Los autores agradecen enormemente Pierre Bourdoncle, Thomas Guilbert y Louise Rimbault del Fondo para el Cochin Imaging. Este trabajo fue apoyado por el INSERM, CNRS y la Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe labellisée).

1. Preparación de los linfocitos T <ol><li> Preparar ratón primaria o células T humanas como se describe 10,11. </li><li> Cultivar las células T humanas en medio completo RPMI con 10% de suero humano AB a una densidad de 2 - 3 x 10 6 células / ml. NOTA: El uso de suero de ternera fetal (FCS) en lugar de suero humano puede provocar la polarización espontánea de una gran fracción de células T humanas en cultivo. Mantener estas células en cultivo durante 4 - 5 días, y otro proceso en cualquier momento durante este período. </li><li> Mantener las células T de ratón en medio completo RPMI suplementado con 10% de FCS a una densidad celular similar. Utilice inmediatamente o al día siguiente, después de un cultivo O / N a 37 ° C en presencia de 10 ng / ml IL7. </li><li> Cultivar la línea celular T CEM humana en RPMI completo suplementado con 10% de FCS. </li></ol> 2. Estimulación de quimioquinas <ol><li> Lave 5 x 10 5 células por condición experimental en medio HBSS caliente suplementado con 10 mM Hepes. Para algunos experimentos, co-transfectar células T humanas primarias el día anterior con 2 g pmaxGFP y 8 g pcDNA3.1 + (vector vacío, control), PKCζ quinasa muerta, o plásmidos PAR6 N-terminales. </li><li> Resuspender el sedimento celular en medio cálido HBSS-Hepes (usar 0.3 ml x número de condiciones experimentales). </li><li> Distribuir las células en 1,5 ml tubos de microcentrífuga. NOTA: Por lo tanto, un tubo que corresponde a una sola condición experimental contendrá 5 x 10 5 células en 0,3 ml de medio HBSS-Hepes. Para algunos experimentos, añadir 500 nM latrunculina A o vehículo (DMSO) y se incuban las células durante 30 min antes de la estimulación de quimiocinas. </li><li> Añadir de 10 a 500 ng / ml o CCL19 de quimioquinas CXCL12 en cada tubo. NOTA: Utilizamos generalmente 10-200 quimiocina ng / ml para las células T humanas. CEM células no expresan el receptor CCR7 que une CCL19. Por lo tanto, las células CEM sólo serán capaces de responder a una estimulación CXCL12. Por otra parte, utilizar concentraciones más altas de quimioquinas (300-500 ng / ml) para polarizar las células T de ratón. </li><li> Voltear los tubos varias veces e incubar en un 37 ° C baño de agua durante 8 o 10 minutos para que las células T primarias o CEM, respectivamente. </li><li> Detener el proceso de polarización mediante la adición a cada tubo 0,3 ml de una solución caliente que contiene 2% de paraformaldehído (PFA) y Hepes 10 mM en PBS. Voltear los tubos y los incuban a 37 ° C durante 5 min. </li></ol> 3. Las tinciones <ol><li> Transferencia de las células de los tubos de microcentrífuga a citometría de flujo tubos. </li><li> Llenar completamente los tubos con una solución de RT que contiene 1% de albúmina de suero bovino (BSA), EDTA 0,5 mM y Hepes 10 mM en PBS. </li><li> Centrifugar los tubos a 460 g durante 4 min. </li><li> Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 100 l de una solución a TA que contiene 5% de FCS en PBS. </li><li> Añadir 5 l de FITC-anti-HLA-ABC en cada tubo, vórtice, y los incuban durante 30 min a RT, lejos de la luz. </li><li> Lavar las células una vez con PBS que contiene 5% de FCS, unand una vez con PBS solo. </li><li> En RT: añadir 500 l 1% PFA, incubar durante 10 min, a continuación, lavar las células con una solución que contiene 1% de BSA, EDTA 0,5 mM y HEPES 10 mM en PBS. </li><li> Descartar el sobrenadante, llenar los tubos completamente con una solución de PBS que contenía 0,2% de BSA, 0,1% de saponina, EDTA 0,5 mM y Hepes 10 mM (tampón de permeabilización). </li><li> Lavar las células dos veces en este medio. </li><li> Voltear los tubos para eliminar el medio y Vortex a disociar el sedimento celular. </li><li> Añadir 0,25 g / ml TRITC-faloidina y / o una dilución 1: 100 de anticuerpo anti-P-ERM a cada tubo, vórtice ellos y se incuba durante 30 min a TA. </li><li> Lavar las células con el tampón de permeabilización. Incubar con un anticuerpo secundario fluorescente si es necesario. </li><li> Resuspender las células en 200 l de PBS y transferirlas a tubos de microcentrífuga. NOTA: Las células están listas para la adquisición. Alternativamente, mientras se mantiene un volumen máximo total de 200 l por tubo, añadir concentrado PFA a una final 1%concentración con el fin de preservar las tinciones si las células no están para ser usados ​​el mismo día para su posterior procesamiento. </li></ol> 4. Las imágenes Adquisición y Análisis <ol><li> Encienda el aparato (véase la Tabla de específico Reactivos / Equipo) y se deja calibrar sí de acuerdo con las instrucciones del fabricante. NOTA: El software INSPIRE se utilizó con un objetivo de 40X (0,75 NA). El software IDEAS 3,0 se utilizó para todos los cuantificaciones reportados. </li><li> Preparar una serie de ventanas de adquisición que se pueden guardar en una plantilla para futuros experimentos. Dibuja histogramas que cuantifican los valores de gradiente de RMS. De la población &quot;In Focus&quot;, seleccionado en el RMS histograma gradiente, delimitar la población &quot;célula única&quot; en un histograma de la Zona. Una vez que el tubo de microcentrífuga se ha insertado en la máquina, ajustar la potencia del láser, la puerta en las células individuales y adquirir 5000 T linfocitos. </li><li> En las Ideas blandosware, abra el archivo de adquisición y crear un histograma que mostrará el valor del valor RMS gradiente de imágenes de campo claro (Canal 1) obtenida para cada célula individual. Dibuja una puerta en el histograma gradiente RMS que considera células que presentan RMS valor de gradiente anterior 57. NOTA: El gradiente de RMS permite tener en cuenta en el análisis sólo los linfocitos T que están en el plano focal. Hemos determinado empíricamente que las células individuales que presentan un valor de gradiente RMS superior a 57 están en el plano focal, y se pueden considerar con precisión. </li><li> En el menú Análisis / Máscaras, crear una nueva máscara, llamado Erode (M01,2) de la máscara de la morfología en las imágenes de campo claro M01, erosionadas de 2 píxeles. Luego, en el Análisis / menú Características, crear una nueva característica de la zona, calculado sobre la máscara Erode (M01,2). Desde las celdas seleccionadas en la puerta anterior, abra un histograma que muestra el Área de células usando esta máscara de nueva creación. La morfología de las máscaras que están disponibles por: NOTApor defecto son mucho más grandes que el tamaño real de la célula. Por lo tanto, es más preciso para erosionar que hasta 2 píxeles. </li><li> Dibuja una puerta en las células T individuales, con exclusión de las microesferas y escombros (pequeña área) y los dobletes (grandes Area). Ajuste esta puerta en cada adquisición. NOTA: Las variaciones en el tamaño de la celda afectará a la posición de la puerta. Como las células T de ratón son más pequeños que las células T humanas que son ellos mismos más pequeño que las células CEM, el área de cada tipo de célula será proporcional a su tamaño. </li><li> Teniendo en cuenta las células individuales, en foco que fueron cerrada en los pasos anteriores, abrir un gráfico de puntos que consiste en el Raw Max Pixel en la tinción de HLA-ABC (Canal 2, eje x) como una función de la Raw Max Pixel en la faloidina tinción (Canal 4, eje y). Crear una puerta para excluir los eventos fluorescentes sin teñir o saturados. Abra dos histogramas que muestran la cruda Max Pixel para HLA-ABC (Canal 2) y phalloidin (Canal 4) coloraciones. </li><li> En el Análisis / menú Máscaras, createa nueva máscara, llamado Erode (M02,2) de la máscara de la morfología de las células HLA-ABC manchados (Canal 2), erosionadas de 2 píxeles. Luego, en el Análisis / menú Características, crear una nueva característica que consiste en el parámetro de circularidad, calculado sobre la Erode (M02,2). NOTA: Este parámetro mide la desviación de la forma de la célula de un círculo. Por lo tanto, una célula T perfectamente redonda tendrá un valor alto circularidad mientras que las células polarizadas alargadas exhibirá un bajo índice de circularidad. </li><li> Posteriormente, crear otro histograma que reportar los valores de la función de circularidad de las células previamente cerradas. Utilice este histograma para trazar directamente la distribución de un individuo, población de células de enfoque de acuerdo con el valor de la circularidad para cada celda individual. </li><li> En cuanto a la forma del histograma para las células no estimuladas, dibujar una puerta para células polarizadas, a partir del valor circularidad más bajo hasta el valor límite de la circularidad donde la mayoría de las células no estimuladasse trazan. Mire la pantalla de estadísticas para el porcentaje de células polarizadas entre la población cerrada (% Recinto). NOTA: Hemos establecido esta puerta para los valores de índice de circularidad siguientes 13. </li><li> Con el fin de mirar a la polarización de la tinción de actina en las células, trazar un histograma para el Detalle Bright valor de similitud R3, comparando la tinción de HLA-ABC (canal 2) y la tinción faloidina (Canal 4). NOTA: Cuanto más grande sea el valor de esta característica, el más superpone las dos coloraciones son. </li><li> Usando la misma estrategia de gating como antes, trazar una puerta en las células no estimuladas para la tinción segregada que muestra el porcentaje de células con tinción de actina polarizada. </li><li> Cuando se haya completado, el porcentaje de células que muestran una segregación en la distribución de la MHC de clase I y tinciones con faloidina, el porcentaje de células polarizadas junto con los valores medios de los índices de la circularidad y la similitud de todas las células ± SD se muestran en la corresppaneles estadísticas onding. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Usando una tecnología reciente del flujo de imágenes citometría, una estrategia rápida e informativo gating para analizar los eventos celulares y moleculares inducidos por la estimulación de quimiocinas se presenta. De un solo experimento, se pueden obtener dos tipos principales de información: los cambios en la morfología celular inducida por la estimulación de quimioquinas y la distribución subcelular de proteínas diferentes durante el proceso de polarización. Curiosamente, también se proporciona evidencia...

Las quimioquinas son pequeñas proteínas solubles que atraen a las células a ubicaciones especializados 1. Por lo tanto, participan en la correcta posición de las células en los tejidos, una función crucial en el desarrollo y la fisiología. El sistema inmunológico no es una excepción a esta regla, ya que se basa en la acción de muchos tipos de células diferentes que actúan en concierto para montar una respuesta inmune efectiva. Mediante el control de la ubicación específica de un tipo de célula inmune en un estado dado, quimiocinas son pre-requerido antes de antígenos extraños pueden ser detectados y neutralizados. En los linfocitos T, en particular, las quimioquinas se unen a receptores específicos de la superficie que, tras el acoplamiento, provocan muchas señales intracelulares (altura de calcio, la fosforilación de ERK, la activación de Rho GTPasas, el aumento de las integrinas de afinidad y alteraciones del citoesqueleto) que favorecen la motilidad celular T 2,3. A nivel celular, se puede observar alteraciones morfológicas provocados a la estimulación de quimiocina.Estos cambios en las formas de células son especialmente dramática en las células T: células T en reposo tienen una morfología redonda de cordón cuando se viaja en el torrente sanguíneo. Sin embargo, la detección de la presencia de quimiocinas en sitios de inflamación o en la proximidad de los órganos linfoides se va a cambiar la forma de las células T que ahora adoptar una morfología típica de &quot;espejo de mano&quot; que consiste en una forma bipolar: un borde de ataque en la parte delantera y un borde de salida, o urópodo, en la parte posterior 4. Además, los componentes intracelulares pueden segregar en estas dos regiones opuestas de una célula T polarizada para sostener la migración. Por ejemplo, los filamentos de actina de polimerización aumenta tras la estimulación de quimiocina 5 y actina polimerizada se acumula en la parte delantera de una célula T polarizada 2. Por otro lado, varias proteínas, tales como proteínas fosforiladas de la Ezrin-radixina-Moesin (ERM) de la familia que unen la membrana plasmática a la cortical del citoesqueleto de actina F, re-localizar en el urópodo de polarizadoLas células T 6. Curiosamente, nosotros y otros han demostrado que se requiere este proceso de polarización para la migración de células T. De hecho, cualquier tratamiento que interfiere con polarización inhibir la motilidad celular. Por ejemplo, la inhibición de la actividad de los miembros de la proteína atípica quinasas C (PKC) de la familia, la polarización celular y PKCζ PKCι bloques de T y su proceso de escaneo migratorio de las células dendríticas 7. Polarización de las células T también está regulada por Rho GTPasas. Hemos demostrado que la modulación de la actividad de RhoA por la proteína Fam65b descrito recientemente interfiere con los cambios en la morfología de células T y su capacidad para migrar en un ensayo Transwell 6. Como la polarización es un paso requisito previo para la motilidad celular, por lo que es crucial para poder cuantificar como una lectura principal de las respuestas a quimiocinas. Alteraciones de la forma de la célula se midieron previamente manualmente 8. Sin embargo, este tipo de cuantificación es muy lento, de modo que por lo general sólo unos pocosdecenas de células se toman en cuenta. Aquí, un nuevo método se presenta para cuantificar rápidamente el grado de alteraciones de la forma de los linfocitos T expuestos a quimioquinas estimulación. Un flujo de imágenes citometría de la tecnología (véase la Tabla de reactivos específicos / Equipment) se utiliza, que combina las ventajas de un citómetro de flujo y un microscopio 9 para cuantificar de manera eficiente la cantidad de células polarizadas en diferentes condiciones de estimulación de quimioquinas. Además de la cuantificación de las alteraciones morfológicas que uno puede medir la firmeza con esta tecnología, también es posible evaluar los cambios en la localización subcelular de algunas proteínas sobre la señalización de quimiocinas.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Human serum AB</td><td>PAA</td><td>C11-021</td><td>Pre-heat to inactivate the complement.</td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3300</td><td>Pre-heat to inactivate the complement.</td></tr><tr><td>Human T cell nucleofactor kit</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Murine CCL19</td><td>Peprotech</td><td>250-27B</td><td>Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.</td></tr><tr><td>Human CCL19</td><td>Peprotech</td><td>300-29B</td><td>Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.</td></tr><tr><td>Human CXCL12</td><td>Peprotech</td><td>300-28A</td><td>Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells.</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8-100</td><td>This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Fluka</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>FITC-anti-HLA-ABC antibody</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1838</td><td>clone B9.12.1</td></tr><tr><td>Anti-P-ERM antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3149P</td><td></td></tr><tr><td>ImageStream&lt;sup&gt;x&lt;/sup&gt; Mark II</td><td>Amnis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rapid and robust analysis of cellular and molecular polarization induced by chemokine signaling

Las células responden a la estimulación de quimiocinas por la pérdida de su forma redonda en un proceso llamado polarización, y mediante la alteración de la localización subcelular de muchas proteínas. Las técnicas clásicas de imágenes se han utilizado para estudiar estos fenómenos. Sin embargo, se requiere la adquisición manual de de muchas células, seguido de tiempo cuantificación de la morfología y la co-localización de la tinción de decenas de células. Aquí, un método rápido y potente se describe para estudiar estos fenómenos en muestras compuestas por varios miles de células por medio de un flujo de imágenes citometría de tecnología que combina las ventajas de un microscopio con los de un citómetro. El uso de linfocitos T estimulados con CCL19 y tinción para las moléculas MHC de clase I y actina filamentosa, una estrategia gating se presenta para medir simultáneamente el grado de alteraciones de la forma y el grado de co-localización de los marcadores que se ven afectados por la señalización de CCL19. Por otra parte, esta estrategia gating nos permitió OBSERVe la segregación de actina filamentosa (en el frente) y fosforilados proteínas Ezrin-radixina-Moesin (fosfo-ERM) (en la parte trasera) en las células T polarizadas después CXCL12 estimulación. Esta técnica también es útil para observar el efecto de bloqueo en la polarización de dos elementos diferentes: la inhibición de la polimerización de la actina por un inhibidor farmacológico y expresión de mutantes de la / PKC atípicas vía de señalización Par6. De este modo, se muestra evidencia de que esta técnica es útil para analizar tanto las alteraciones morfológicas y redistribuciones de proteínas.

El primer ejemplo elegido aquí se refiere al uso de linfocitos T primarias humanas estimuladas con CCL19. Sin embargo, la misma estrategia se puede utilizar con las células T de ratón primario, líneas de células T o cualquier otro tipo de células sensibles a la estimulación de quimiocina. La estrategia gating que aquí se presenta incluye una serie de ventanas que se seleccionan los eventos enfocados, entonces las células individuales. Por último, la gama de intensidad de fluorescencia se sigue aquí como un ej...

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Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

Análisis rápido y robusto de Celular y Molecular Polarización Inducida por Chemokine Señalización

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

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Cell Polarization and Migration

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Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

Investigación de la polarización de macrófagos utilizando la médula ósea macrófagos derivados

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Investigación

Inmunología e Infección

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Sistema de Difusión de degradado para Investigar quimiotaxis en una matriz de colágeno 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Bioingeniería

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

Polidimetilsiloxano-policarbonato celular dispositivos de microfluidos para Estudios de Inmigración en virtud perpendicular Química y gradientes de oxígeno

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

Análisis 3D de las respuestas multicelulares a los degradados Quimioattractant

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Receptor de imagen acoplados a proteína G (GPCR) mediada por eventos de señalización que la quimiotaxis de control de Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Biología

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

La medición de la quimiotaxis celular con ECIS / taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

Evaluación de la migración de linfocitos en un sistema de transmigración ex Vivo

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Time-lapse Imaging of Mouse Macrophage Chemotaxis

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a chemical. Chemokinesis and chemotaxis are fundamental for the mobilization and deployment of immune cells. For example, chemokines (chemotactic cytokines) can rapidly recruit circulating neutrophils and monocytes to extravascular sites of inflammation. Chemoattractant receptors belong to the large family of G protein-coupled receptors. How chemoattractant (i.e., ligand) gradients direct cell migration via G protein-coupled receptor signaling is not yet fully understood. In the field of immunology, neutrophils are popular model cells for studying chemotaxis in vitro. Here we describe a real-time two-dimensional (2D) chemotaxis assay tailored for mouse resident macrophages, which have traditionally been more difficult to study. Macrophages move at a slow pace of ~1 &#181;m/min on a 2D surface and are less well suited for point-source migration assays (e.g., migration towards the tip of a micropipette filled with chemoattractant) than neutrophils or Dictyostelium discoideum, which move an order of magnitude faster. Widely used Transwell assays are useful for studying the chemotactic activity of different substances, but do not provide information on cell morphology, velocity, or chemotactic navigation. Here we describe a time-lapse microscopy-based macrophage chemotaxis assay that allows quantification of cell velocity and chemotactic efficiency and provides a platform to delineate the transducers, signal pathways, and effectors of chemotaxis.

Here we describe methods using time-lapse, phase-contrast microscopy to image mouse resident peritoneal macrophages in a chemotactic complement C5a gradient. The protocols can be extended to other immune cells.

Imágenes de lapso de tiempo de Macrófago de ratón Chemotaxis

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Imaging G acoplados a proteínas mediada por el receptor de quimiotaxis y sus eventos de señalización en células HL60 neutrófilos como

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Evaluación de Dictyostelium discoideum respuesta a estimulación mecánica aguda

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...