시오. 또한 말단의 엷은 청색 / 백색 채색 및 피질에 대한 혈관의 어둡기를 관찰하십시오. </li></ol>

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큰 두개 창 혁신적인 프로토콜은 대뇌 피질의 시간적 정수리 부분 위에 동시 촬상을 가능하게한다. 광학 영상과 결합하여, 그 자발적 자극 유도 활성 영역 중에 피질 내의 신경 동성을 나타 내기 위해 도움이 될 수 있습니다. 이 넓은 개두술 또한 혈류와 허혈성 모델 외측 용기 직접 조작의 생체 내 이미징 있도록 중간 대뇌 동맥 (MCA)의 기단부를 포함한 피질 혈관계 네트워크의 큰 신장을 노...

개두술 뇌의 일부분을 나타 내기 위해 신경 과학자들에 의해 사용되는 표준 절차이다. 전기 생리학의 새벽 이후, 개두술는 신경 과학 분야에서 전례없는 혁신을 허용했다. 전극 대뇌 피질의 밀도 매핑은이지도를 기반으로 실험 테스트 가설과 이론을 주도하고있다. 우리는 최근 개두술이 노출 된 영역 (5, 6), (7) 내 피질 활성의 실시간 시각화를 가능 피질 혈류 1, 2, 3 및 신경 혈관 구조 (4)의 생체 내 촬영에 이용되는 새로운 시대를 입력. 많은 연구 구조 및 피질 뉴런, 아교 세포의 기능 및 고전 공부 생체 내 광 이미징 기술과 결합 craniotomies를 사용하지만tical 혈관 (8, 9), 상기 조사에 노출 피질의 작은 면적에 의해 제한 (그러나 10 참조)된다. 이 프로토콜의 목적은, 넓은 측면 개두술을 만드는는 squamosal 뼈 정중선에서 대뇌 피질을 노광 및 브레 그마 및 람다 넘어 연장하는 방법을 제공하는 것이다. 이 대형 개두술 동시 연관 피질의 시청 (retrosplenial,에 cingulate 및 두정엽), 주 및 보조 모터, 감각, 시각 및 청각 피질 수있다. 이 방법은 이전 피질 영역 자발적 자극 유도 활성 피질 5, 11, 12 중 서로 어떻게 상호 작용 하는지를 조사 여러 전압 감응 염료 영상 (VSDI)와 결합하고있다. 이 절차의 가장 어려운 부분은 머리의 위치를 ​​포함동물의 헤드 판을 고정하고, 마루 뼈로부터 시간적 근육 분리 동안 출혈을 방지. 치료는 비스듬한 각도로 두개골 커브로 드릴링과 두개골의 제거 과정에서주의해야한다.

<table><tbody><tr><td>Heating Pad</td><td>FHC</td><td>40-90-2</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>2 or more pairs are recommended</td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00, 15000-10</td><td>1 pair should be designated for dura removal&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Jet tooth shade powder</td><td>LANG Dental</td><td>Jet Tooth Shade Powder</td><td>to be mixed with the Jet Liquid</td></tr><tr><td>Jet tooth shade liquid</td><td>LANG Dental</td><td>Jet Tooth Shade Liquid</td><td>to be mixed wihth the Jet Powder&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Drill Heads - Carbide Burs FG 1/4 389</td><td>Midwest Dental</td><td>385201</td><td></td></tr><tr><td>Agarose Powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Sinclair Dental Canada</td><td>Pfizer Gelfoam</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>124125</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine 2% Epinephrine</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>125299</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethazone 5&amp;nbsp;mg/mL</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>125231</td><td></td></tr><tr><td>Butyl cyanoacrylate glue (VetBond)</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>12612</td><td></td></tr></tbody></table>

a large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity

개두술은 생체 실험을 위해 뇌를 노출 일반적으로 수행 절차입니다. 마우스 연구에서 대부분의 실험실은 작은 개두술, 일반적으로 3mm X 3mm를 사용합니다. 이 프로토콜은 마우스 시간적 두정 피질 위에 대뇌 반구의 대부분을 노출시키는 대략 큰 7mm × 6 mm 두개 창을 생성하는 방법을 소개 (- 폭 4.5 mm - 0 6mm 예 2.5 정수리). 이 수술을 수행하려면, 머리는 약 30 ° 기울어해야하며, 시간적 근육의 대부분은 철회되어야한다. 때문에 뼈 제거의 많은 양이 절차는 수술과 실험을하는 동안 마취 동물 급성 실험을위한 것입니다. 혁신적인 많은 측면 창 두개의 주요 장점은 피질 모두 내측 및 외측 영역에 대한 동시 액세스를 제공하는 것이다. 이 대형 일방적 두개골 창은 세포 사이의 신경 역학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다,다 전극 전기 생리 학적 녹음, 신경 활동 ( 예 : 내인성 또는 외인성 영상)의 영상화, 및 광 생성 자극을 조합하여 다른 피질 영역 사이에서도 가능합니다. 또한,이 큰 craniotomy은 대뇌 피질의 vasculature의 직접적인 조작을 허용 대뇌 피질 혈관의 큰 영역을 노출합니다.

<html> 한쪽 반구 내 대뇌 피질 부위 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 우리는 시상 정맥동과 5 - 6 mm 측면을 가로 지르는 큰 두개 절개술을 사용했습니다. 이 두개골 창은 우뇌 반구의 일차 (모터, 체성 감각, 시각, 청각), 이차 (운동, 시각) 및 연관 (후퇴, 대뇌 피질, 정수리 연합) 피질을 포함했다 ( 그림 3A ). 이 연구에서 우리는 막 전위의 변화를 반영?...

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A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

이 프로토콜은 마우스 대뇌 피질의 시간과 정수리 영역에 걸쳐 큰 일방적 개두술을 만들기위한 방법을 제시한다. 이것은 대뇌 피질 반구의 광대 한 지역에 걸쳐 실시간 영상에 특히 유용합니다.

두뇌 활동의 중규모 넓은 필드 광학 이미징에 대한 큰 측면 개두술 절차

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

a-large-lateral-craniotomy-procedure-for-mesoscale-wide-field-optical

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.2K 조회수.  University of Lethbridge.  이 프로토콜은 마우스 대뇌 피질의 시간과 정수리 영역에 걸쳐 큰 일방적 개두술을 만들기위한 방법을 제시한다. 이것은 대뇌 피질 반구의 광대 한 지역에 걸쳐 실시간 영상에 특히 유용합니다. 

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A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an extremely useful method, because it allows the study of the live intact brain. With appropriate preparations, this technique allows the observation of the same cortical area chronically, from minutes to months. In this video, we show a preparation for chronic in vivo imaging of the brain using two-photon microscopy. This technique was initially pioneered by Dr. Karel Svoboda, who is now a Howard Hughes Medical Institute Investigator at Janelia Farm. Preparations like the one shown here can be used for imaging of neocortical structure (e.g., dendritic and axonal dynamics),  to record neuronal activity using calcium-sensitive dyes, to image cortical blood flow dynamics, or for intrinsic optical imaging studies. Deep imaging of the neocortex is possible with optimal cranial window surgeries. Operating under the most sterile conditions possible to avoid infections, together with using extreme care to do not damage the dura mater during the surgery, will result in successful and long-lasting glass-covered cranial windows.


This video and protocol demonstrate how to implant a glass-covered cranial window in rodents. These preparations can be used for chronic in vivo two-photon imaging of the neocortex over time scales of months. It may also be used for other types of imaging, including optical intrinsic signal imaging.

만성 뇌 영상에 대한 Craniotomy 외과 절차

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an ...

연구

생물학

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized treatment determination. However, perturbation of the tumor architecture by biopsy and other invasive procedures has been associated with undesired effects on tumor progression, which need to be studied in depth to further improve the clinical benefit of these procedures. Conventional static approaches, which only provide a snapshot of the tumor, are limited in their ability to reveal the impact of biopsy on tumor cell behavior such as migration, a process closely related to tumor malignancy. In particular, tumor cell migration is the key in highly aggressive brain tumors, where local tumor dissemination makes total tumor resection virtually impossible. The development of multiphoton imaging and chronic imaging windows allows scientists to study this dynamic process in living animals over time. Here, we describe a method for the high-resolution longitudinal imaging of brain tumor cells before and after a biopsy in the same living animal. This approach makes it possible to study the impact of this procedure on tumor cell behavior (migration, invasion, and proliferation). Furthermore, we discuss the advantages and limitations of this technique, as well as the ability of this methodology to study changes in the cancer cell behavior for other surgical interventions, including tumor resection or the implantation of chemotherapy wafers.

Here we describe a method for high-resolution time-lapse multiphoton imaging of brain tumor cells before and after invasive surgical intervention (e.g., biopsy) within the same living animal. This method allows studying the impact of these invasive surgical procedures on tumor cells&#39; migratory, invasive, and proliferative behavior at a single cell level.

침략적인 외과 생검에 응하여 뇌종양 세포 행동의 경도 내 활력 화상 진찰

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

암 연구학

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

신경과학

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology rely on the injection of a suspension of glioma cells into the brain parenchyma following incision of the dura-mater. Whereas the cells have to be injected superficially to be accessible to intravital two-photon microscopy, superficial injections fail to recapitulate the physiopathological conditions. Indeed, escaping through the injection tract most tumor cells reach the extra-dural space where they expand abnormally fast in absence of mechanical constraints from the parenchyma.
Our improvements consist not only in focally implanting a glioma spheroid rather than injecting a suspension of glioma cells in the superficial layers of the cerebral cortex but also in clogging the injection site by a cross-linked dextran gel hemi-bead that is glued to the surrounding parenchyma and sealed to dura-mater with cyanoacrylate. Altogether these measures enforce the physiological expansion and infiltration of the tumor cells inside the brain parenchyma. Craniotomy was finally closed with a glass window cemented to the skull to allow chronic imaging over weeks in absence of scar tissue development.
Taking advantage of fluorescent transgenic animals grafted with fluorescent tumor cells we have shown that the dynamics of interactions occurring between glioma cells, neurons (e.g. Thy1-CFP mice) and vasculature (highlighted by an intravenous injection of a fluorescent dye) can be visualized by intravital two-photon microscopy during the progression of the disease.
The possibility to image a tumor at microscopic resolution in a minimally compromised cerebral environment represents an improvement of current GBM animal models which should benefit the field of neuro-oncology and drug testing.

We have established a cortical orthotopic glioblastoma model in mice for intravital two-photon microscopy that recapitulates the biophysical constraints normally at play during the growth of the tumor. A chronic glass window replacing the skull above the tumor enables the follow-up of the tumor progression over time by two-photon microscopy.

소성을 Glioblastoma의 마우스 모델은 뇌 실질 물리적 제약 조건을 유지하고의 intravital 두 광자 현미경에 적합

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

의학

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

소뇌 축삭의 레이저 Nanosurgery<em&gt; 생체</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of motor and cognitive disabilities. Its high prevalence poses a serious health burden, as stroke is among the principal causes of long-term disability and death worldwide1. Recovery of neuronal function is, in most cases, only partial. So far, treatment options are very limited, in particular due to the narrow time window for thrombolysis2,3. Determining methods to accelerate recovery from stroke remains a prime medical goal; however, this has been hampered by insufficient mechanistic insights into the recovery process. Experimental stroke researchers frequently employ rodent models of focal cerebral ischemia. Beyond the acute phase, stroke research is increasingly focused on the sub-acute and chronic phase following cerebral ischemia. Most stroke researchers apply permanent or transient occlusion of the MCA in mice or rats. In patients, occlusions of the MCA are among the most frequent causes of ischemic stroke4. Besides proximal occlusion of the MCA using the filament model, surgical occlusion of the distal MCA is probably the most frequently used model in experimental stroke research5. Occlusion of a distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA branch typically spares the striatum and primarily affects the neocortex. Vessel occlusion can be permanent or transient. High reproducibility of lesion volume and very low mortality rates with respect to the long-term outcome are the main advantages of this model. Here, we demonstrate how to perform a chronic cranial window (CW) preparation lateral to the sagittal sinus, and afterwards how to surgically induce a distal stroke underneath the window using a craniotomy approach. This approach can be applied for sequential imaging of acute and chronic changes following ischemia via epi-illuminating, confocal laser scanning, and two-photon intravital microscopy.

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Surgical occlusion of a distal middle cerebral artery branch (MCAo) is a frequently used model in experimental stroke research. This manuscript describes the basic technique of permanent MCAo, combined with the insertion of a lateral cranial window, which offers the opportunity for longitudinal intravital microscopy in mice.

측면 만성 두개골 창 준비 활성화<em&gt; 생체</em&gt; 마우스의 말초 중간 대뇌 동맥 폐색에 따라 관측

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular plasticity or damage occurring overtime and in relation to neuronal activity or blood flow. In vivo two-photon microscopy allows the study of the structural and functional plasticity of large cellular units in the living brain. In particular, the thinned-skull window preparation allows the visualization of cortical regions of interest (ROI) without inducing significant brain inflammation. Repetitive imaging sessions of cortical ROI are feasible, providing the characterization of disease hallmarks over time during the progression of numerous CNS diseases. This technique accessing the pial structures within 250 &#956;m of the brain relies on the detection of fluorescent probes encoded by genetic cellular markers and/or vital dyes. The latter (e.g., fluorescent dextrans) are used to map the luminal compartment of cerebrovascular structures. Germane to the protocol described herein is the use of an in vivo marker of amyloid deposits, Methoxy-O4, to assess Alzheimer&#39;s disease (AD) progression. We also describe the post-acquisition image processing used to track vascular changes and amyloid depositions. While focusing presently on a model of AD, the described protocol is relevant to other CNS disorders where pathological cerebrovascular changes occur.

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

This manuscript describes a procedure to track the remodeling of the cerebrovasculature during amyloid plaque accumulation in vivo using longitudinal two-photon microscopy. A thinned-skull preparation enables the visualization of fluorescent dyes to assess the progression of cerebrovascular damage in a mouse model of Alzheimer&#39;s disease.

종<em&gt; 생체</em&gt;은 Cerebrovasculature의 이미징 : CNS 질환에 관련성

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

Translational Brain Mapping at the University of Rochester Medical Center: Preserving the Mind Through Personalized Brain Mapping

The Translational Brain Mapping Program at the University of Rochester is an interdisciplinary effort that integrates cognitive science, neurophysiology, neuroanesthesia, and neurosurgery. Patients who have tumors or epileptogenic tissue in eloquent brain areas are studied preoperatively with functional and structural MRI, and intraoperatively with direct electrical stimulation mapping. Post-operative neural and cognitive outcome measures fuel basic science studies about the factors that mediate good versus poor outcome after surgery, and how brain mapping can be further optimized to ensure the best outcome for future patients. In this article, we describe the interdisciplinary workflow that allows our team to meet the synergistic goals of optimizing patient outcome and advancing scientific understanding of the human brain.

This article provides an overview of a multi-modal brain mapping program designed to identify regions of the brain that support critical cognitive functions in individual neurosurgery patients.

로체스터 대학 의료 센터의 번역 뇌 매핑: 개인화된 뇌 매핑을 통해 마음 보존

The Translational Brain Mapping Program at the University of Rochester is an interdisciplinary effort that integrates cognitive science, neurophysiology, ...

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit functions in systems neuroscience. However, high absorbance and scattering of light in mammalian tissue limit intravital imaging mostly to superficial brain regions, leaving deep-brain areas, such as the hippocampus, out of reach for optical microscopy. In this video, we show the preparation and implantation of the custom-made imaging window to enable chronic in vivo imaging of the dorsal hippocampal CA1 region in head-fixed behaving mice. The custom-made window is supplemented with an infusion cannula that allows targeted delivery of viral vectors and drugs to the imaging area. By combining this preparation with wide-field imaging, we performed a long-term recording of neuronal activity using a fluorescent calcium indicator from large subsets of neurons in behaving mice over several weeks. We also demonstrated the applicability of this preparation for voltage imaging with single-spike resolution. High-performance genetically encoded indicators of neuronal activity and scientific CMOS cameras allowed the recurrent visualization of subcellular morphological details of single neurons at high temporal resolution. We also discuss the advantages and potential limitations of the described method and its compatibility with other imaging techniques.

This article demonstrates the preparation of a custom-made imaging window supplemented with infusion cannula and its implantation onto the CA1 region of the hippocampus in mice.

마우스를 면도하는 해마에서 신경 활동을 시각화하기위한 두개골 절제술 절차

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE) of Hippocampal Capillaries in Awake Mice

The goal of this protocol is to describe fiber-optic-bundle-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pCLE) in its specific application to elucidate capillary blood flow effects during seizures, driven by mural cells. In vitro and in vivo cortical imaging have shown that capillary constrictions driven by pericytes can result from functional local neural activity, as well as from drug application, in healthy animals. Here, a protocol is presented on how to use pCLE to determine the role of microvascular dynamics in neural degeneration in epilepsy, at any tissue depth (specifically in the hippocampus). We describe a head restraint technique that has been adapted to record pCLE in awake animals, to address potential side-effects of anesthetics on neural activity. Using these methods, electrophysiological and imaging recordings can be conducted over several hours in deep neural structures of the brain.

In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy pCLE of Hippocampal Capillaries in Awake Mice

Whereas multiphoton imaging is only effective at limited depths from the tissue&#8217;s surface, it is possible to achieve 3 &#181;m resolution imaging at any depth via pCLE. Here, we present a protocol to conduct pCLE imaging to measure microvascular dynamics in the hippocampus of ictal and wild-type mice.

깨어 있는 마우스의 해마 모세혈관의 In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE)

The goal of this protocol is to describe fiber-optic-bundle-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pCLE) in its specific application ...

두뇌 활동의 중규모 넓은 필드 광학 이미징에 대한 큰 측면 개두술 절차

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