Name: polydimethylsiloxane-polycarbonate microfluidic devices for cell migration studies under perpendicular chemical and oxygen gradients
Uploaded: 2017-02-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
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This paper is based on work supported by the National Health Research Institutes (NHRI) in Taiwan under the Innovative Research Grant (IRG) (EX105-10523EI), the Taiwan Ministry of Science and Technology (MOST 103-2221-E-001-001-MY2, 104-2221-E-001-015-MY3, 105-2221-E-001-002-MY2), the Academia Sinica Thematic Project (AS-105-TP-A06), and the Research Program in Nanoscience and Nanotechnology. The authors would like to thank Ms. Rachel A. Lucas for proofreading the manuscript.

미세 유체 장치 1. 제작 주 : 전체 미세 유동 장치는, 소프트 리소그래피 복제 성형 공정 (13)을 이용하여 제조된다. <ol><li> 미세 유동 장치에 PDMS 층 금형의 제작 <ol><li> 미세 유체 채널 패턴 시판 그림을 사용하거나 소프트웨어를 그리기를 디자인합니다. (14) 인쇄 고해상도 투명 마스크하는 회사에 파일을 제출한다. </li><li> 아세톤 (≥99.5 %), 이소 프로필 알코올 클린 실리콘 웨이퍼 (IPA; ≥99.9 %) 및 완충 산화물 에칭 (BOE 6 : 1 NH 4 F.HF). 탈 이온수 (DI) 물로 헹군 후 질소 총을 가진 웨이퍼를 탈수. </li><li> 네거티브 톤 포토 레지스트의 스핀 코트 대략 20g, SU-8 2050, 15 초 동안 500 rpm에서 웨이퍼 상에 다음 2,000 rpm으로 30 초 동안. 주 : 스핀 코팅 조건은 SU-8 2050 사진을 수득한다광학 리소그래피 이후에 약 75 ㎛의 웨이퍼의 두께의 레지스트 층. </li><li> 소프트 베이킹 65 ° C의 열판에 웨이퍼 3 분 후 9 분 동안 95 ° C에서. 소프트 베이크 후, UV 빛 아래 디자인 된 투명 마스크와 마스크 얼 라이너를 사용하여 웨이퍼를 노출; 총 노출 에너지는 약 300 엠제이 / cm 2이어야한다. 노광 후 베이크 (PEB) 65 ℃에서 웨이퍼를 2 분 후 7 분 동안 95 ° C에서. </li><li> PEB 후, 강한 교반 또는 초음파 목욕 7 분 (37 kHz와 180 W 효과적인 초음파 파워)에서 SU-8 개발자의 웨이퍼를 담가. 잔류 SU-8을 제거하기 위해 아세톤과 IPA와 웨이퍼를 씻어. </li><li> 웨이퍼 실란 100 ㎕를 배치 (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltrichlorosilane) 바람직하지 못한 결합을 방지하기 위해, 웨이퍼 표면에 실란 화하는 격막 진공 펌프에 연결된 건조기에서 6cm 직경 페트리 접시로. 15 분 동안 펌프를 켜고 끌및 30 분 동안, 진공 데시 케이 터로 밀봉. </li><li> 데시 케이 밖으로 실란 화 웨이퍼를 타고 다음 소프트 리소그래피 공정에 대한 15cm 직경 페트리 접시로 테이프 : </li></ol></li><li> 제조 및 PDMS 층 어셈블리 <ol><li> PDMS의 예비 중합체의 제조 <ol><li> 10에서 PDMS 단량체 (염기)와 경화제를 혼합 : 1의 비율 (V / V). 60 분 동안 데시 케이 터 설정의 혼합물을 탈기. </li></ol></li><li> PC에 내장 상부층의 제작 <ol><li> 상층 유체 채널 패턴을 가진 몰드 상에 PDMS 프리폴리머의 전송 2g는 PDMS의 얇은 층을 만드는. 60 분 동안 탈기에 PDMS를 데시 케이 터 설정에서 금형을 놓습니다. </li><li> PDMS 경화에 대한 60 ° C 오븐에서 금형 하룻밤을 놓습니다. 금형은 수평면에 있는지 확인합니다. </li><li> 실온으로 냉각 금형. 금형에 PDMS 사전 폴리머의 추가 13g을 붓고 일에 PDMS를 드가60 분 동안 전자 데시 케이 터 설정. </li><li> 천천히 가스 확산 장벽 신선한 PDMS 층으로 1mm 두께의 PC 필름을 포함; 필요한 경우 모든 거품을 추방. </li><li> 60 ° C 오븐에서 금형 하룻밤을 넣어, 그것은 수평면에 있는지 확인하십시오. </li><li> 실온 경화 PDMS 식혀. 모든 채널 패턴을 커버 할 수있는 약 5.5 X 5cm (2)의 면적에 메스 장치를 절단하고 주형에서 PDMS 슬래브 벗겨. </li><li> 2 mm의 직경 생검 펀치를 이용하여 입구와 출구를위한 구멍을 펀치. 멀리 나중에 조립 주변 먼지에서 제작 된 최고 PDMS-PC 계층을 저장합니다. </li></ol></li><li> 바닥 PDMS 층의 제조 <ol><li> 하부층 용 몰드 위에 PDMS의 예비 중합체 11g을 붓는다. 60 분 동안 탈기에 PDMS를 데시 케이 터에서 금형을 놓습니다. PDMS의 치료를 위해 60 ° C의 오븐에서 주형 밤새 유지. 이 수평면에 누워되어 있는지 확인합니다. </li><li> 일을 냉각실온 전자 PDMS. 모든 채널의 패턴을 포함하고, 금형의 해제를 벗겨 수 약 5.5 X 5cm (2)의 영역에 장치를 잘라. 멀리 나중에 조립 주변 먼지에서 제작 된 바닥 PDMS 층을 저장합니다. </li></ol></li><li> PDMS 막의 제조 <ol><li> 스핀 코트 대략 4 90 초 동안 100 rpm에서 실란 화 된 빈 웨이퍼 위에 PDMS 사전 폴리머의 g 후 4 초 동안 3,000 rpm으로. 오븐에서 밤새 60 ° C에서 스핀 코팅 웨이퍼를 굽는다. </li></ol></li><li> 장치의 조립 <ol><li> 제작 된 PDMS-PC의 상단 층과 접합면이 위를 향을 가진 O 2 플라즈마 표면 처리 기계에 스핀 코팅 PDMS 막과 웨이퍼를 놓습니다. 40 초 동안 O 2 플라즈마 (W) (90)와 PDMS 표면을 처리합니다. </li><li> 바로 O 2 플라즈마 표면 처리 후, PDMS 막 위에 상층 접합. 접합 층의 상단에 무게 (약 600 g)을 배치하고에 넣어결합을 촉진하기 위해 60 ° C 오븐에서 밤새. </li><li> 상온 접합 층을 냉각시키고 모든 채널 패턴을 커버 할 수있는 약 5.5 X 5cm (2)의 영역에 메스 최상층에 접착 막을 잘라. 실리콘 웨이퍼의 접합 구조를 박리 및 2mm 직경의 생검 펀치를 사용하여 화학적 구배 채널의 입구 및 출구에서의 펀치 구멍. </li><li> 40 초 동안 90 W에 플라즈마를 이용하여 PDMS 표면을 활성화하기 위해, 접합면이 위를 향하게 O 2 플라즈마 표면 처리 장치에있어서, 멤브레인 - 결합 된 상부층 및 제조 PDMS 바닥층을 놓는다. </li><li> 표면 처리 후 즉시 접착을 위해 함께 상단과 하단 레이어를 연결합니다. 전체 결합 장치의 상단에 무게 (약 600 g)을 넣고 오븐에서 밤새 60 ° C에 넣어. </li><li> 오븐에서 전체 제조 장치를 가지고 실온까지 냉각. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 미세 유체 세포 마이그레이션 분석 참고 :이 논문에서는 예로서 일반적으로 사용되는 세포주, adenocarcinomic 인간의 폐포 기저 상피 세포 (A549) 및 케모카인, 간질 세포 유래 인자 (SDF-1α)를 사용합니다. 다른 세포와 케모카인 작업 연구자를 들어, 그에 따라 실험 과정을 조정하십시오. <ol><li> 날 0 : 셀 준비 <ol><li> 배양 된 DMEM F12 L- 글루타민 대신 10 % (v / v)의 소 태아 혈청 (FBS), 1 % (v / v)의 antimicrob - 항진균제 용액을 포함하는 완전 성장 배지에 A549 세포의 재고. 0.25 % 트립신 EDTA와 분리하여 하위 문화. </li><li> 실온에서 3 분 동안 140 XG에 해리 세포를 원심 분리하여 실험에 대한 세포 현탁액을 준비합니다. 미세 유체 장치의 실험, 혈구를 사용하여 세포를 세어 전체 10 ㎖와 T75 플라스크에서 적어도 1 × 106 세포를 시드성장 배지. 주 : 모든 세포 배양 과정은 37 ℃ 및 5 % CO 2 인큐베이터 분위기에서 수행된다. </li></ol></li><li> 1 일 : 장치 준비 <ol><li> O 2 플라즈마 기계에 장치를 배치하고 미세 유체 채널이 친수성 표면 렌더링하는 데 40 초 90 W에서 O 2 플라즈마로 처리합니다. </li><li> 즉시 표면 처리 한 후, 직접 화학적 구배 채널 입구에 PDMS 층에 천공 2 mm 직경의 구멍에 바늘을 삽입하여 14 개의 G 무딘 바늘을 설치한다. 바늘이 미세 유체 채널을 차단하지 않도록해야합니다. 무딘 14 G 바늘로 1 ML의 주사기를 사용하여 DDH 2 O의 0.8 ml의립니다. 물 입구에서 두 바늘로부터 흘러 나올 때까지 출구에서 화학적 구배 채널에 DDH 2 O를 주입한다. </li><li> 둘 베코 &amp; #과 피브로넥틴의 주식을 희석하여 50 μg의 / ㎖ 피브로넥틴 액 1ml를 준비39;의 인산염 완충 식염수 (DPBS). </li><li> 용액이 입구에서 두 바늘로부터 흘러 나올 때까지 평활 14 G 바늘 1 mL를 주사기를 사용하여 화학적 구배 채널의 출구에서 피브로넥틴 용액을 주입. </li><li> 기존의 세포 배양 인큐베이터에서 전체 장치의 하룻밤을 품어. </li></ol></li><li> 주 2 : 세포 파종 및 현미경 영상 <ol><li> 셀 시드 <ol><li> 0 일 이후 배양 세포에서 매체를 기음과 DPBS 5 ml의 2 배와 세포를 씻는다. 상기 DPBS 대기음 트립신 EDTA 2 mL를 넣고 플라스크 표면으로부터 세포를 분리하기 위해 5 분 동안 배양기에서 세포를 배양한다. </li><li> 플라스크에 세포를 분리하고, 용액에 현탁 될 때까지 기다린 후 무 혈청 배지의 8 ml의 추가 (DMEM의 F12 + 1 % (v / v)의 antimicrob - 항진균제 용액). 15 ml의 원추형 튜브로 액체를 모두 전송하고, 실온 하에서 5 분 동안 140 XG 그것을 원심. </li&gt; <li> 원심 분리 후 상등액을 흡인하고, 최종 세포 밀도 1 × 106 세포 / mL로 무 혈청 배지를 적당량 추가한다. 혈구 또는 다른 자동 세포 계수 장비를 사용하여 세포를 계산 날 1 일에 제조 된 미세 유체 장치를 꺼냅니다. </li><li> 매체가 입구에서 두 바늘로부터 흘러 나올 때까지 평활 14 G 바늘 1 mL를 주사기를 사용하여 화학적 구배 채널의 출구에서 무 혈청 배지를 주입한다. 화학적 구배 채널의 출구에서 세포 현탁액 200 μl를 주입한다. </li><li> 세포를 미세 유체 채널에 도입 된 것을 확인하기 위해 현미경 장치에서의 세포 배양 챔버를 관찰한다. 습한 용기 (예 DDH 2 O 내부와 플라스틱 상자)에 기기를 배치되고 장치 표면에 세포의 접착을 촉진하기 위해 5 시간 동안 세포 배양 용 인큐베이터에 보관. </li></ol></li><li> reag의 준비화학 그라디언트 생성 엔트 <ol><li> 무 혈청 배지에서 원하는 농도 (100 NG / ㎖)에서 화학적 (SDF-1α)을 준비한다. 와 고순도 튜브에 연결된 두 개의 분리 된 3 ㎖ 주사기로 화학없이 무 혈청 배지를 그린다. 나중에 사용하기 위해 1 μL / 분의 유량 주사기 펌프의 주사기를 설정한다. </li></ol></li><li> 산소 구배 발생을위한 시약의 제조 <ol><li> 1 M NaOH 용액 15 mL 및 200 ㎎ / ㎖ 피로 갈롤 용액 15 ml를 확인합니다. 각각 고순도 PTFE 배관 및 고순도 튜브에 연결된 두 개의 별개의 15 mL의 주사기에 피로 갈롤의 NaOH 용액을 그린다. 나중에 사용하기 위해 5 μL / 분의 유량 주사기 펌프의 주사기를 설정한다. </li></ol></li><li> 미세 유체 장치 설치 <ol><li> 5 시간 배양 한 후, 전체 장치를 꺼내와 15cm 직경 페트리 접시에 놓습니다. 접착제 퍼티를 사용하여 배양 접시에서 장치를 고정한다. 전송할인큐베이터에서 라이브 세포 이미징 현미경에 페트리 접시. </li><li> 화학적 구배 채널의 유입구로 화학적 구배 생성 용 주사기에서 튜브를 연결한다. 폐기물 저장소에 이르는 튜브에 콘센트를 연결합니다. 화학 그라데이션 생성을위한 주사기와 주사기 펌프를 켭니다. </li><li> 산소 구배 채널의 입구로의 NaOH 및 피로 갈롤를 함유하는 주사기로부터 고순도 튜브를 연결한다. 폐기물을 수집하기 위해 콘센트에 튜브를 연결합니다. 산소 구배 생성을위한 주사기와 주사기 펌프를 켭니다. </li><li> 촉촉 장치를 유지하기 위해 페트리 접시에 DDH 2 O의 15 ML을 추가합니다. 시간이 경과 이미지 캡처를위한 라이브 세포 이미징 현미경을 설정하고, 이미지마다 15 분을. </li></ol></li></ol></li><li> 주 3 : 데이터 수집 및 분석 <ol><li> 컴퓨터에 캡쳐 된 이미지 파일을 전송. 오픈 소스 이미지를 사용하여 이미지를 분석alysis 소프트웨어, ImageJ에, 수동 추적을위한 오픈 소스 플러그인 (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) 무료 화성 도구 소프트웨어 (와 http://ibidi.com/xtproducts / EN / 소프트웨어 - 및 - 이미지 - 분석 / 수동 - 이미지 - 분석 / 화성 및 마이그레이션-도구) 15, 16. </li></ol></li></ol> 그래디언트 3. 특성 주 : 화학적 산소 구배 전 또는 세포 실험 후에 특성화 될 수있다. <ol><li> 화학적 구배의 수치 시뮬레이션 <ol><li> 전산 유체 역학 (CFD) 시뮬레이션을 사용하여 마이크로 유체의 층류 자연 추정된다. </li></ol></li><li> 산소 구배 실험 특성화 <ol><li> (5)의 농도는 산소에 민감한 형광 염료, 트리스 (2,2&#39;- 비 피리 딜) 루테늄 (III) 클로라이드 수화물 물 용액을 제조mg을 / ㎖. </li><li> 고순도 튜브에 연결된 두 개의 분리 된 3 ㎖ 주사기로 산소에 민감한 염료 용액을 그립니다. (화학 그라디언트 생성에 사용되는 흐름 속도와 동일) 1 μL / 분의 유량 주사기 펌프의 주사기를 설정한다. </li><li> 화학 그라데이션 채널의 입구에 주사기에서 튜브를 연결합니다. 폐기물 저장소에 이르는 튜브에 콘센트를 연결합니다. 화학 그라데이션 생성을위한 주사기와 주사기 펌프를 켭니다. </li><li> 470 ± 20 nm의 광학 필터를 통과 한 여기 광으로 반전 형광 현미경을 이용하여 형광 강도를 측정한다. 차가운 CCD 카메라를 사용하여 515 nm의 롱 패스 필터로 방출 발광 광을 수집한다. </li><li> 산소 구배 채널의 입구로의 NaOH 및 피로 갈롤를 함유하는 주사기로부터 고순도 튜브를 연결한다. 폐기물을 수집하기 위해 콘센트에 튜브를 연결합니다. 산소의 주사기와 주사기 펌프를 켜고그라데이션 세대. </li><li> 세포 배양 챔버에 유입되는 산소에 민감한 염료의 형광 이미지를 수집한다. </li><li> 산소 그라데이션 세대의 흐름을 중지하고 산소 생성 채널에 대한 모든 튜브를 분리합니다. 산소 구배 채널의 출구 가스 실린더로부터 고순도 튜브를 연결한다. </li><li> 산소 구배 채널에 연결된 호스로 공기, 순수 질소, 및 순수한 산소를 흐르게 할 때의 세포 배양 챔버에 유입되는 산소에 민감한 염료의 형광 이미지를 수집한다. </li><li> 참고 문헌 10, 11에 따른 스턴 Volmer 방정식을 사용하여 형광 이미지를 분석하여 산소 구배를 추정한다. </li></ol></li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

임베디드 PC 박막으로 PDMS를 미세 유체 소자를 제조하기위한 가장 중요한 단계는 다음과 같다 : PDMS-PC 최상부 층의 제조 (2) 확인하는 동안 PDMS로 예비 중합체를 PC 필름을 삽입 할 때 (1) 모든 거품 추방 프로세스를 경화 모든 PDMS는 잘 수평 수평면에서 수행됩니다. 세포 이동의 실험을 위해, 가장 중요한 단계는 : (1) 미세 유동 장치 내의 기포를 제거 실험 동안 튜브, 주사기 펌프; (2) 미세 유동 장치는 세포 이동의 관찰 생균 촬상 중에 잘 - 계층화 수평면 상에 배치되는 것을 보장; (3) 실험 동안 페트리 접시에 O DDH이 부가 물은 밖으로 건조되어 있지 않은지 확인하여 수분 유지 장치. 성공적으로 박리없이 PDMS-PC 하이브리드 미세 유체 소자를 제작하기 위해서는, PC 좋 동안 모든 기포를 제거하는 것이 중요필름 삽입. PC의 막을 천천히 PDMS 프리폴리머로 PC 필름의 삽입시 거품 발생을 방지하기 위해 (약 15 ~ 30도 정도 떨어진 PDMS 프리폴리머면)에서 비스듬히 삽입 될 수있다. 필요한 경우, 임베디드 PC 막을 전체 PDMS 예비 중합체 갇힌 기포를 배출하기 위해 10 분간 진공 펌프에 연결된 건조기에 배치 될 수있다. PC의 막을 진공 공정 후에 수레 경우 피펫 팁은 경화 된 PDMS 층 상 PC 필름을 눌러하는데 사용될 수있다. 필요한 경우 진공를 눌러 프로세스를 반복합니다. 세포 실험에 기포의 부족은 미세 세포 배양 중요하다. 공기 방울이 연결하기 (주사기 펌프, 튜브 및 미세 유체 장치를 포함) 전체 미세 유체 설정에 도입되어 있지 않은지 확인합니다. 기포 기인의 expe의 승온 하에서 기체의 용해도를 감소시키기 위해 마이크로 유체 설치 이내 경우배양기 내부 riments는 (피로 갈롤, 성장 배지를 포함하고, 수산화 나트륨) 및 시약 (주사기와 튜브를 포함한) 모든 실험 요소는 온도 변동을 최소화하기 위해 (적어도 20 분에는 사전에) 미리 인큐베이터에 배치 될 수있다 . 주사기들은 펌프 내부의 모터의 동작에서 발열 펌프. 인큐베이터 안에 주사기 펌프를 작동 일반적으로 허용; 그러나, 실험하는 동안 인큐베이터 온도를 확인 할. 온도는 실험시 이르게되면 추가적인 냉각 과정이 수행 될 필요가있다. 여러 가능한 냉각 방법은 예컨대, 인큐베이터에 얼음 상자를 배치 인큐베이터 내에 배치 주사기 펌프의 수를 줄이거 나 강제 냉각 장치를 인큐베이터를 사용으로 사용될 수있다. 본 연구에서 개발 된 PDMS-PC 미세 세포 배양 장치를 확실 FO 수직 화학적 산소 구배를 발생시킬R 세포 이동 연구. 현상 장치의 한계가 발생 산소 구배 프로파일은 장치를 통해 주위 환경으로부터 화학 반응 소기 구동 산소 유량, 산소 확산 사이의 균형에 의존하고, 상기 매체에 있다는 것이다. 그 결과, 산소 구배 프로파일은 임의적으로 장치 내부를 제어 할 수 없다. 기존 미세 세포 배양 플랫폼에 비해, 본 연구에서 개발 된 장치는 화학적 산소 구배의 조합에 따라 세포 배양 실험을 수행 할 수있는 첫 번째이다. 전체 장치는 지루한 정렬 및 고가의 장비없이, 종래 소프트 리소그래피 복제 성형 공정을 이용하여 제조 될 수있다. 기울기는 수치 시뮬레이션 및 실험적 시험 관내 세포 연구 이상의 생체 미세 형상의 조건을 제공하는 것을 특징으로 할 수있다. 가스 디으로서 PC 필름 공간적으로 한정된 화학 반응 법을 이용하여ffusion 장벽 산소 구배 가압 가스 실린더 정교한 가스 유량 제어 장치를 사용하지 않고 생성 될 수있다. 또한, 설치 화학 소량 (하루 미만 10 ㎖) 산소 구배를 유지하기 위해 필요하다. 산소 장력 제어는 마이크로 유체 관 주위에 국부적으로 한정되고, 대기 산소 농도를 방해하지 않기 때문에, 전체 설정 추가적인 온도, 습도없이 종래의 세포 배양 인큐베이터 내에 배치하고, CO 2 제어 계측 할 수있다. 그 결과, 발전 장치는 실질적 생물 실험실에서 사용하는 잠재력을 갖는다. 기술적 한계로, 산소 긴장에서 휴대 행동은 거의 기존 문헌 연구되지 않았다. 본 연구에서 개발 된 장치의 도움으로, 산소 구배 하에서 세포 배양을 크게 산소 구배 하에서 세포 연구를 촉진하는 용이 ​​한 방식으로 수행 될 수있다. 작고에hermore 유사한 동작 원리가 시험 관내 세포 배양 물 (17)을 연구를 들면 이산화탄소 및 질소 산화물과 같은 생리 학적으로 중요한 다른 기체 그라디언트를 생성하기 위해 적용될 수있다. 이러한 기능은 PDMS-PC 미세 유체 장치는 체외 세포 배양 연구에 진출, 약물 검사 및 세포 증식 및 마이그레이션 분석 등 다양한 세포 배양 응용 프로그램을위한 큰 잠재력을 보여주고 있음을 보여줍니다.

가용성 인자 및 산소 장력의 공간적 분포는 생체 1, 2, 3, 4에 중요한 세포 기능의 수를 조절할 수있다. 보다 세포에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 안정 화학적 산소 구배를 생성 할 수있는 시험 관내 세포 배양 플랫폼은 매우 바람직하다. 다양한 수용성 요소는 생물학적 활성에 중요한 역할을하고 세포의 행동에 영향을 미친다. 최근에 의한 미세 유체 기술의 발전에 안정적으로 생성하는 화학 증감 가능한 미세 유동 장치의 수는 세포 이동 5를 연구 개발되고있다. 또한, 여러 연구는 또한 시험 관내 세포 배양 6, 7, 8 산소 장력의 필요성을 밝혀냈다. 하나,세포 배양을위한 산소 장력의 제어는 주로 가압 가스 실린더와 산소 소거 또는 셀 창업 보육 센터에 대한 직접적인 화학 물질 첨가에 의존한다. 직접 화학 물질 첨가는 세포 배양 배지를 바꾸고 세포 반응에 영향을 미친다. 산소 제어 인큐베이터 인큐베이터 특수 설계, 정확한 가스 유량 제어, 저산소증 조건을 달성하기 위해 질소 가스의 큰 부피를 필요로한다. 또한, 다양한 산소 및 장력 구배 하에서 셀룰러 동작 연구를 지연시킨다,이 설정을 사용하여 산소의 공간 분포를 제어하기 불가능하다. 이러한 한계를 극복하기 위해 마이크로 유체 소자의 수는 세포 배양 애플리케이션 9 산소 구배를 생성하기 위하여 개발되었다. 그러나, 이들 대부분은 증발 및 버블 발생의 문제가 발생할 수 가압 된 가스를 사용하여 작동된다. 따라서, 그들은 종종 정교한 장비를 필요로하고 장기 세포 배양 STUDIE에 대한 신뢰할 수 없습니다에스. 과제를 극복하고, 상기 세포 이동에 대한 화학적 산소 구배 사이의 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 내장 된 폴리 카보네이트 (PC), 박막 (10), 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)로 이루어지는 미세 세포 배양 장치를 개발했다. 장치는 PDMS 막에 의해 분리 된 두 개의 미세 채널 층으로 구성된다. 상부층은 산소 구배 발생을위한 PDMS-PC 층이고; 바닥층은 화학적 구배 생성 및 세포 배양 PDMS로 만들어진다. 장치는 동시에 가스 실린더 정교한 유동 제어 시스템을 사용하지 않고 수직 화학적 산소 구배를 생성 할 수있다. 장치에서 PDMS 큰 광학 투명성, 가스 투과성 및 세포 배양 및 이미징을위한 생물학적 호환성을 제공합니다. 내장 된 PC 필름은 효율적인 산소 장력 제어하는 ​​가스 확산 배리어로서 기능한다. 미세 유체 채널에서는 채널 구불 구불 한 형상의 연속 사용의 화학 그라디언트를 생성합니다. 디자인은 크게 때문에 그것의 신뢰성과 쉽게 실험 장치에 다양한 애플리케이션을위한 마이크로 유체 장치에서 화학 그라디언트를 생성하는 데 이용되고있다. 또한, 화학적 구배 프로파일은 수치 시뮬레이션으로 미리 채널 형상을 변화시킴으로써 설계 할 수있다. 산소 구배의 생성을 위해, 우리는 이전 연구실 10, 11, 12에서 개발 된 공간적으로 한정된 화학 반응 법을 이용했다. 산소는 질소 퍼징없이 지정된 영역에서 청소할 수있다. 생물 실험실에서 실제 사용을 위해, 전체 실험 장치는 기존의 세포 배양 인큐베이터와 호환됩니다. 이러한 방법을 통합함으로써, 우리는 동시에 세포의 이동을 연구하기 위해 대량 가스 실린더와 정교한 장비없이 안정적인 화학적 산소 그라디언트를 생성 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1 ml Syringe</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>302104</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge Tube</td><td>Smartgene</td><td>6011-000</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Syringe</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>302151</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Centrifuge Tube</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>Falcon 352096</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Petri dish</td><td>Dogger Science</td><td>DP-43151</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltrichlorosilane</td><td>Alfa Aesar, Ward Hill, MA</td><td>78560-45-9</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Syringe</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>302118</td><td></td></tr><tr><td>4&#039;&#039; Silicon Dummy Wafer</td><td>Wollemi Technical, Taoyuan, Taiwan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan</td><td>AH3102-000000-72EC</td><td></td></tr><tr><td>AG Double Expose Mask Aligner</td><td>M&amp;amp;R Nano Technology, Taoyuan, Taiwan</td><td>AG500-4D-D-V-S-H</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimyotic solution</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>GIBCO 15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy punch</td><td>Miltex, Plainsboro, NJ</td><td>33-31</td><td></td></tr><tr><td>Blunt needle</td><td>JensenGlobal, Santa Barbara, CA</td><td>Gauge 14</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line Hemocytometer</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>Z359629</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>Buffered Oxide Etch</td><td>ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan</td><td>PH3101-000000-72EC</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Incubator</td><td>Caron, Marietta, OH</td><td>6016-1</td><td></td></tr><tr><td>COMSOL Multiphysics</td><td>COMSOL, Burlington, MA</td><td>Ver. 4.3b</td><td>for numerical simulation of chemical gradients in the device</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>GIBCO 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Desicattor</td><td>A-VAC Industries, Anaheim, CA</td><td>35.10001.01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12+GlutaMax-1</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>GIBCO 10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>GIBCO 10082</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin from Human Plasma</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Fluorescence Microscope</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>DMIL LED</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol (IPA)</td><td>ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan</td><td>CMOS112-00000-72EC</td><td></td></tr><tr><td>JuLi Smart Fluorescence Cell Imager</td><td>NanoEnTek, Seoul, Korea</td><td>DBJ01B</td><td></td></tr><tr><td>Mechanical Convention Oven</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>Lindberg Blue M MO1450C</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Showa Chemical Industry, Tokyo, Japan</td><td>1943-0150</td><td></td></tr><tr><td>Plasma tretment system</td><td>Nordson MARCH, Concord CA</td><td>PX-250</td><td>for oxygen plasma surface treatment</td></tr><tr><td>Polycarbonate (PC) film</td><td>Quantum Beam Technologies, Tainan Taiwan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polydimehtylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning, Midland, MI</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>Pyrogallol</td><td>Alfa Aesar, Ward Hill, MA</td><td>A13405</td><td></td></tr><tr><td>Removable Adhesive Putty</td><td>3M</td><td>860</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Mach 1.6R Tabletop Centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>ELS Technology, Hsinchu, Taiwan</td><td>ELS 306MA</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem, Westborough, MA</td><td>SU-8 2050</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Developer</td><td>MicroChem, Westborough, MA</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Surgical blade</td><td>Feather, Osaka, Japan</td><td>5005093</td><td>for PDMS cutting</td></tr><tr><td>Syringe Pump</td><td>Chemyx, Houston, TX</td><td>Fusion 400</td><td></td></tr><tr><td>T75 Cell Culture Flask</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>Nunc 156367</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>GIBCO 25200</td><td></td></tr><tr><td>Tygon PTFE Tubing</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH</td><td>621</td><td></td></tr></tbody></table>

polydimethylsiloxane-polycarbonate microfluidic devices for cell migration studies under perpendicular chemical and oxygen gradients

이 문서는 포함 된 폴리 카보네이트 (PC) 화학적 산소 그라디언트의 조합에 따라 세포 이동을 연구하는 박막 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)로 제조 된 미세 유체 소자를보고합니다. 모두 화학적 산소 그라디언트 크게 생체 내에서 세포의 이동에 영향을 미칠 수있다; 그러나, 기술적 제한으로 인해 거의 연구 시험 관내에서의 효과를 조사하기 위해 수행되었다. 본 연구에서 개발 된 장치는 원하는 화학적 구배를 생성하는 구불 구불 한 형상의 채널이 일련의 활용 및 산소 구배 발생을위한 공간적 한정 화학 반응 법을 이용한다. 화학적 산소 그라디언트의 방향은 간단 마이그레이션 결과 해석을 가능하게하는 서로 수직이다. 효율적 최소한 화학 소비 산소 구배를 생성하기 위하여, 내장 된 PC 박막 기체 확산 장벽으로서 이용된다. 개발 된 미세 유체 장치주사기 펌프에 의해 작동 및 설정 단순화 및 최적화 세포 배양 조건을 허용하는 세포 이동 실험 동안 종래의 세포 배양기에 배치 될 수있다. 세포 실험에서, 우리는 (간질 세포 유래 인자, SDF-1α)와 산소 구배 케모카인의 조합에 따라, adenocarcinomic 인간의 폐포 기저 상피 세포, A549의 마이그레이션을 연구하기 위해 장치를 사용했다. 실험 결과는 장치가 안정적으로 수직 케모카인 및 산소 구배를 생성 세포와 호환 할 수 있음을 보여준다. 마이그레이션 연구 결과는 산소 그라데이션 그라데이션의 조합이 하나의 그라디언트 미만에서 예측할 수 없습니다 아래 세포 이동을 유도에 중요한 역할 및 셀룰러 동작을 재생할 수 있음을 나타냅니다. 이 장치는 더 생체 -like microenvi 더 나은 세포 이동 연구를 홍보 할 수있는 세포 배양에 화학적 산소 그라디언트 사이의 상호 작용을 연구하는 연구자를위한 강력하고 실용적인 도구를 제공합니다경으로.

제조 PDMS-PC 하이브리드 미세 세포 배양 장치. 무화과. 하나는 사진과 미세 유체 장치의 그림을 보여줍니다. 바닥 층은 여섯 가지 혼합 비율이 두 개의 분리 된 입구에서 도입 시약의 솔루션을 생성하기 위해 구불 구불 한 모양의 채널 4 단계가 포함되어 있습니다. (왼쪽 : 오른쪽) 1 : 입구로부터 도입 두 용액 사이의 0, 4 : 1, 3 : 2, 2 : 3, 1 : 4, 0 이론적 여섯 가지의 혼합 비율은 1이다. 여섯 가지의 혼합 비율 솔루션으로 구성된 화학 그라디언트 하류에 위치하고, 세포 배양 챔버에서 생성 될 수있다. 상단과 하단 층은 PDMS 막에 의해 분리된다. 상단 층에 산소 소거 화학 반응을위한 시약은 두 개의 입구들로부터 미세 유체 채널에 도입된다. 시약은 즉시로 세포 배양 챔버의 상부에 유입되기 전에 반응 서로 혼합직접 화학 접촉없이 바닥 채널에서 산소를, 소기. PDMS에 비해 작은 기체 확산 계수 임베디드 PC 막은, 산소 소거 더 효율적 확산 장벽으로서 작용한다. 산소 서서히 유동 방향을 따라 산소 구배를 형성하기 위해 다운 스트림 영역에 PDMS를 통해 다시 세포 배양 챔버로 확산된다. 산소 소거 화학 반응을 공간적으로 한정되기 때문에, 로컬 산소 장력은 영향을 받는다. 결과적으로, 장치는 글로벌 산소 장력을 변화시키지 않고, 종래의 세포 배양기에서 이용 될 수있다. 이주 실험에서, 세포를 관찰하기위한 세포 배양 챔버 내부 시딩. 성장 배지, 화학 시약은 정확하게 제어 유량 주사기 펌프를 이용하여 장치에 도입된다. 화학적 산소 그라디언트의 특성은 장치 내부에서 발생. 때문에 t에그는 흐름 행동은 전산 유체 역학 (CFD) 시뮬레이션을 사용하여 예측 될 수있다, 마이크로 유체의 자연 흐름을 층류. 본 연구에서는 3 차원 모델을 구성하고, 시판중인 다중 물리 모델링 소프트웨어를 이용하여 시뮬레이션을 수행 하였다. 무화과. (2) (a) 형광 강도를 측정하고, 수치 시뮬레이션 결과에 기초하여, 세포 배양 챔버의 폭을 따라 실험적있어서 형광 농도 프로파일의 비교를 나타낸다. 실험 및 시뮬레이션 결과 사이의 계약은 CFD 모델이 아니라 장치 내부에서 발생하는 화학 그라디언트를 추정 할 수 있음을 시사한다. 무화과. (b) (2)는 세포 배양 챔버에서 발생 된 시뮬레이션 된 SDF-1α 구배를 나타내는. 무화과. 도 3은 세포 실험 전에 세포 배양 챔버 내부의 산소에 민감한 형광 염료를 흘려 산소 그라데이션 특성 결과를 나타낸다. 그 결과 산소 GRADI 것을 나타낸다약 1 내지 16 % 범위 ENT는 상기 프로토콜을 이용하여 확립 될 수있다. 세포 이동의 결과. 데모, 우리는 4 케모카인의 조합 (SDF-1α)와 산소 구배에서 A549 세포 이동의 연구를 수행 : (1) 더 케모카인 및 제어 등의 더 산소 그라디언트, (2) 케모카인 그라디언트와 산소 그라데이션없이, (3) 산소 구배 및 케모카인 그라데이션없이, (4) 케모카인 및 산소 구배 모두. 무화과. 4는 전체 실험 장치의 사진을 보여줍니다. 실험은 모두 그 안에 배치 (마이크로 유체 장치, 시린지 펌프 및 생균 촬상 현미경 포함) 전체에 설치와 종래의 세포 배양 인큐베이터에서 수행 하였다. 세포 이동의 결과를도에 나타내었다. 5. 무화과. 도 5 (a)는 생균 촬상 아나 이용한 실험에서 수집 된 영상을 보여준다lyzer 및도. 도 5의 (b)와 (c)는 플러그와 ImageJ에 소프트웨어에 의해 분석 네 조합 하에서 세포 이동 궤적 평균 움직임을 나타내는. 결과는 제어 평균 세포 이동 거리가 실험에서 세포의 임의의 이동을 시사하는 제로에 접근을 보여준다. 대조적으로, 단지 케모카인 그라데이션 세포의 평균 운동은 SDF-1α 농도가 높은 왼쪽 방향이다. 이 결과는 이전에보고 된 A549 세포의 SDF-1α 화성 동작을 제안한다. 산소 장력이 낮은 곳에서만 산소 그라디언트 실험에서, 세포의 평균 운동 위쪽이다. 더 흥미로운 것은 수직 케모카인 및 산소 그라디언트 실험에서, 세포의 평균 운동 위쪽 및 수평 방향의 움직임이 없는지 (케모카인 그라디언트 방향)하지 않고있다. 그림 1 : 조립식 PDMS-PC 미세 세포 배양 장치. (a) 세포 확실 이전 연구 직교 화학적 산소 구배를 생성 할 수있는 제조 장치의 실험 사진. 화학적 구배 채널은 세포 배양 챔버 내부 구배 발생을 입증하는 청색과 황색 식품 염료로 충전된다. 산소 구배 채널 적색 식품 염료로 충전된다. 스케일 바는 1cm입니다. (b) 미세 유체 장치의 개략도. 최상층은 세포 배양 챔버 내부 효율적인 산소 기울기 제어를위한 기체 확산 장벽 임베디드 PC 층 PDMS를 사용하여 제조된다. (c) 상부 및 하부 층의 제조를위한 마스터 몰드. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig1large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55292/55292fig2.jpg" /> 그림 2 : 미세 세포 배양 장치 내부의 화학 그라데이션. (a) 수치 시뮬레이션 및 실험적 세포 배양 챔버 (Y 방향)의 폭을 가로 질러 세포 배양 챔버 내부 형광 농도 구배를 특징으로한다. 시뮬레이션 및 실험적으로 측정 기울기 사이의 유사성은 시뮬레이션이 아니라 화학 구배를 예측할 수 있음을 나타냅니다. 도형 삽입 시뮬레이션을 위해 구성되는 3 차원 (3D) 모델을 도시한다. 세포 이동 시험을위한 세포 배양 챔버의 폭에 걸쳐 SDF-1α 케모카인 구배 (b) 수치 시뮬레이션 결과. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig2large.jpg" target="_blank">을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 더 큰 버전. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55292/55292fig3.jpg" /> 그림 3 : 미세 세포 배양 장치 내부의 산소 그라데이션. 실험적으로 유동 방향을 따라 세포 배양 챔버 내에 산소 구배를 측정 하였다. 기울기는 산소에 민감한 형광 염료 및 이미지 분석을 이용하여 추정 하였다. 기울기는 상기 챔버의 왼쪽에서 오른쪽으로, 특징, 결과는 챔버의 폭 일관성 구배 프로파일을 나타낸다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55292/55292fig4.jpg" /> 그림 4 : 실험 장치의 사진. 최적화를위한 미세 유체 장치, 시린지 펌프, 및 생균 촬상 현미경 포함한 전체 셋업은 종래의 세포 배양 인큐베이터 내에 배치되고실험시 세포 배양 조건. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55292/55292fig5.jpg" /> 그림 5 : 수직 SDF-1α와 산소 그라디언트에서 셀 마이그레이션 연구 결과. (a)는 이미지 전에 12 시간 세포 이동의 연구 후 촬영. 세포 이동 경로는 생균 촬상 현미경을 이용하여 촬영 된 시간이 경과 된 이미지에서 분석 될 수있다. (b)의 4 가지 그라데이션 조합에서 촬영 된 이미지에서 세포 이동 경로 및 분석 평균 이동 운동 : 아니 그라디언트 만 케모카인 그라디언트 만 산소 그라데이션, 두 케모카인과 산소 그라디언트. 이미지는 매 15 분을 붙 잡았다. 스케일 바는 250 μm의입니다. 수직 (산소 구배) 평균 세포 이동의 거리 (c) 플롯과 수평 (케모카인 구배) 네 개의 다른 경사 아래 방향의 조합. 데이터는 세 개의 독립적 실험 세트에서 얻은 평균 ± SD로 표시되고, 셀 (10)은 각 실험에서 분석 하였다. 통계적 유의 한 차이 (짝 스튜던트 t 검정, p &lt;0.01)의 결과는 다른 문자 (a 및 b)에 의해 지정된다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

셀 마이그레이션 연구에서 수직 화학 산소 그라디언트에 대한 폴리 디메틸 실록산 - 폴리 카보네이트 미세 유체 장치

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

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Bioengineering

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A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

세포 행동 유학을위한 그루브 패턴 Microfluidic 장치

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

연구

생물학

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

세포 생물학을위한 그라디언트 생성 Microfluidic 장치

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

생체공학

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

미세 채널에서 세포의 이동에 관한 연구

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

미세 유체 기술은 셀 변형능을 검사 할

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other physical or chemical stimuli. They have been commonly used for in vitro cell studies by providing in vivo like surroundings. Especially, how cells response to chemical gradients, electrical fields, and shear stresses has drawn many interests since these phenomena are important in understanding cellular properties and functions. These microfluidic chips can be made of glass substrates, silicon wafers, polydimethylsiloxane (PDMS) polymers, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, or polyethyleneterephthalate (PET) substrates. Out of these materials, PMMA substrates are cheap and can be easily processed using laser ablation and writing. Although a few microfluidic devices have been designed and fabricated for generating multiple, coexisting chemical and electrical stimuli, none of them was considered efficient enough in reducing experimental repeats, particular for screening purposes. In this report, we describe our design and fabrication of two PMMA-based microfluidic chips for investigating cellular responses, in the production of reactive oxygen species and the migration, under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli. The first chip generates five relative concentrations of 0, 1/8, 1/2, 7/8, and 1 in the culture regions, together with a shear stress gradient produced inside each of these areas. The second chip generates the same relative concentrations, but with five different electric field strengths created within each culture area. These devices not only provide cells with a precise, controllable micro-environment but also greatly increase the experimental throughput.

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

단일 또는 공존 화학 / 전기 / 전단 응력 자극에서 세포 응답 유학을위한 미세 유체 장치 설계

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

안정적인 농도 기울기에 박테리아 Chemotaxis을 Quantifying위한 Microfluidic 장치

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

화학 유인 그라데이션에 대 한 다중 세포 반응의 3D 분석

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

화학적 집단 이동을 위한 미세 유체와 통합된 견인 현미경 검사법

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

염증 중 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 미생리학적 시스템

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...