We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.

참고 : 이러한 분석 시스템의 처리량이 가능한 HTS 실험실 장비에 따라 달라집니다. 이 프로토콜은 96- 웰 포맷으로 액체 취급을 수행 테칸 프리덤 EVO 로봇 (200)에 의해 용이하게된다. 384- 웰 포맷 소형화도 가능하다. 로봇 액체 핸들링 시스템은 모든 실험 단계에서 무균 상태를 유지하기 위해 층류 후드 아래에 배치된다. 어떤 자동화 액체 처리가 없다면, 프로토콜 용이 낮은 스루풋 포맷으로 구성 될 수있다. 기본 검사 1. 1 일 : 준비 및 종자 세포 주 : 종자 세포는 루시퍼 라제 활성, 즉 시드 후, 48 시간을 분석시 80 % 합류를 얻었다. <ol><li> 재현 탁 10 % FBS, 1 % L- 글루타민을 함유하는 RPMI에서 2 × 105 세포 / ml의 농도로 CHP134-mycn3UTR 신경 아세포종 세포를 트립신 처리. 27 판은 적어도 250 ml의 준비<html> 계정 액 처리 고려 세포 현탁액, 데드 볼륨 반복 피펫 팅 단계를 쓰루. 멸균 저수지에 세포 현탁액을 붓고 로봇 책상에 놓습니다. </li><li> 9 바코드 흰색 평면 바닥 96 웰 플레이트 및 로봇 책상에 200 ㎕를 멸균 피펫 팁 상자를 놓습니다. 중력 침강 세포를 피하기 위해 각각의 불출 단계 이전 피펫 팅 세포 현탁액을 혼합한다. 웰 당 1.5 × 104 세포의 최종 농도를 얻기 위해 9 플레이트의 각 웰에 세포를 75 μL 분주. </li><li> 뚜껑 판을 덮고 세포가 우물의 바닥에 침전 수 있도록 30 분 동안 인큐베이터 이외의 장소에 둡니다. 이 가장자리의 영향을 최소화 할 것이다. </li><li> 반복 판 (27)의 총 개수를 준비하기 위해 1.2 배 및 1.3 단계. </li><li> 37 ° C에서 접시를 놓고 5 % CO 2, 24 시간 동안 배양한다. </li></ol> 2. 제 2 일 : 도서관 화합물과 세포 치료 ntent &quot;&gt; 참고 : 스펙트럼 컬렉션 작은 분자 라이브러리 DMSO 10 mM의 농도에서 25 96 웰 플레이트에서 8 행 10 열로 정렬 2,000 화합물로 구성되어 첫 번째와 마지막 열에 우물 컨트롤 비어 있습니다. . 화합물 스크리닝 분석은 일반적으로 1-10 μM 화합물 농도 (8)에서 수행됩니다. 여기에 설명 된 검사 프로토콜은 작업 농도가 2 μM 및 분석 엔드 포인트로 24 시간을 해결합니다. <ol><li> 실온에서 9 화합물 라이브러리 플레이트를 해동. </li><li> 멸균 PBS와 PBS-0.5 % DMSO 솔루션 두 골짜기를 준비하고 로봇 책상에 배치합니다. 각 라이브러리 플레이트를 들어, 준비하고 그에 따라 하나의 희석 판 레이블 - 적어도 400 μL의 작업 양을 가진 폴리 프로필렌 U-바닥 96 웰 플레이트를. 액체 핸들러의 고정 된 정보를 사용하여 멸균 PBS 398 ㎕를 희석 판 (11)에 열 2의 각 웰을 입력합니다. 입력 열 1 멸균 PBS의 12 50 μL대조군 웰의 농도 비히클 (0.02 %)를 재생하기 위해서는 0.5 % DMSO로. </li><li> 두 라이브러리 판, 대응 표시된 희석 판, 50 ㎕를 멸균 피펫 팁의 두 상자와 로봇 책상에 여섯 세포 판을 놓습니다. 세포 판을 폭로. </li><li> 피펫이 해당 희석 플레이트에서 두 개의 라이브러리 판 중 하나에서 10 mM의 주식 솔루션의 μL 잘 섞는다. 이 50 μM의 중간 화합물 농도가 발생합니다. 팁의 동일한 세트를 사용하여, 셀 3 바코드 백색 96- 웰 플레이트에서 50 μM 희석액 3 μL 분주. 각각의 농도를 작동하는 2 μM에서이 희석 방식 결과는 화합물을 테스트했다. 참고 : 끝으로 불필요한 조작을 방지 라이브러리 판은 80 화합물을 포함하더라도, 처음부터 (96) 팁의 전체 세트를 사용합니다. 제 라이브러리 플레이트의 마지막 칼럼이 비어 있기 때문에 이것이 가능하다. </li><li> 피펫 팁을 교체하고 세인트 반복두 번째 라이브러리 플레이트 EP 2.4. </li><li> 세포 판을 덮고 24 시간 동안 인큐베이터에 반환. </li><li> 반복 나머지 라이브러리 판에 대한 2.3-2.6 두 번 더 단계를 반복합니다. </li></ol> 3. 주 3 : 루시퍼 라제 분석을 수행 주 : 루시퍼 라제 분석을 수행하기 전에, 각각의 웰 (9)로부터 세포 생존 지수를 얻기 위해 레사 주린 감소에 기초하여 세포 생존율 분석법로 다중화 할 수있다. 다중화 루시페라아제 및 생존 분석 세포는 루시퍼 라제 활성을 충분히 높은 수준을 제공하는 경우, 그러나, 무시 될 수 있다는 루시퍼 신호의 감소 분석 결과. 루시퍼 라제 활성은 안정한 발광 신호 상업 및 제 10,11 루시퍼 라제 분석 시약의 종류에 의해 검출 될 수있다. <ol><li> 실온으로 선택 재구성 루시퍼 라제 시약을 평형. 볼륨이 모든 정량하여 플레이트 충분히 있는지 확인합니다. 27 판의 경우루시 페라 제 시약의 170 ml의 계정 액체 처리에 복용해야합니다, 죽은 볼륨과 반복 피펫 팅 단계를 쓰루. 저수지에 루시퍼 라제 시약을 붓고 로봇 책상에 놓습니다. </li><li> 인큐베이터에서 세포와 9 판을 제거 로봇 책상에 배치, 발견하고 실온으로 평형을 때까지 기다립니다. 판에 의해 웰 플레이트 당 루시퍼 라제 시약의 5​​0 μl를 추가합니다. 플레이트 사이에, 하나의 플레이트 발광 판독 시간과 동일한 지연을 도입. 이것은 모든 플레이트 시약 첨가로부터 동일한 시간 내에 측정되는 것을 보장한다. </li><li> 30 분 인큐베이션 후에, 루미에서 제 1 플레이트를 배치하고 간단히 진탕 공정 후에 발광을 측정한다. 모든 판을 반복합니다. 각 플레이트의 바코드를 기록하고 처리 판에서 발생하는 다수의 실수를 방지하기 위해 대응하는 데이터 파일에 연관. </li><li> 반복 세포와 나머지 18 판 두 번 3.2-3.3 단계를 반복합니다. </리&gt; <li> 나머지 루시 페라 제 시약을 수집하고 -20 ° C에서 보관합니다. </li></ol> 4. 주 4 : 데이터 분석 <ol><li> 에 판 차량 처리 컨트롤의 평균에 모든 샘플의 정상화를 사용하여 프로세스 실험 데이터. 각 라이브러리 화합물, 삼중 위에 평균값 X 및 SD를 계산. </li><li> 선택 조절 - 위 아래로 조절 평균 값 x와 SD는 모든 분석 처리 값에 대해 계산되는 SD, 및 K × K ± X의 임계 값을 설정하여 안타를 정의 상수이다. </li><li> 임의의 임계 컷오프 &lt;루시퍼 신호의 감소는 아마도 화합물 독성과 연관된 차량 제어 처리의 20 %를 선택한다. 이 임계 값 아래 안타를 폐기하는 것은 크게 반대 검사에서 위양성 히트 수를 줄일 수 있습니다. 참고 : 대신 제어 기반의 정상화, 실험 데이터는 Z 점수 또는 강력한 아날로그 B s을 (를) 적용 처리 할 수​​ 있습니다코어 (12). 또한, 히트 선택을위한 다른 통계 접근 방식은 12 사용할 수 있습니다. </li></ol> 5. 카운터 검사 참고 : 기본 화면에서 확인 된 화합물을 확인하고 카운터 검사에 의한 특이성에 대한 평가 ( &#39;히트&#39;라는 레이블이 붙어 있음). <ol><li> 체리는 해당 레이아웃을 저장, 단일 2D 바코드 튜브에 저장된 분량에서 선택한 안타를 선택하고 새로운 &quot;판을 칠&quot;만듭니다. 컨트롤에 대한 무료 위치를 떠날 것을 잊지 마십시오. 주 : 효율적인 체리 픽킹 시스템의 부재에서 하나의 제어 및 일차 스크리닝 평행 3 &#39;UTR - 내포 세포 모두를 테스트 할 수있다. 이 경우, 도입 된 3 &#39;UTR에 의존 효과를 갖는 화합물의 특정 선택은 반대의 스크리닝 불필요 차 선별 후 가능할 것이다. 그러나, 두 개의 세포주에서 병렬 검사는 분석을 두 배로비용. </li><li> 차 선별을위한 프로토콜 (절 &quot;1 일 : 준비 및 종자 세포&quot;)에 따라, 각각의 &quot;히트 판&quot;각 CHP134-mycn3UTR 및 CHP134-CTRL 안정적 세포의 세 96 웰 플레이트를 준비합니다. </li><li> 차 선별을위한 프로토콜 (절 &quot;주 2 : 도서관 화합물과 세포 치료&quot;)에 따라, 농도를 작동하는 2 μM에서 세 CHP134-mycn3UTR 세 CHP134-CTRL 판을 치료하기 위해 각각의 히트 플레이트를 사용합니다. 주 : 여기에서 설명 된 이의 화면이 μM의 단일 투여 량으로 3 회 반복 수행되는 동안, 그것은 표준 복제물 대체 2 μM 내지 20 nM의 범위의 10 배 희석 물로 3 농도 히트를 테스트하는 것이 유익 할 수도있다. 이 접근법을 적용하는 것은 단지 위양성 요금을 최소화 차 안타 예비 용량 - 반응 데이터를 획득하는 것도 기본 화면의 데이터를 확인하지만, 허용하지 않을 것이다. 이 경우, 서로 다른 파이프 라인 분석 애플리되어야에드 실험 데이터를 처리하고 안타를 확인합니다. </li><li> 차 선별을위한 프로토콜 (절 &quot;주 3 : 루시퍼 라제 분석을 수행&quot;)에 따라, 모든 CHP134-mycn3UTR 및 CHP134-CTRL 판에서 루시 페라 제 활성을 측정합니다. </li><li> 차 선별을위한 프로토콜 (절 &quot;주 4 : 데이터 분석&quot;) 다음에 판 차량 처리 컨트롤의 평균 처리 된 우물에서 실험 데이터를 정상화하고 반복 실험을 통해 평균과 SD를 계산합니다. 각 시험 화합물의 경우, CHP134-CTRL 세포 대 CHP134-mycn3UTR 루시퍼 라제 활동의 배의 변화를 계산한다. 임의의 배 변경 컷 - 오프&gt; &lt;0.01의 1.5 중요성 P-값을 선택합니다. 참고 : 히트 특이성에 대한 결정 매개 변수가 CHP134-CTRL 세포 대 CHP134-mycn3UTR 루시퍼 라제 활동의 중요한 배의 변화 기술 분석 설정에서. 필요한 경우, 하나는 SE에서 동시에 세포 생존 분석을 수행하여 화합물의 독성을 평가할 수있다선택 된 화합물. 차 히트는 용량 반응 분석에서 카운터를 차단하는 경우에 특히 도움이 될 수 있습니다. 단일 투여를 들어, 우리의 경험은 6 세포 생존율이 감소하여 감소 된 루시퍼 라제 활성의 강한 상관 관계를 나타낸다. 따라서, 표적 세포뿐만 아니라 대조군 세포에서 루시퍼 라제 활성을 감소는 시험 농도에서 화합물 독성의 지표로 간주 될 수있다. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3&#8217; UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based ...

유전자 발현의 장기간 전사 조절에 단백질 생산을 조절 배타적이지 않은 경우 중요한 역할을 담당하는 것으로 생각 하였다. 축적 된 증거 그러나, 전사 후 조절은 세포 단백질 풍부 1,2-를 결정하는만큼, 그렇지 않은 경우, 전사 조절 이상 기여 것을 나타낸다. 유전자 발현의 전사 후 제어는 제 생각에보다 훨씬 더 복잡하고 정교하다. 사실, 전사 후 제어 모든 다양한 단계는 mRNA의 프로세싱, 지역화, 회전율, 번역 3뿐만 아니라 새롭게 기재된 가역적 RNA 메틸화 4 포함한 조절되는 것으로 나왔다. 전사 후 조절 프로세스의 개수가 영향을받을 가능성에서, 분석은 후술 mRNA의 3 &#39;비 번역 영역 (3&#39;UTR)을 포함하는 것들에 집중한다. 3 &#39;UTR는 크게 RNA 결합 홍보의 특정 상호 작용을 통해 주로 mRNA의 운명에 영향을 미칩니다규제 시퀀스 및 / 또는 보조 구조 5 oteins 및 비 코딩 RNA를. 따라서, 이러한 상호 작용을 변경하거나 업스트림 신호 전달 경로를 방해 소분자 단백질 존재 량을 조절하는 밸런스를 이동한다. 이 치료 방법은있는 증거가 질병 관련 유전자를 따라서 약물 학적 개입의 대상이 될 가능성을 나타내는 전사 후 조절,을 실시한다 보여주는 존재하는 인간의 병리 특히 중요하다. 따라서, 높은 처리량 형식의 전사 후 조절 기전과의 간섭을 통해 mRNA 수준 &#39;조절제의 스크리닝을 가능 시스템은 잠재적 인 신규 한 치료의 확인에 유용한 도구가 될 수있다. 셀 기반 기술 된 리포터 유전자 분석법은 3 &#39;UTR에 의존 기전을 통해 mRNA의 운명을 조절 할 화합물의 식별을 허용한다. 그것은 몇 가지 주요한 C로 구성omponents (그림 1)과 몇 가지 예비 단계를 필요는 분석의 타당성을 검증합니다. 우선, 리포터 구조물은 관심 유전자의 3 &#39;UTR을 포함하도록 설계된다. 3 &#39;UTR은 개똥 벌레 루시퍼 라제 (도 1)와 같은 리포터 유전자의 말단에 융합된다. 삽입 된 3 &#39;UTR을 발휘 전사 후 조절 메커니즘의 변경은 다양한 루시 페라 수준의 결과,이 키메라 성적 증명서의 안정성 및 / 또는 번역 효율을 변경합니다. 따라서, 루시 페라 제 활동의 변화는 관심의 유전자의 영향을받는 전사 후 조절의 간접 측정을 제공합니다. 시스템의 제 2 성분 제어 리포터 구조체 같은 리포터 유전자를 발현하지만 임의 3 &#39;UTR을 포함하지 않는 동일한 발현 플라스미드이다. 두 개의 리포터 플라스미드는 종래의 분자 생물학 프로토콜을 사용하여 실험실에서 설계 또는 시판 처로부터 구입할 수있다. 적절한 세포주의 선택은 구조 분석에 중요하다. 어떤 세포주가 최적의 모델입니다 가용성, transfectability, 성장 특성 같은 단지 실제적인 문제에 대한 병리 최대 유사 같은 임상 적 요구 사항에 이르기까지 수많은 요인에 따라 달라집니다. 중요한 것은, 이전에 하나의 리포터 유전자 3 &#39;UTR의 융합 키메라 성적의 수준에 예상되는 효과가 있는지 확인해야합니다 진행합니다. 3에서 루시 페라 제 신호에 유의 한 차이가 없으면 다른 사람의 검색하라는 메시지 UTR이 세포 모델에서 작동하지 않습니다 &#39;UTR 베어링 및 제어 기자가 일시적으로 (3)가 있음을 나타냅니다 선택한 셀에 형질 구축&#39;. 고 스루풋 포맷의 경우, 3 &#39;UTR 베어링 및 제어 루시퍼 라제 리포터 구조물을 안정적으로 선택된 세포주에 통합되어야한다. 사용하여 안정적으로 일시적를 통해 통합 된 형질 전환세포계는 여러 가지 이유로 바람직하다. 이것은 비용을 가시고, 형질 전환 효율의 변동으로부터 발생하는 데이터의 변동을 감소 어려운 트랜 세포주를 포함한 셀룰러 모델의 선택 범위를 확장 할 것이다. 또한, 일시적인 형질 세포에 매우 자주 시스템의 포화에 이르는 DNA 플라스미드 오버로드됩니다. 이러한 설정에서 기자 발현의 추가 증가는 잠재적 인 상승 조절 화합물으로 감소 감도의 결과, 문제가 될 수 있습니다. 모든 분석 성분을 설정할 때 루시퍼 라제 활성이 참으로 상향 및 하향 조절 3 &#39;삽입을 통해 구체적으로 될 수있는 경우 마지막으로, 그것은 분석, 즉의 타당성을 결정하기 위해 고 스루풋 포맷으로 이동하기 전에 중요 UTR. 가장 관심 컨트롤 3 &#39;UTR을 통해 mRNA의 안정성 또는 번역 능력을 조절하는 것으로보고 소분자 것이다. 이러한를 갖는 경우가능하지, 원하는 효과를 모방 대리 컨트롤이 허용됩니다. 이러한 miRNA가 또는 관심의 3 &#39;UTR에 결합을 통해 그 효과를 발휘하는 것으로 알려져 RNA 결합 단백질이 될 수 있습니다. 이러한 제어 평가 일차 스크리닝 분석법 개발의 기능을 나타내고, 또한 높은 스루풋 포맷의 동적 범위, 감도 및 성능 추정을 허용하지 전에 만. 설명 프로토콜을 사용하여 우리는 2,000 화합물 라이브러리 (6) 상영. 신경 모세포종, 유아기의 가장 흔한 두개 외 고형 종양은 생물학적 모델로서 사용하고, 증폭 MYCN 종양 유전자의 3 &#39;UTR 강하게 표적 유전자는 7 아세포종의 불리한 결과를 예측한다. (2) 실험 레이아웃을 설명도. 심사는 하나의 실행에서 상영 27 판의 배치 크기로 3 실점으로 분할되었다. 27 판의 배치는 스펙트럼 컬렉션 라이브러리를 포함플레이트 N.1 - n.8 + n.25 (첫 번째 실행), n.9-n.16 + n.25 (두 번째 실행)과 n.16 - n.24 + n.25 (제 3 군), 각 판은 세중에서 상영. 따라서, 하나의 라이브러리 판 (n.25)이 가능한 간 실행 비교를 세 가지 실행 내에서 측정 하였다. 이 프로토콜은 아래 중으로 시험 9 라이브러리 판의 단일 실행에 대해 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Culture plate 96-well White</td><td>PerkinElmer</td><td>6005688</td><td></td></tr><tr><td>StorPlate 96-well U bottom (dilution plate)</td><td>PerkinElmer</td><td>6008190</td><td></td></tr><tr><td>100 ml disposable trough for reagents</td><td>Tecan</td><td>10 613 048</td><td></td></tr><tr><td>300 ml disposable robotic reservoir</td><td>VWR</td><td>PB12001301</td><td></td></tr><tr><td>Robot tips DITI 50&amp;nbsp;&amp;mu;l Sterile</td><td>Tecan</td><td>30038607</td><td></td></tr><tr><td>Robot tips DITI 200&amp;nbsp;&amp;mu;l Sterile</td><td>Tecan</td><td>30038617</td><td></td></tr><tr><td>Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>3711</td><td></td></tr><tr><td>ONE-Glo Luciferase Assay System&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>E6120</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>BE12-918F</td><td></td></tr><tr><td>PBS-1x, w/o Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200&amp;nbsp;mM</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>The Spectrum collection (compound library)</td><td>MicroSource Discovery Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Freedom EVO200 robot&amp;nbsp;</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tecan F200 multiplate reader&amp;nbsp;</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput screening for chemical modulators of post-transcriptionally regulated genes

전사와 전사 후 조절은 모두 유전자 발현에 지대한 영향을 미친다. 그러나, 일반적으로 채택 세포 기반 스크리닝 분석은 본질적으로 프로모터 대상 분자의 식별을 목표로하고, 전사 조절에 초점을 맞 춥니 다. 그 결과, 전사 후 기전은 주로 유전자 발현 표적 약물 개발에 의해 발견된다. 여기에서 우리는 그것을 수정할 수 화합물을 식별하는 자사의 mRNA의 운명의 변조의 3 &#39;번역 영역 (3&#39;UTR)의 역할을 조사하기위한 셀 기반 분석을 설명합니다. 분석은 안정 질병 관련 세포주에 통합 관심 유전자의 3 &#39;UTR을 포함하는 루시퍼 라제 리포터 구조물의 사용에 기초한다. 프로토콜은 치료 후 24 시간 후 루시퍼 라제 활성에 영향을 미치는 분자 식별 목적 일차 스크리닝에서 초기 포커스로, 두 부분으로 분할된다. 프로토콜의 두 번째 부분설명 카운터 선별 특히 3 &#39;UTR을 통해 루시퍼 라제 활성을 조절 화합물을 구별 할 필요가있다. 프로토콜 상세 및 대표적인 결과 외에, 우리는 분석법 개발 및 내인성 표적에 적중 (들)의 유효성에 대한 중요한 고려 사항을 제공한다. 셀 기반 기술 된 리포터 유전자 분석법 과학자 3 &#39;UTR에 종속 전사 후 기전을 통해 단백질 수준을 조절 분자를 식별 할 수 있도록 할 것이다.

설명 된 접근법을 사용하여, 우리는 MYCN 유전자의 3 &#39;UTR 누두 전사 후 제어 메커니즘의 전위 조절제 위해 2,000 화합물 라이브러리를 스크리닝.도 3은 하나의 라이브러리 플레이트로 예시 일차 스크리닝의 결과를 도시도. 비히클 - 처리 된 콘트롤의 백분율로서 표시 루시페라아제 신호는 단일 라이브러리 플레이트 화합물로 처리-mycn3UTR CHP134 세포 중으로 판에 루시...

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High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

high-throughput-screening-for-chemical-modulators-post

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

9.4K 조회수.  University of Trento. Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.

비디오: High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

연구

유전학

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been described, termed &#34;na&#239;ve&#34; and &#34;primed&#34; pluripotency. The mechanisms that control na&#239;ve-primed transition are poorly understood. In particular, we remain poorly informed about protein kinases that specify na&#239;ve and primed pluripotent states, despite increasing availability of high-quality tool compounds to probe kinase function. Here, we describe a scalable platform to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition in mouse ESCs. This approach utilizes simple cell culture conditions and standard reagents, materials and equipment to uncover and validate kinase inhibitors with hitherto unappreciated effects on pluripotency. We discuss potential applications for this technology, including screening of other small molecule collections such as increasingly sophisticated kinase inhibitors and emerging libraries of epigenetic tool compounds.

Here, we present a quantitative and scalable protocol to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition.

높은 처리량 억제제 스크리닝에 의한 배아 줄기 세포의 다 능성을 조절하는 키나제를 확인하는 간단한 방법

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

발생학

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

아데 닐 레이트 사이 클라 제의 약물에 의한 과민성 : 작은 분자와 siRNA의 심사 응용 프로그램에 대한 분석 최적화 기술과 소형화

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

생체공학

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for anti-cancer therapies. However, directly targeting transcription factors is often difficult and can cause adverse side effects if the transcription factor is necessary in one or more adult tissues. Identifying upstream regulators that aberrantly activate transcription factors in cancer cells offers a more feasible alternative, particularly if these proteins are easy to drug. Here, we describe a protocol that can be used to combine arrayed medium-scale lentiviral libraries and a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay to identify novel regulators of transcription factors in cancer cells. Our approach offers a quick, easy, and inexpensive way to test hundreds of genes in a single experiment. To demonstrate the use of this approach, we performed a screen of an arrayed lentiviral RNAi library containing several regulators of Yes-associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ), two transcriptional co-activators that are the downstream effectors of the Hippo pathway. However, this approach could be modified to screen for regulators of virtually any transcription factor or co-factor and could also be used to screen CRISPR/CAS9, cDNA, or ORF libraries.

To identify novel regulators of transcription factors, we developed an approach to screen arrayed lentiviral or retroviral RNAi libraries using a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay. This approach offers a quick and relatively inexpensive way to screen hundreds of candidates in a single experiment.

배열된 라이브러리의 중간 처리량 스크리닝및 이중 루시퍼라제 기반 리포터를 이용한 전사 계수 조절기 식별

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

암 연구학

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

의학

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

RNA 바이러스의 넓은 스펙트럼 화학 억제를위한 높은 처리량 검사

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

면역학 및 감염병학

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

안쪽 정류기의 칼륨 채널의 소형 분자 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

생물학

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

배양 된 포유 동물 세포의 생물 학적 경로의 유비퀴틴과 유비​​퀴틴 같은 시스템 레귤레이터를 확인하는 siRNA를 상영

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

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바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

높은 처리량 억제제 스크리닝에 의한 배아 줄기 세포의 다 능성을 조절하는 키나제를 확인하는 간단한 방법

아데 닐 레이트 사이 클라 제의 약물에 의한 과민성 : 작은 분자와 siRNA의 심사 응용 프로그램에 대한 분석 최적화 기술과 소형화

배열된 라이브러리의 중간 처리량 스크리닝및 이중 루시퍼라제 기반 리포터를 이용한 전사 계수 조절기 식별

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

RNA 바이러스의 넓은 스펙트럼 화학 억제를위한 높은 처리량 검사

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

안쪽 정류기의 칼륨 채널의 소형 분자 변조기에 대한 높은 처리량 검사

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

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