1. 권장 사항 시작하기 전에 <ol><li> 그들은 동방 결절 세포로 제대로 구분하지 않기 때문에 마이코 플라즈마 오염 PSC를 사용하지 마십시오. 프로토콜을 시작하기 전에 마이코 플라스마 오염에 대한 테스트합니다. 마이코 플라즈마 신속, 고감도 검출을위한 PCR 키트를 사용하여이 작업을 수행하고 제조자의 프로토콜을 따르십시오. </li><li> 각 페트리 접시 (단계 2.3.4), 코트 한 10cm 37 ° C에서 1 시간 동안 차가운 물에 물고기 피부에서 멸균 7 ml의 0.1 % 젤라틴 2 세포 배양 접시하십시오. 멸균 벤치에서 무균 조건에서 요리 건조 젤라틴을 제거 할 수 있습니다. </li><li> 포유 동물 발현 벡터를 사용하여 TBX3의 난) 구성 적 과발현 : 당신이 분화 프로토콜을 시작하기 전에 다음과 같은 기능을 포함하는 이중 형질 전환 안정된 마우스 ES 세포주 클론이 필요합니다. ⅱ) Myh6 촉진제 (5)의 제어하에 G418 내성 유전자. </li><li> PSC를 미분화 세포 공동 배양되어야설명 1 표준 조건에서 조사 피더 세포와 D. </li></ol> 2. 차별화 절차 <ol><li> 두 일 분화하기 전에 - 피더 세포에서 PSC를 제거합니다. <ol><li> 10 ml의 포스페이트 완충 식염수 PBS로 세포를 세척 매체 기음 7 ㎖의 콜라게나 제 IV의 용액을 첨가하고, 37 ° C에서 10 분 동안 세포를 배양한다. 50 ML 튜브에 멸균 40 μm의 필터를 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 PSC 식민지를 씻어 위아래로 5 번 콜라겐 솔루션을 피펫 팅 (피더 세포를 제거하는 방지). </li><li> , 40 μm의 필터에 세포 현탁액을 전송 8 ml의 PBS로 세 번 필터를 헹군다. 필터 주변에 돌고 거꾸로 페트리 접시에 놓습니다. 필터의 바닥에 10 ml의 PBS를 피펫 팅하여 PSC 세포 식민지를 제거합니다. </li><li> 300 x g에서 5 분 동안 15 ml의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송. </li><li> 1 ml의 Accutase 그리고 난에 세포를 일시 중지, PBS를 제거5 분 37 ° C에서 ncubate. </li><li> 10 ml의 PBS를 추가 X g 300에서 5 분 동안 아래로 5 회 원심 분리기를 그것을 피펫 팅에 의해 셀 솔루션을 섞는다. </li><li> 상기 PBS를 제거 10 ㎖ 배양 배지에서 세포를 중단하고 세포 수를 결정한다. </li><li> 종자 15,000 세포 / 75cm 2 필터 플라스크에 2 cm, 37 ° C, 5 % CO2에서 2 일간 배양 그들을. 이일 후 플라스크에 50-70 %의 합류해야합니다. </li></ol></li><li> 0 일 - 차별화의 시작 <ol><li> 매체를 제거하고 10 ml의 PBS로 세포를 씻어. </li><li> , PBS 대기음 2ml의 Accutase을 추가 5 분 동안 37 ℃에서 세포를 배양한다. 50 ML 튜브에 멸균 40 μm의 필터를 놓습니다. </li><li> , 40 μm의 필터에 세포 현탁액을 전송하고, 10 ㎖의 PBS를 추가 10 ㎖의 PBS를 첨가하고 원심 분리기를 통해 필터 린스 관류 300 x g에서 5 분간. </li><li> 10 ㎖ 분화 배지에서 세포를 일시 중단하고 세포 수를 결정한다. </li><li> t을 희석그는 20,000 세포 / ml의 최종 농도로 분화 배지 현탁액 전지. </li><li> 피펫 20 ml의 물과 HDS는 건조 아웃을 피하기 위해 차 배양 접시에서 드롭 (HD) 솔루션을 걸려 5 ml의. 참고 : 각 24 웰 플레이트 포함 iSABs 16 페트리 접시로 시작 (섹션 2.8.6.4/2.8.7 참조​​). </li><li> 트레이에 50 ml의 세포 현탁액까지 피펫. </li><li> 페트리 접시의 뚜껑 주위를 돌립니다. 12 채널 피펫을 사용하여 뚜껑에 180 HDS는 각각의 포함 20 μL (400 셀 / HD) 세포 현탁액을 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 뚜껑 돌아서과 페트리 접시에 놓습니다. 주 : 덮개의 주위를 선회 속도가 매우 중요하다. 뚜껑이 너무 느리거나 너무 빠른 바꾸게되면, 세포 현탁액의 표면 장력이 걸려 뚜껑에 삭제 유지할만큼 충분히 높지 않다. 매체의 20 μl의 방울과 뚜껑 주위를 선회 처음 연습 HDS는 생산하기 전에. </li><li> (3)에 2 일 동안 세포 배양7 ° C, 5 % CO 2는 그들이 사채를 형성 할 수있다. 참고 : 5 페트리 접시의 스택의 상단에 물이 가득 배치 한 페트리 접시. 그렇지 않으면 상위 페트리 접시에 HD 건조합니다. </li></ol></li><li> 2 일 <ol><li> 조심스럽게 차 페트리 접시의 뚜껑 주위를 켜고 50 ㎖ 튜브에 두 개의 배양 접시 (360 사채)에서 파생 된 사채를 전송합니다. </li><li> 사채는 튜브의 아래쪽에 정착하자 10 분을 기다립니다 (EB를 원심 분리하지 마십시오). </li><li> 대기음 극력 매체로서, 10 ㎖ 분화 배지에서 EB를 중단하고 10cm 페트리 접시에 현탁액을 전송. </li></ol></li><li> 하루 2-6 서스펜션 문화 <ol><li> 37 ° C에서 4 일 동안 정학의 사채를 양성, 5 % CO 2는 2 일 후 매체를 변경합니다. 주 : EBS는 종종 표면에 부착 (세포 배양 접시는 대조적으로) 배양 접시에 도포되지 않더라도. EB를 부착 사채 매일 매일 필요한 경우 분리 배양 접시를 제어부드러운 피펫 팅에 의해 표면에서. 옵션 : 현탁 배양 기간 동안 지속적으로 배양 접시를 흔들어. 셰이커의 속도에주의하십시오. 사채는 어느 쪽도 중간에 축적되지도 배양 접시의 테두리에 떠 있어야합니다. </li></ol></li><li> 6 일 <ol><li> 한 젤라틴 코팅 10cm 2 세포 배양 접시에 하나의 배양 접시에서 사채를 전송합니다. </li></ol></li><li> 하루 7-12 <ol><li> 세포 8-12 일 후에 이길 시작해야합니다. 매일 현미경으로 세포의 초점을 치고 있는지 확인합니다. 세포는 층을 형성하기 시작한다. </li><li> 매체 매일을 변경합니다. 주 : 매체를 변경 한 후, 세포를 복구하고 다시 박동 3-4 시간을 필요로한다. </li></ol></li><li> 동 노드 세포의 날 12 ~ 15 선택. <ol><li> 세포 (12 ~ 15 일 정도) 꺾고 사흘 시작한 후, 세포에 400 ㎍ / ㎖의 G418을 함유하는 신선한 배지 분화 배지 10 ml의 피펫 대기음. </li></ol></li><l난&gt; 나흘 선택의 시작 후 전지 층을 해리. 주 : 세포층 이미 표면으로부터 분리되는 것이 가능하다. <ol><li> 셀 층을 흡입하지 않고 신중하게 매체를 제거합니다. </li><li> PBS의 10 ML을 추가하고 세포 층을 흡입하지 않고 조심스럽게 PBS를 제거합니다. </li><li> 50 ㎖ 튜브에 세포를 전송하고, 5 분 동안 37 ° C에서 배양 한 세포를 콜라게나 제 IV 용액 10 ㎖를 추가한다. </li><li> 격렬하게 피펫 팅하여 10 배의 아래 현탁액을 혼합하고, 5 분 동안 37 ℃에서 세포를 배양한다. 작은 클러스터의 정지가 발생한다. 여전히 남아 층의 큰 부분이 있으면, 단계 2.8.4을 두 번 더 반복한다. </li><li> 300 x g에서 10 분 동안 20 ㎖의 PBS와 원심 분리기를 추가합니다. </li><li> PBS를주의 깊게 기음. 참고 : iSABs 단계 2.8.7을 계속 생성 될 경우. ISAB 파생 동 마디 하나의 세포가 생성 될 경우 단계 2.9에 이동합니다. </li><li> 세포를 일시12 ㎖에 분화 배지는 400 ㎍ / ㎖의 G418을 함유하는 코팅 된 젤라틴과 6 웰 24 웰 (/ 웰 2 ㎖)에 그들을 시드. </li></ol></li><li> 단일 노드 세포의 생성. <ol><li> 5 ㎖ Accutase 단계 2.8.6에서 세포를 일시 중단하고, 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 격렬하게 피펫 팅하여 10 배의 아래 현탁액을 혼합하고, 5 분 동안 37 ℃에서 세포를 배양한다. </li><li> 300 x g에서 5 분 동안 20 ㎖의 PBS와 원심 분리기를 추가합니다. </li><li> 400 ㎍ / ㎖의 G418을 함유하는 12 ml의 분화 배지에서 세포를 일시 중단하고 24 웰 (2 ㎖ / 웰) 코팅 젤라틴 6 웰 그들을 시드. </li></ol></li><li> 분리 후 제 2 일, 매체를 대기음하고 PBS로 세포를 세 번 씻는다. 잘 / 1 ml의 차별화 매체를 추가합니다. </li><li> 하루 4-8 분리 후, 매 2 차 일 중간을 변경합니다. 해리 사용 iSABs 또는 ISAB 파생 동 후 10 일에 마디 하나의 세포는 추가 분석을 위해 사용할 수 있습니다. </li></ol>

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능력 &quot;생물학적 박동기&quot;의 의미로 적절한 심박동의 재구성을 허용 할 수있다 세포 유래 심장 페이스 메이커의 줄기 세포를 생성한다. 마찬가지로, 시험관 내에서 약물 검사는 가용성 도움이됩니다. PSC를 페이스 메이커의 셀 속성 8,9,10,11,12,13와 심근을 포함한 포유 동물의 신체의 세포 유형을 야기 할 수 있습니다. 그러나, 전형적으로 &quot;배양체&quot;내의 세포 집단은 필연적으로 ?...

용어 &quot;아픈 부비동 증후군은&quot;심장 맥박 조정기 시스템의 악화로 이어지는 여러 질병을 요약 한 것입니다. 그것은 병적 인 증상이 동 서맥, 동방 블록, 부비동 체포뿐만 아니라 빈맥 - 서맥 증후군을 포함한다. 이로써, &quot;아픈 부비동 증후군&quot;은 종종 심근 허혈, 심근 병증 심근염 또는 일반적으로 심장 질환을 수반한다. 현재 치료 방법은 전기 맥박 조정기의 주입을 기반으로합니다. 그러나,이 같은 감염과 배터리 고장 등의 위험 번호와 함께 간다. 전반적으로, 합병증의 발생률은 여전히​​ 환자가 인공 심장 박동기를 이식하는 데에 매우 높습니다. 내인성 박동기 반대로 더욱이, 이러한 장치는 호르몬 자극에 반응하지 않는다. 미래의 대안이되는 PSC를가 봉사 할 수 있었다 &quot;생물학적 페이스 메이커&quot;의 가용성에 의존 할 수있다적합한 셀룰러 소스와 어떤으로 또한 체외 약물 검사에 매우 유용 할 것입니다. 그러나, 큰 문제가 배아 체 (사채) 내에서 동 노드 세포의 매우 드문 모양에있다 - 이것은 일반적으로 ~ 0.5 % 1을 초과하지 않는다. 이전에는 특정 심근 서브 타입을 향해 &quot;앞으로 프로그래밍&quot;등 관련 중배엽 - 별 후방 1 (MesP1) 및 NK2 전사 인자 궤적 5 (Nkx2.5) 2와 별개의 조기 심장 혈관 전사 인자의 과발현을 통해 가능하다 것으로 나타났다, 3. 보통 크기와 동방 노드 (SAN)의 기능을 위해, T-박스 전사 인자 TBX3는 페이스 메이커 유전자 프로그램을 개시하고 SAN (4)의 분화를 제어하기 위해 도시 된, 결정적이다. 이는 기능상 박동기 세포의 모양을 개선하면서, 콘텐츠는 여전히 전체 cardiomyocytic 세포 집단 내에서 ~ 40 %를 초과하지 않았다. 따라서, 추가 Myh6 발기인 기반 항생제 선택 5 단계를 우리가 도입되었다. 체외 배양에 쥐 심장의 사람들과 비교를 근사 처음으로 체외에서 높은 증가 박동 주파수 (&gt; 400 BPM)를 전시; 이것은 궁극적으로 아직 관찰되지 심근 집계 (iSABs &quot;&quot;유도 된 중국 - 심방 기관 &quot;)에 리드 쥐의 심장 (6)에서 분리 된 동 결절 세포. 이소 프레 날린 관리에서 550 BPM 심지어 구타 주파수를 얻을 수있다. 특히, iSABs 7을 분석하여 광범위한 생리에서 명백한 바와 같이 80 % 이상 기능 림프절 세포로 구성되어 있습니다. 최근, 다양한 접근이 직접 리 프로그래밍 (19)을 이용하여 상악동에게 결절 세포를 생성하기 위해, 표면 (16, 17)에 대하여 설명 하였다 소분자 약물 치료 14 또는 마커. 그러나, 이러한 방법 중 어느 것도 페이스 메이커 세포의 이러한 높은 순도 주도하지 않고 쥐에 가까운 주파수를 치고 그예술 iSABs에서 관찰. 또한, 자신의 자율 박동 활동을 잃었다 재배 성인 마우스 심실 조각의 생체 모델, iSABs는 슬라이스 조직으로 통합하여 자발적으로 활성 남아있는 견고하게 수축 7 심장 조각을 페이싱 할 수있다. 이 iSABs의 생성에 대한 자세한 프로토콜은이 문서에 설명되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Iscove&#039;s liquid medium with stable glutamine</td><td>Biochrom AG</td><td>FG 0465</td><td></td></tr><tr><td>DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine</td><td>Biochrom AG</td><td>FG 0435</td><td></td></tr><tr><td>CLS type IV, CLS IV</td><td>Biochrom AG</td><td>C4-22</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acids</td><td>Biochrom AG</td><td>K 0293</td><td></td></tr><tr><td>FBS Superior</td><td>Biochrom AG</td><td>S 0615</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate (100 mM)</td><td>Biochrom AG</td><td>L 0473</td><td></td></tr><tr><td>G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile</td><td>Biochrom AG</td><td>A 2912</td><td></td></tr><tr><td>Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile</td><td>Brand</td><td>703409</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>eBioscience,Inc.</td><td>00-4555-56</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette</td><td>Eppendorf</td><td>4861000155</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainer 40 &amp;micro;m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>Greiner BioOne</td><td>663102</td><td></td></tr><tr><td>DPBS without Ca and Mg</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>PAN-Biotech</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>Leukemia inhibitory factor</td><td>Phoenix Europe GmbH</td><td>LIF-250</td><td></td></tr><tr><td>Quadratic petri dishes</td><td>Roth</td><td>PX67.1</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from cold water fish skin</td><td>SigmaAldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>SigmaAldrich</td><td>M3148&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1-Thioglycerol</td><td>SigmaAldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture dishes</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture flask</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture test plates (24 well)</td><td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of murine cardiac pacemaker cell aggregates based on es-cell-programming in combination with myh6-promoter-selection

&quot;아픈 부비동 증후군 &#39;의 치료는 인공 심장 박동기를 기반으로합니다. 여기에는 배터리 오류 및 감염 등의 위험을 부담. 또한, 그들은 호르몬 응답이 부족하고 전반적인 절차는 비용 집약적이다. PSC를에서 생성 된 &quot;생물 페이스 메이커&quot;는 대안이 될 수있다, 아직 배아의 몸에서 심장 박동 조절 세포의 일반적인 내용 (사채)는 매우 낮다. 설명 프로토콜은 Myh6 발기인 기반 항생제 선택과 부비동 노드 유도의 TBX3을 통해 쥐의 PSC를의 &quot;앞으로 프로그래밍&quot;을 결합합니다. 이&gt; 80 % 생리 학적 기능성 페이스 메이커 세포의 일관된 심근 집계를 산출한다. 이러한 &quot;유도 동방-몸은&quot;( &quot;iSABs&quot;) 자발적으로 마우스 마음에서 고립 마디 세포에 해당 아직 미전도 주파수 (400 ~ 500 BPM)에서 계약과 쥐의 심근 생체 조절이 할 수 있습니다. 설명 프로토콜 고순도의 동을 사용하여절점 단셀 약물은 시험 관내 시험을 위해 사용될 수있는 예를 생성 할 수있다. 또한,이 프로토콜에 따라 생성 된 iSABs 심장 조직 공학을 향한 중요한 단계가 될 수 있습니다.

설명 프로토콜은 마우스의 심장 박동 주파수에 가까운 (동영상 참조) PSC를에서 약 450 BPM의 구타 주파수 iSABs의 생성을 할 수 있습니다. 도 1에 도시 된 바와 같이 iSABs 해리 (단계 2.8.8) 후에 관찰 된 단일 세포는 동방 결절 (주축 및 거미 세포)의 세포의 일반적인 형태를 나타낸다. 이들 세포를 알려진 고도로 익스프레스 단백질 기능에 필수적인 것으로 과분극 활성화 주기적 뉴클레오티?...

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Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

이 프로토콜은 쥐의 다 능성 줄기 세포 (PSC)에서 기능 동 노드 조직을 생성하는 방법에 대해 설명합니다. T-Box3 (TBX3) 과발현 플러스 심장 미오신 헤비 체인 (My​​h6) 발기인 항생제 선택은 고순도의 페이스 메이커 세포 집합체로 연결됩니다. 이러한 &quot;유도 - 동방 - 몸&quot;( &quot;iSABs&quot;)는, 고도의 박동 속도를 증가 보여 80 %의 심장 박동 세포를 포함하고 심근 생체 조절이 할 수 있습니다.

Myh6 발기인 - 선택과 함께 ES-세포 프로그래밍을 바탕으로 설치류 심장 페이스 메이커 세포 집합체의 생성

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

generation-murine-cardiac-pacemaker-cell-aggregates-based-on-es-cell

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.6K 조회수.  University of Rostock.  이 프로토콜은 쥐의 다 능성 줄기 세포 (PSC)에서 기능 동 노드 조직을 생성하는 방법에 대해 설명합니다. T-Box3 (TBX3) 과발현 플러스 심장 미오신 헤비 체인 (My​​h6) 발기인 항생제 선택은 고순도의 페이스 메이커 세포 집합체로 연결됩니다. 이러한 "유도 - 동방 - 몸"( "iSABs")는, 고도의 박동 속도를 증가 보여 80 %의 심장 박동 세포를 포함하고 심?...

비디오: Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포의 유도

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

연구

발생학

Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5

Direct conversion of cardiac fibroblasts (CFs) into induced cardiomyocytes (iCMs) holds great potential for regenerative medicine by offering alternative strategies for treatment of heart disease. This conversion has been achieved by forced expression of defined factors such as Gata4 (G), Mef2c (M) and Tbx5 (T). Traditionally, iCMs are generated by a cocktail of viruses expressing these individual factors. However, reprogramming efficiency is relatively low and most of the in vitro G,M,T-transduced fibroblasts do not become fully reprogrammed, making it difficult to study the reprogramming mechanisms. We recently have shown that the stoichiometry of G,M,T is crucial for efficient iCM reprogramming. An optimal stoichiometry of G,M,T with relative high level of M and low levels of G and T achieved by using our polycistronic MGT vector (hereafter referred to as MGT) significantly increased reprogramming efficiency and improved iCM quality in vitro. Here we provide a detailed description of the methodology used to generate iCMs with MGT construct from cardiac fibroblasts. Isolation of cardiac fibroblasts, generation of virus for reprogramming and evaluation of the reprogramming process are also included to provide a platform for efficient and reproducible generation of iCMs.

We describe here a protocol for the generation of iCMs using retrovirus-mediated delivery of Gata4, Tbx5 and Mef2c in a polycistronic construct. This protocol yields a relatively homogeneous population of reprogrammed cells with improved efficiency and quality and is valuable for future studies of iCM reprogramming.

Gata4, Mef2c 및 Tbx5의 최적 비율을 표현하는 폴리 시스 트론 구조를 사용하여 유도 된 심근의 향상 발전

Direct conversion of cardiac fibroblasts (CFs) into induced cardiomyocytes (iCMs) holds great potential for regenerative medicine by offering alternative ...

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed phenotypes. Researchers interested in pursuing studies involving specific myocyte subtypes require a more directed differentiation approach. By treating mouse embryonic stem (ES) cells with Grem2, a secreted BMP antagonist that is necessary for atrial chamber formation in vivo, a large number of cardiac cells with an atrial phenotype can be generated. Use of the engineered Myh6-DSRed-Nuc pluripotent stem cell line allows for identification, selection, and purification of cardiomyocytes. In this protocol embryoid bodies are generated from Myh6-DSRed-Nuc cells using the hanging drop method and kept in suspension until differentiation day 4 (d4). At d4 cells are treated with Grem2 and plated onto gelatin coated plates. Between d8-d10 large contracting areas are observed in the cultures and continue to expand and mature through d14. Molecular, histological and electrophysiogical analyses indicate cells in Grem2-treated cells acquire atrial-like characteristics providing an in vitro model to study the biology of atrial cardiomyocytes and their response to various pharmacological agents.

Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.

BMP 길항제 Grem2를 사용하여 다 능성 줄기 세포에서 심방 심근의 차별화

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge, arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle cells. Despite optimum drug therapy, heart failure represents a leading cause of mortality and morbidity in the developed world. A major challenge in drug development is the identification of cellular assays that accurately recapitulate normal and diseased human myocardial physiology in vitro. Likewise, the major challenges in regenerative cardiac biology revolve around the identification and isolation of patient-specific cardiac progenitors in clinically relevant quantities. These cells have to then be assembled into functional tissue that resembles the native heart tissue architecture. Microcontact printing allows for the creation of precise micropatterned protein shapes that resemble structural organization of the heart, thus providing geometric cues to control cell adhesion spatially. Herein we describe our approach for the isolation of highly purified myocardial cells from pluripotent stem cells differentiating in vitro, the generation of cell growth surfaces micropatterned with extracellular matrix proteins, and the assembly of the stem cell-derived cardiac muscle cells into anisotropic myocardial tissue.

The generation of aligned myocardial tissue is a key requirement for adapting the recent advances in stem cell biology to clinically useful purposes. Herein we describe a microcontact printing approach for the precise control of cell shape and function. Using highly purified populations of embryonic stem cell derived cardiac progenitors, we then generate anisotropic functional myocardial tissue.

Microcontact 인쇄를 통해 정렬 기능 심근 조직의 생성

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

생체공학

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that mouse embryonic, dermal, and cardiac fibroblasts can be reprogrammed into functional induced-cardiomyocyte-like cells (iCMs) through overexpression of cardiogenic transcription factors including GATA4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 both in vitro and in vivo. However, these previous studies have shown relatively low efficiency. In order to restore heart function following injury, mechanisms governing cardiac reprogramming must be elucidated to increase efficiency and maturation of iCMs.
We previously demonstrated that inhibition of pro-fibrotic signaling dramatically increases reprogramming efficiency. Here, we detail methods to achieve a reprogramming efficiency of up to 60%. Furthermore, we describe several methods including flow cytometry, immunofluorescent imaging, and calcium imaging to quantify reprogramming efficiency and maturation of reprogrammed fibroblasts. Using the protocol detailed here, mechanistic studies can be undertaken to determine positive and negative regulators of cardiac reprogramming. These studies may identify signaling pathways that can be targeted to promote reprogramming efficiency and maturation, which could lead to novel cell therapies to treat human heart disease.

Here we present a robust method to reprogram primary embryonic fibroblasts into functional cardiomyocytes through overexpression of GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1, and miR-133 (GHMT2m) alongside inhibition of TGF-&#946; signaling. Our protocol generates beating cardiomyocytes as early as 7 days post-transduction with up to 60% efficiency.

프로 거리 신호 억제 유도 Cardiomyocytes에 마우스 미 발달 섬유 아 세포의 프로그래밍 요소 중재 Potentiates

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues. 
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRP&#945; and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

정의 인간 공학 심장 조직의 건설 심장 세포 치료의 메커니즘을 연구하는

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in developmental cardiology have led to generating cardiac cells from pluripotent stem cells, it is unclear if the two cardiac fields - the first and second heart fields (FHF and SHF) &#8212; are induced in pluripotent stem cells systems. To address this, we generated a protocol for in vitro specification and isolation of heart field-specific cardiac progenitor cells. We used embryonic stem cells lines carrying Hcn4-GFP and Tbx1-Cre; Rosa-RFP reporters of the FHF and the SHF, respectively, and live cell immunostaining of the cell membrane protein Cxcr4, a SHF marker. With this approach, we generated progenitor cells which recapitulate the functional properties and transcriptome of their in vivo counterparts. Our protocol can be utilized to study early specification and segregation of the two heart fields and to generate chamber-specific cardiac cells for heart disease modelling. Since this is an in vitro organoid system, it may not provide precise anatomical information. However, this system overcomes the poor accessibility of gastrulation-stage embryos and can be upscaled for high-throughput screens.

The purpose of this method is to generate heart field-specific cardiac progenitor cells in vitro in order to study the progenitor cell specification and functional properties, and to generate chamber specific cardiac cells for heart disease modelling.

마우스 심장 필드 특정 심장 전구 세포의 시험관 내 생성

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

생물학

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

성적인 프로그램을 다시 만들에 의해 인간 배아 줄기 세포에서 Myospheres의 생성

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...