저자는 mammoplasty 사진을 제공하는 로잔 대학 병원의 M. 피시 감사, M. 워스와 실험 암 연구 스위스 연구소, 연구 분자 종양학의 경쟁력 국립 센터, 생명 과학 대학, 에콜 폴리 테크닉 대학 Fédérale 드의 A. Ayyanan 중요한 의견 맨체스터 대학의 기술 지원을위한 로잔 R. 클라크. 이러한 결과로 이어지는 연구는없는 보조금 계약에 따라 SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531817, 그리고 혁신적인 의약품 이니셔티브 공동 된 기업의 지원을 받고있다. 유럽​​ 연합 (EU)의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7 / 2007년부터 2013년까지)과 현물의 제약 산업 및 연관 기업의 유럽 연맹의 재정적 기여로 구성되어 자원이있는 115,188. 혁신적인 의약품 이니셔티브의 웹 주소는 <a href="http://www.imi.europa.eu/" target="_blank">http://www.imi.europa.eu/</a> . &lt;/ P&gt;

일반적인 고려 사항 : 시간의 앞서, 윤리 프로토콜을 설정은, 환자에 대한 설문 조사를 준비하고 임상 인력을 훈련하는 방법을 참조하십시오. 감소 mammoplasty 수술의 자료를 사용하기 전에 권한을 조달하고, 환자의 동의를 확인합니다. 조직은 전염성 따라 처리 될 필요가있다. 실험 암 연구 스위스 연구소 -이 프로토콜은 ISREC의 윤리위원회에 의해 승인되었다. 1. 조직 복구, 처리 및 바이오 뱅킹 바이오 뱅킹을위한 최적의 샘플의 품질을 향상시키기 위해, 다수의 단계는 실험실로 운반하기 전에 병원에서 실시된다. 병원에서 : <ol><li> 필요한 경우, 감소 mammoplasty 수술과 혈액 샘플에서 무균 조건 하에서 인간의 유방 조직을 얻습니다. 조직은 악성 병변의 존재를 배제하는 샘플 것 병리학 자에 의해 검토 될 필요가있다. </li><li> 유방 t 배치멸균 보드에 후드를 발행하고 가위, 수술 메스 이미 증기 멸균기로 멸균 집게를 준비합니다. 엽니 다 메스를 사용하여 유방 조직의 다른 사이트에 깊은 상처를 확인합니다. 인간의 유방 조직에서 노란색 지방 조직에 포함 된 덕트 및 소엽, 구성 흰색 가닥을 찾습니다. 참고 : 노란색 지방 조직에 흰색 실질의 비율은 여성에서 다르다; 일반적으로 젊은 여성은 더 상피 조직이있다. </li><li> 다음 가위로 지방 조직에서 부드럽게 구분, 흰색 소재의 조각을 들고 집게로 개최. 혈관을 복용하지 마십시오. </li><li> 인산염 완충 식염수 (PBS)의 pH 7.2에서 조직의 린스 조각 혈액을 제거합니다. 및 1 % (5,000 유닛 / ㎖ 페니실린 및 5,000g / ㎖ 스트렙토 마이신을 포함 함) 2 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 페놀 레드없이 F12 배지 (둘 베코 변형 이글 배지 F12)을 함유하는 250 ㎖의 플라스틱 병에 조직을 이동시켜tibiotic / 암포 테리 신 B는 (10,000 단위 / ml의 페니실린, 스트렙토 마이신 10,000 ㎍ / ml의 암포 테리 신 B 및 25 ㎍ / ㎖를 포함). 실험실에 전송을위한 매체에 보관 조직. </li><li> 감기 (드라이 아이스) 이소 펜탄과 크리오 바이알 (cryovial)에서 그들을 동결 RNA와 단백질 추출 및 플래시 5 mm 직경 - 3 개를 준비합니다. 실험실로 운송을 위해 드라이 아이스 상자로 전송합니다. </li><li> 금형에 5 mm이고 최적의 절단 온도 OCT ()의 층으로 그것을 커버하고 차가운 이소 펜탄 가득 상자의 평평한 바닥에 금형을 배치 - 3 조각을 넣어. 완전한 동결 후 드라이 아이스 박스 몰드 옮긴다. </li><li> 포름 알데히드에 파라 포름 알데히드에 5 mm 직경 (PFA) 4 %와 다른 5 개 (FA) 나중에 RT 조직 학적 분석에서 PBS에서 4 % - 3의 5 개를 수정합니다. 일부 항체 더 나은 하나 또는 두 가지의 서로 작업하는 두 개의 서로 다른 고정 제를 권장합니다. </li></ol> 실험실에서 : <ol start="8"><li> 수행감소 mammoplasty에 대한 모든 정보를 cument, 수술 및 샘플 여부 날짜는 오른쪽 가슴에 비해 왼쪽에서 파생됩니다. </li><li> -80 ° C에서 냉동 샘플을 놓고 고정의 2 시간 후 조직 학적 카세트에 고정 조직을 전송합니다. 그런 다음 4 ℃에서 O / N 저장을 위해, 에탄올 PBS 또는 70 % 중 하나를 넣어. 다음 날, 파라핀 삽입에 대한 조직학 시설 조직학 카세트를 전송할 수 있습니다. </li></ol> 2. 조직 소화 호르몬 자극 <ol><li> P2 세포 배양 공간에 층류 캐비닛에 조직 샘플을 함유하는 병을 전송. 살균 도마 (29 X 19cm)에 조직 조각을 놓습니다. 집게로 재료를 잡고 멀리 메스와 유방 실질 (흰 부분)에 남아있는 지방과 혈관을 긁어. 10cm 배양 접시에 PBS에 흰색 물질을 놓습니다. </li><li> 모든 조각으로부터 지방 물질을 제거하고 폐기 후에는 안전 규칙에 따라실험실들, 다시 도마에 상피 조직을 포함하는 흰색 부분을 배치합니다. 대향 메스를 사용하여 조직을 절단하고 최대 직경 2 ㎜의 조각으로 들어온다. </li><li> 적절한 크기의 튜브에 다진 재료를 놓고 : 1, 2.5 및 10 ml의 최대를 5, 15 또는 50 ㎖ 튜브에 각각. 일반적으로 5 ML 튜브 수익률 충분히 파라핀 매립 및 호르몬 자극에 대한 재료 및 형광 활성 셀에 대한 15 ML 튜브 수익률 충분한 재료 정렬 (FACS). 큰 튜브 분량 씩 냉동에 사용됩니다. </li><li> 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 암포 테리 신 B와 (페놀 레드없이 DMEM / F12) 매체로 구성된 소화 마스터 믹스를 준비하고 (클로스 트리 디움 histolyticum에서 Clostridiopeptidase A)을게나. 소화 시간에 따라 콜라겐 복용량. <ol><li> 12, 24, 36 및 인큐베이션 시간 동안, 1.5 ㎎ / ㎖, 1.0 ㎎ / ㎖ 및 0.5 mg을 최종 농도의 콜라게나 제를 사용 / ml로 각각. 4 번에 소화 마스터 믹스를 추가소화 물질의 부피는 적절한 교반 및 폭기을 보장합니다. 참고 : 실험 설계 및 호르몬 자극의 지속 시간에 따라,시 또는 효소 분해 단계 및 미세 복구 이후에 호르몬을 추가합니다. </li></ol></li><li> 샘플 및 제어 차량을 테스트하는 것이 바람직 호르몬 농도 (들)를 추가한다. 17-β 에스트라 디올 및 promegestone (R5020)과 자극 20nm의 최종 농도를 사용한다. 주 : R5020 매체 천연 황체 호르몬보다 더 안정한 합성 프로게스테론 수용체 작용제이다. <ol><li> 37 ° C, 40 RPM의 O / N에서 인큐베이터 내부의 롤러 믹서에 장소 튜브. 믹서에 샘플을 배치하기 전에, 모든 물질은 원심 분리기 튜브 함께 배포하도록 잘을 재현 탁. </li></ol></li><li> 소화 미만에서 12 시간의 자극 호르몬 회 적어도 12 시간 (O / N)를 취 같이, (미세 복구 후 호르몬을 추가 드3 단계에서 꼬리). 당신이 미세을 재현 탁하고 매우 낮은 부착 판에 서스펜션을 배치 할 호르몬을 추가합니다. 조직의 미세 구조는 약 70 %의 생존 능력을 보존 성장 인자가없는 배지에서 최대 7 일 동안 초저 부착 판에 유지 될 수있다. </li><li> RNA 및 단백질 분석을 위해 원심 분리기 튜브에서 5 분 플래시 동결에 대한 400 XG에서 원심 분리하여 조직의 미세 구조를 수집합니다. </li></ol> 조직 미세 3. 복구 <ol><li> 5 분 동안 400 XG에 튜브 (들)를 원심 분리기. 원심 관의 상부에서 지방 대기음 5 분 동안 1,250 XG에 새로운 원심 분리 튜브에서 원심 분리로, 섬유 아세포에 풍부한 수성 상등액 나머지의 상등액을 전송. 참고 : 유방 조직의 미세 이후의 모든 단계에 대한 매우 끈적으로 부드럽게 튜브를 교반하여 펠렛을 재현 탁. 피펫은 물질적 손실의 위험에 사용하지 않는 것이 좋습니다. </lI&gt; <li> 미세 및 PBS, 2 % 소 태아 혈청 (FCS) 수성 상등액 유래의 섬유 아세포를 펠릿 농후 재현 탁. 그 후 5 분 동안 1,250 XG에서 모두 튜브를 회전 한 후 상층 액을 버린다. </li><li> 3 펠릿을 재현 탁 - 5 ㎖의 혈액을 적혈구 용해 완충액을 깨끗한 튜브로 전송. 실온에서 5 분 동안 그들을 품어. </li><li> PBS, 2 % FCS의 2 배 용량을 추가하고 5 분 동안 1,250 XG에이를 원심 분리. 5 분 동안 1,250 XG에서 PBS, 2 % FCS와 원심 분리기와 펠렛을 씻으십시오. 두 번이 단계를 반복합니다. </li></ol> 유동 세포 계측법 4. 샘플 <ol><li> 펠렛 0.25 % 트립신 2 ml의 세포를 해리 1,000 μL의 pipetman으로 2 분 동안 매우 부드럽게 아래로 피펫 팅하여 혼합 - 1을 추가합니다. </li><li> 9 ml의 PBS, 2 % FCS를 첨가함으로써 트립신의 활성을 억제한다. 5 분 450 XG에 원심 분리기 10 ml의 PBS, 2 % FCS에서 펠렛을 재현 탁. </li><li> t에 배치 40 μm의 셀 스트레이너 상에 세포 현탁액을 전송50 ㎖ 원심 분리 튜브의 이익은 단일 셀을 제조 하였다. 세포 현탁액의 몇 마이크로 리터 필터의 상부에 남아 있으면, 피펫으로 스트레이너의 다른 측으로부터 흡입하여이를 그들 필터를 통과하고 그 미세 여과에 추가. </li><li> 다음 별도의 면역 세포, 항 CD45의 칵테일 마이크로에서 섬유 아 세포와 내피 세포, 안티 FAP 및 항 CD31 항체는 각각 10 내강과 기저 세포를 분리하는 팬 상피 마커는 EpCAM과 CD10에 따라, FACS로를 정렬 . </li></ol> 조직학 5. 샘플 <ol><li> 상술 한 바와 같이 기계적 및 효소 적 분해 물질을 세척 한 후, 실온에서 30 분 동안 PBS에서 4 % PFA 1 ㎖를 1.5 ㎖의 초기 물질로부터 펠릿을 고정한다. </li><li> 5 분 1,250 XG에 원심 분리기 1로 세척 - 두 번 2 ml의 PBS. </li><li> 10 분 동안 16,000 XG에 원심 분리기. 이 시간 동안 (트리스 - 아세테이트 - EDTA 아가로 오스 1 % 다목적을 준비이 TAE) 버퍼 용액을 비등 할 때까지 마이크로 웨이브 오븐에서 용액을 가열한다. <ol><li> 전자 레인지에서 솔루션을 제거하고 솔루션을 혼합하고 나머지 아가로 오스 입자를 재현 탁 부드럽게 플라스크를 소용돌이 친다. 50 ° C로 냉각 아가로 오스 솔루션 및 파라핀베이스 금형 1 ml에 부어 31 × 23 × 13.5 mm 크기. </li></ol></li><li> 뜨는을 취소하고 고화 층의 상단에있는 알약을 배치 - 평평한 끝이 주걱을 사용하여 아가로 오스 (1 ~ 3 mm)이다. 아가로 오스의 추가 계층 (40 ° C에서)를 모두 커버. </li><li> 아가로 오스 굳은 후, 일반적으로 5 분 이내에, 파라핀 매립에 대한 조직학 카세트에 아가로 오스 블록을 넣어. 아가로 오스 샘플 연필에 작은 글씨로 쓰여진 감소 mammoplasty 번호, 실험 조건 및 날짜에 대한 모든 정보와 카세트에 흰색 사무실 용지를 배치와 함께; 이 글을 쓰는 시점 이후의 모든 처리 단계를 견딥니다. </li><li> 에 카세트를 넣어PBS O / N, 4 ° C에서 주말에 저장을 위해 70 % 에탄올,에. 우리는 두 개의 스토리지 솔루션의 차이를 발견하지 않았습니다. 그런 다음 파라핀 삽입에 대한 조직학 시설에 조직학 카세트를 전송할 수 있습니다. </li></ol> 6. 냉동 미세 (미래 배양) <ol><li> 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)로 이루어진 배지 FCS 및 크리오 바이알 (cryovial)에 1 ml의 분취 액을 동결 동결 조직에서 재현 탁 미세. 얻어진 크리오 바이알 (cryovial)의 수는 감소 mammoplasty로부터 얻어진 기본 물질의 양에 의존한다. </li><li> -12 ℃로 온도를 감소, 12 ° C / 분의 속도 C ° -7 강온 5 분, 4 ° C에서 주거 다음 프로그램으로 조절 된 속도 냉동기를 이용하여 조직 미세 구조를 포함 크리오 바이알 (cryovial) 동결 6 ° C / 분, 10 분 주거의 속도, 6 ° C / 분의 속도로 -40 ℃로 온도를 감소와 -80 ° C에 온도 감소6 °의 C / 분의 속도. 그런 다음 C 냉동고 -80 °에 크리오 바이알 (cryovial)를 전송합니다. </li><li> 다음 날, 긴 저장을 위해 액체 질소 탱크에 -80 ° C에서 크리오 바이알 (cryovial)을 전송합니다. </li></ol>

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여기에 설명 된 생체 외 배양은 일반적으로 인간의 여성 유방 검색된 다른 세포 유형과 함께 그대로 덕트 및 소엽을 함유 유방 조직의 미세 구조를 제공한다. 일반적 환원 mammoplasties로부터 얻어진 인간 유방 조직의 처리에서는, 지방 조직, 간질 행렬의 기계적 및 효소 적 분해, 및 적혈구의 용해 제거 유관 단편과 단말 유관 소엽 단위 풍부. 우측 기간 동안 오른쪽 농도 부드러운 효소 소화, ?...

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Marie Shamseddin
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Marie Shamsheddin

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Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

유방암 돌연변이 프리 대한 정보는 빠른 속도로 증가하고있다. 덜주의 유방암 개발 영향 전신 요인에 지불되고있다. 생식 호르몬에 노출되면 질병의 진행 1-3에 큰 영향을 미친다. 그러나, 생식 호르몬은 인간의 가슴에 충돌하는 메커니즘을 제대로 이해하고있다. 유전자 조작 마우스 모델에 대한 작업은 여러 다운 스트림 이펙터 (4)를 통해 세포 고유 및 분비 신호를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 인간의 유방암에서 호르몬 작용에 대한 제한된 지식은 적절한 모델의 부족에 주로 기인한다. 에스트로겐 수용체 (ER) 및 프로게스테론 수용체 (PR)의 시그널링 메커니즘에 대한 대부분의 작업은 MCF-7 및 T47D와 같은 호르몬 수용체 양성 유방암 세포주, 수행되었다. 이러한 alrea했다 고급 유방암 환자에서 흉막 삼출에서 파생 된DY 여러 치료 (5)을 받았다. 인간의 유방의 단순한 체외 모델에서 연구 결과의 생물학적 관련성이 체외 모델에서 확인 된 의심과 대상 유전자 인 아르 동물 모델 (6)에서 식별 표적 유전자 다릅니다. 일차 인간 유방 상피 세포가 시험 관내에서 배양 할 때 그 호르몬 수용체 발현 따라서 호르몬 응답 7,8 잃어버린다. 이 문제는 리겔을 사용하여 정교한 3D 방식으로 circumventd 할 수 있습니다. 이러한 방식으로, C. 클라크와 동료 호르몬 수용체 발현을 유지 프로게스테론 자극 9 증식 반응을 보였다 유방 상피 세포를 확립에 성공했다. 그러나, 생체 프로게스테론 수용체 표적 유전자의 두 개의 중요한,이 Wnt-4 및 RANKL이 시스템 9 프로게스테론 자극에 유도되지 않았다. 이러한 접근 방식은 최근 시험관을 더욱 찍은 </EM&gt; 호르몬 전처리 및 RANKL 유도 10을 달성했다. 주의해야 할 점은, 리겔이 배치 의존하는 활동을 가지고 유지 비용이, 단지 작은 세포 수에 대한 쉬운 실험 설계를 요구한다. 생체 ER 및 PR 시그널링에서 주로 분비 작용 11에 의해 매개된다는 발견을 기초로, 우리는 세포 간 상호 작용이 유지 될 필요가 있다고 주장했다. 조직 손실되는 또 다른 중요한 요소는 체외 배양 한 세포 외 매트릭스와 상피 세포의 상호 작용이 해리; 아직 이러한 상피 분화에 중요한 자신의 중단은 종양 12에서 중요하다. 이를 염두에두고, 우리는 신선한 외과 폐기 물질 (13)로부터 유방 조직 미세 구조를 분리하는 방법을 확립. 내부 내강 및 외부 myoepitheli과 2 층 상피로 이루어진 유방 실질,알 세포는 지방 조직에서 절개하여 효소 및 기계적 해리를 실시한다. 세척 및 원심 분리 후, 우유 덕트의 조각이 많은 기질 세포와의 긴밀한 상호 작용을 유지하는 것을 얻을 수있다. 이러한 조직의 미세 구조는 반응 호르몬 남아있다. 이 모델은 임상 검체 (13)에서 확인되었다. 이와 같이 본 절차는 생물학적 및 임상 적 상황에서 유방 호르몬 작용을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Microlitre Centrifuge</td><td>Heraeus Biofuge Fresco</td><td>75005521</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5810 000.327</td><td></td></tr><tr><td>Cryobox</td><td>Nalgene&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Controlled Rate Freezer EF600 Grant</td><td>Asymptote&amp;nbsp;</td><td>EF600</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Hera Cell Heraeus</td><td>51022391</td><td></td></tr><tr><td>Roller Mixer SRT9D</td><td>Sturt</td><td>SRT9D</td><td></td></tr><tr><td>Histology Cassettes</td><td>Medizintechnik</td><td>81-0021-00</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Strile Surgical Blade&amp;nbsp;</td><td>Aesculap</td><td>BB536&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Aesculap</td><td>BB084R</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Aesculap</td><td>BD047R</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Aesculap</td><td>BC374R</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin base mold</td><td>SAKURA</td><td>4166</td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix</td><td>Thermoscientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic/Antimycotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F/12</td><td>Life Technologies</td><td>11039-021</td><td>Prewarm (37 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Roche</td><td>11 088 793 001</td><td>Prewarm (37 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10270</td><td>Can be replaced with Fetal Calf Serum</td></tr><tr><td>Cell Blood Lysis Buffer</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Roth</td><td>335</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1009831000</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic vials (5.0 ml)</td><td>VWR, International</td><td>479-0820</td><td></td></tr><tr><td>Ultra low attachment culture dish</td><td>Corning, NY 14831</td><td>3471</td><td></td></tr></tbody></table>

an ex vivo model to study hormone action in the human breast

인간의 유방암에서 호르몬 작용의 연구는 적절한 모델 시스템의 부족에 의해 방해되었다. 체외 배양시, 일차 유방 상피 세포는 호르몬 수용체 발현을 잃어버린다. 널리 사용되는 호르몬 수용체 양성 유방암 세포주는 생체 내 상황에 한정 관련이있다. 여기서 우리는 인간의 유방암에서 호르몬 작용을 연구하는 생체 모델을 설명합니다. 이러한 환원 mammoplasties mammectomies 같은 수술 또는 폐기 물질로부터 신선한 인간 유방 조직 표본 기계적 및 효소 적 덕트 및 소엽 복수 간질 세포 유형을 함유 조직편을 수득 소화된다. 성장 인자없이 기본 배지에서 유지 이러한 미세 조직은 세포 간 접촉, 조직 구조를 보존하고, 며칠 동안 반응 호르몬 남아있다. 그들은 쉽게 RNA 및 단백질 추출, 조직 학적 분석을 위해 처리 또는 중간 동결에 저장됩니다. 형광활성화 된 세포 분류 (FACS)는 특정 세포 집단을 위해 농축하는데 사용될 수있다. 이 프로토콜은 매우 복잡, 다양한 인간의 표본과 번역 연구에 대한 간단한 표준 접근 방식을 제공합니다.

에스트로겐과 프로게스테론의 역할을 연구하기 위해 더 나은 인간의 가슴에 자신의 분자 기능을 이해하기 위해, 우리는 그들의 동의를 얻은 후 감소 mammoplasties (그림 1)을받은 환자에서 신선한 인간의 유방 조직 표본을 수집합니다. 또한 환자의 의료 이력 및 생식뿐만 아니라 수술시의 혈청 프로게스테론 수준을 결정하기 위해 혈액 샘플을 얻었다. 신선한 감소 mammoplasties에서 조직 기...

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An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

우리는 인간의 유방암에서 호르몬 작용을 연구하기위한 새로운 생체 모델을 개발했다. 이 조직 구조, 세포 간 상호 작용 및 분비 신호를 보존 수술 유방 조직 표본으로부터 분리 미세 조직에 기초한다.

<em&gt; 생체 내</em&gt; 모델은 인간의 유방암에서 호르몬 행동을 연구하기 위해

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

11.4K 조회수.  Ecole polytechnique fédérale de Lausanne.  우리는 인간의 유방암에서 호르몬 작용을 연구하기위한 새로운 생체 모델을 개발했다. 이 조직 구조, 세포 간 상호 작용 및 분비 신호를 보존 수술 유방 조직 표본으로부터 분리 미세 조직에 기초한다. 

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Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

Orthotopic 쥐 유 방 지방 패드 유방암 세포의 주입

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

연구

암 연구학

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. Immortalized cell lines are easy to grow and genetically modify to study molecular mechanisms, yet the selective pressure from cell culture often leads to genetic and epigenetic alterations over time. Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully recapitulate the heterogeneity and drug response of human breast tumors. PDX models exhibit a relatively short latency after orthotopic transplantation that facilitates the investigation of breast tumor biology and drug response. The transplantable genetically engineered mouse models allow the study of breast tumor immunity. The current protocol describes the method to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad followed by drug treatments. These preclinical models provide valuable approaches to investigate breast tumor biology, drug response, biomarker discovery and mechanisms of drug resistance.

Patient-derived xenograft (PDX) models and transplantable genetically engineered mouse models faithfully recapitulate human disease and are preferred models for basic and translational breast cancer research. Here, a method is described to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad to study tumor biology and evaluate drug response.

유방암을 위한 전임상 모형으로 유방 종양의 정형소 이식

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

세포 및 조직 샘플에서 인간 유방암 줄기 세포의 분리 및 기능 평가

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs fail clinical trials. Therefore, new models are needed to improve our understanding of the disease. The NIH Microphysiological Systems (MPS) program was developed to improve the clinical translation of basic science discoveries and promising new therapeutic strategies. Here we present a method for generating MPS for breast cancers (BC-MPS). This model adapts a previously described approach of culturing primary human white adipose tissue (WAT) by sandwiching WAT between adipose-derived stem cell sheets (ASC)s. Novel aspects of our BC-MPS include seeding BC cells into non-diseased human breast tissue (HBT) containing native extracellular matrix, mature adipocytes, resident fibroblasts, and immune cells; and sandwiching the BC-HBT admixture between HBT-derived ASC sheets. The resulting BC-MPS is stable in culture ex vivo for at least 14 days. This model system contains multiple elements of the microenvironment that influence BC including adipocytes, stromal cells, immune cells, and the extracellular matrix. Thus BC-MPS can be used to study the interactions between BC and its microenvironment. 
We demonstrate the advantages of our BC-MPS by studying two BC behaviors known to influence cancer progression and metastasis: 1) BC motility and 2) BC-HBT metabolic crosstalk. While BC motility has previously been demonstrated using intravital imaging, BC-MPS allows for high-resolution time-lapse imaging using fluorescence microscopy over several days. Furthermore, while metabolic crosstalk was previously demonstrated using BC cells and murine pre-adipocytes differentiated into immature adipocytes, our BC-MPS model is the first system to demonstrate this crosstalk between primary human mammary adipocytes and BC cells in vitro.

This protocol describes the construction of an in vitro microphysiological system for studying breast cancer using primary human breast tissue with off the shelf materials.

미생물 시스템을 사용하여 인간 유방 조직에서 유방암 모델링

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical outcomes. Preclinical mouse models of breast cancer brain metastatic (BCBM) growth are useful but are expensive, and it is difficult to track live cells and tumor cell invasion within the brain parenchyma. Presented here is a protocol for ex vivo brain slice cultures from xenografted mice containing intracranially injected breast cancer brain-seeking clonal sublines. MDA-MB-231BR luciferase tagged cells were injected intracranially into the brains of Nu/Nu female mice, and following tumor formation, the brains were isolated, sliced, and cultured ex vivo. The tumor slices were imaged to identify tumor cells expressing luciferase and monitor their proliferation and invasion in the brain parenchyma for up to 10 days. Further, the protocol describes the use of time-lapse microscopy to image the growth and invasive behavior of the tumor cells following treatment with ionizing radiation or chemotherapy. The response of tumor cells to treatments can be visualized by live-imaging microscopy, measuring bioluminescence intensity, and performing histology on the brain slice containing BCBM cells. Thus, this ex vivo slice model may be a useful platform for rapid testing of novel therapeutic agents alone or in combination with radiation to identify drugs personalized to target an individual patient&#39;s breast cancer brain metastatic growth within the brain microenvironment.

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

We introduce a protocol for measuring real-time drug and radiation response of breast cancer brain metastatic cells in an organotypic brain slice model. The methods provide a quantitative assay to investigate the therapeutic effects of various treatments on brain metastases from breast cancer in an ex vivo manner within the brain microenvironment interface.

유방암 뇌 전이성 종양 성장을 연구하고 표적으로 삼는 Ex Vivo 뇌 슬라이스 모델

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

유방암 연구를 위한 잠재적인 기능적인 시험관 내 모형으로 유방 상피 및 내피 세포 스페로이드

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.

We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.

인간의 유선 상피의 호르몬 응답 3D 문화 모델

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

생체공학

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

마우스의 유방 지방 패드에 유방암 세포의 소성 주입은 종양의 성장을 연구한다.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

의학

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both direct and rapid analysis of therapeutic sensitivity and resistance. However, recent evidence suggests that therapeutic response is not exclusive to the inherent molecular composition of cancer cells but rather is greatly influenced by the tumor cell microenvironment, a feature that cannot be recapitulated by traditional culturing methods. Even implementation of tumor xenografts, though providing a wealth of information on drug delivery/efficacy, cannot capture the tumor cell/microenvironment crosstalk (i.e., soluble factors) that occurs within human tumors and greatly impacts tumor response. To this extent, we have developed an ex vivo (fresh tissue sectioning) technique which allows for the direct assessment of treatment response for preclinical and clinical therapeutics development. This technique maintains tissue integrity and cellular architecture within the tumor cell/microenvironment context throughout treatment response providing a more precise means to assess drug efficacy.

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Established cancer cell lines and xenografts have been the mainstay of cancer research for the past several decades. However, recent evidence suggests that therapeutic response is greatly influenced by the tumor cell microenvironment. Therefore, we have developed an ex vivo analysis of primary tumor specimens for drug development purposes.

기본 종양 및 / 또는 전임상에 대한 관련 전이 및 치료제의 임상 개발의 전 생체 치료 응답

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little is known about breast cancer cell properties and behaviors within the native microenvironment of human bone tissue.We have developed approaches to track, quantify and modulate human breast cancer cells within the microenvironment of cultured human bone tissue fragments isolated from discarded femoral heads following total hip replacement surgeries. Using breast cancer cells engineered for luciferase and enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, we are able to reproducibly quantitate migration and proliferation patterns using bioluminescence imaging (BLI), track cell interactions within the bone fragments using fluorescence microscopy, and evaluate breast cells after colonization with flow cytometry. The key advantages of this model include: 1) a native, architecturally intact tissue microenvironment that includes relevant human cell types, and 2) direct access to the microenvironment, which facilitates rapid quantitative and qualitative monitoring and perturbation of breast and bone cell properties, behaviors and interactions. A primary limitation, at present, is the finite viability of the tissue fragments, which confines the window of study to short-term culture. Applications of the model system include studying the basic biology of&#160;breast cancer and other bone-seeking malignancies within the metastatic niche, and developing therapeutic strategies to effectively target breast cancer cells in bone tissues.

Protocols are described for studying breast cancer cell migration, proliferation and colonization in a human bone tissue explant model system.

배양 인간의 대퇴골 조직 외식하는 방법은 전이성 틈새의 유방암 세포 집락을 연구하기 위해

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

요약

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