This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.

1 로그인 <ol><li> 생물 반응기를 전원을 켭니다. 로그인 페이지를 열려면 아무 곳이나 클릭합니다. 사용자 이름을 선택하고 암호를 입력하고 &quot;로그인&quot;을 클릭합니다. </li></ol> 2 교정 <ol><li> pH 센서 (이전 고압 증기 멸균에 2 점)를 보정합니다. </li><li> pH 센서를 점검하고 센서 팁 전해질 용액으로 가득합니다 확인합니다. pH 보정 솔루션 (전해질)의 pH 4, pH가 7 두 개의 비커를 준비하고 증류수로 사용할 수있는 세척​​ 병이있다. </li><li> pH 센서하여 pH 케이블을 연결합니다. 안녕하세요 인터페이스에서 &quot;작업&quot;탭으로 이동하여 &quot;교정&quot;을 클릭합니다. 교정 솔루션 온도 필드에 버퍼 온도를 입력합니다. </li><li> 버퍼 1 (산도 4)에서 pH 센서를 삽입하고 &quot;제로&quot;필드에 값을 입력합니다. 안정 그래프 기다린 &quot;교정 1&quot;버튼을 클릭합니다. 증류수 pH 센서를 헹군다. </li><li> 버퍼에 넣어 센서 2 (산도 7). 버퍼를 입력&quot;범위&quot;필드에이 값입니다. 안정이 버튼을 보정 클릭 그래프 기다립니다. </li><li> &quot;저장&quot;다음 &quot;닫기&quot;를 클릭합니다. </li><li> 용존 산소 (DO) 센서를 보정합니다. </li><li> DO 센서를 확인하는 몇 시간 동안 시스템에 연결 됨으로써 편광되었다. 안녕하세요 인터페이스에서 &quot;작업&quot;탭으로 이동하고 교정을 클릭합니다. &quot;금지&quot;버튼을 클릭합니다. </li><li> DO 센서를 분리하고 &quot;제로&quot;필드에 0을 입력합니다. 안정 &quot;교정 1&quot;버튼을 클릭하여 그래프를 기다립니다. </li><li> DO 센서를 다시 연결하고 &quot;스팬&quot;필드에 100을 입력합니다. 안정 &quot;보정이&quot;버튼을 클릭하여 그래프를 기다립니다. </li><li> &quot;저장&quot;다음 &quot;닫기&quot;를 클릭합니다. </li></ol> 3 압력솥​​ 및 설치 센서 및 시약 용기 <ol><li> autoc에서 보정, 위치 센서 및 열 아니라 후노예 파우치와 121 ° C, 15 PSI에서 30 분 동안 오토 클레이브. </li><li> 70 % 이소 프로필 알코올 (IPA) 및 생물 안전 캐비닛에 전송 파우치 (BSC)와 오토 클레이브 파우치를 소독합니다. 용기의 외부 포장을 제거합니다. </li><li> 70 % IPA와 내부 포장을 소독 및 생물 안전 캐비닛 (BSC)에 선박을 전송합니다. 내부 포장을 제거하고 운송 중에 입은 피해에 대한 용기와 튜브를 검사합니다. </li><li> pH를 설치하고 두 개의 전면 포트에 센서를 않습니다. 다시 왼쪽 포트에 열을 잘 설치합니다. 센서 캡을 엽니 다. </li><li> 센서 포트를 통해 상기 센서 가이드. 포트에 단단히 센서를 끼 웁니다. </li><li> BSC에서 선박을 전송합니다. </li><li> 선박 슬리브 외부 DO 및 pH 센서 케이블을 끊고 아무것도 슬리브 없음을 확인합니다. 첫째, 소매에 발을 선박을 밀어 넣습니다. </li><li> 조심스럽게 용기 열 잘에 온도 센서를 장착한다. 용기의 바닥은 히터에 맞춰져 있는지 확인합니다. </li><li> 제거튜브는 자신의 가방에서 설정합니다. 생물 반응기 제어 장치의 해당 커넥터와 펌프로 튜브에 일치 색상 코드. </li><li> 그 가스 배출구에 커넥터를 눌러 메인 가스 라인을 설치한다. 가스 배출구에 커넥터를 시계 방향으로 꼬아 서, 마이크로 가스 라인을 설치한다. 배기 필터 튜브를 설치합니다 : </li><li> 필터 오븐을 엽니 다. 그 튜브 필터와 오븐이 고리를 통과하도록 U-채널의 배기 필터를 고정합니다. </li><li> 튜브 홀더에 콘덴서 가방에 의해 튜브를 설치합니다. 문을 닫습니다. </li><li> 다음 생물 반응기 제어부 행 부가 선 및 B 모두의 미디어 라인, 및 DO 센서 뒤에 벤치 위에 수확 라인. </li><li> DO 및 pH를 센서에 케이블을 연결합니다. </li></ol> (4) 추가 중간 및 마이크로 캐리어 <ol><li> &quot;작업&quot;탭으로 이동을 클릭 컴퓨터 인터페이스의 &quot;제어 펌프&quot;. </li><li> 스 테리 양식미사용 매체 첨가 라인 (오렌지 1 대역) 및 튜브 용접 또는 루어 피팅을 사용하여 배지 병 / 가방 소스와 르 연결. </li><li> 의 미디어 펌프를 켜 슬라이더를 클릭합니다. 미디어 매체의 또한 원하는 금액으로 꺼 펌프 설정하는 슬라이더를 클릭합니다. </li><li> 실온에서 3 시간 동안, 칼슘 Mg를 2 + 무료 PBS를 마이크로 캐리어 비즈를 놓습니다. </li><li> 워시는 칼슘, 마그네슘 2 + 무료 PBS로 여러 번 구슬. </li><li> 115 ° C, 15 PSI에서 15 분간 고압 증기 멸균한다. 참고 :이 실험에 3g의 /의 L (건조 중량)를 추가합니다. </li><li> 수화 및 세정 매체가 단계 4.1에 첨가 동일한 방식으로 반응기로 멸균 된 마이크로 캐리어에 펌프. </li></ol> 5 평형 및 원 포인트는 교정 DO <ol><li> 자동으로 컨트롤러를 설정하고 원하는 설정 값을 입력합니다. 여기에서, 교반 설정 값 (SP) = 15 RPM, 온도 SP를 = 사용 37.0 ° C, pH가 7.2 = 100 % 마십시오. 페이지 기다립니다arameters는 평형합니다. </li><li> 센서를 확인하는 것은 완전히 편광이다. DO 현재 가치를 확인하는 안정. </li><li> &quot;작업&quot;탭으로 이동하여 &quot;교정&quot;을 클릭합니다. &quot;원 포인트&quot;를 클릭 &quot;DO&quot;를 클릭합니다. </li><li> &quot;스팬&quot;필드에 &#39;백&#39;을 입력합니다. 을 클릭 &quot;저장&quot;과 &quot;주변&quot;을 클릭 &quot;교정 1&quot;버튼을 클릭합니다 : </li></ol> (6)는 실행을 시작 <ol><li> 작업 탭으로 이동합니다. &quot;일괄 처리&quot;를 클릭하십시오. 배치 이름 16 자 이하를 입력하려면 화면 키보드 나 외장 키보드를 사용합니다. </li><li> 온 스크린 키보드의 &#39;숨기기&#39;버튼을 클릭합니다. &quot;배치 시작&quot;오버레이의 &quot;시작&quot;을 클릭하여 확인을 클릭합니다. </li></ol> 7 세포에 접종 <ol><li> 용접에 의해 사용되지 않는 중간 부가 라인 (1 오렌지 밴드) 사이의 연결 및 멸균 셀 병 / 가방 소스를 형성루어 피팅을 사용하여 튜브 또는. </li><li> 펌프와 용기 사이의 튜브를 향해 화살표가 그래서 미디어 펌프 튜브의 실리콘 부분을 설치합니다. </li><li> 튜브 클램프를 확인하는 것은 개방과 분기 튜브 클램프가 닫힙니다. 의 미디어 펌프를 켜고 셀을 추가 한 후 &quot;Off&quot;로 클릭 슬라이더를 클릭합니다. </li><li> &quot;작업&quot;탭으로 이동하여 &quot;제어 펌프&quot;를 클릭합니다. </li></ol> 8 샘플링 <ol><li> 자주 배양을 모니터링하고 필요에 따라 접종 후, 다음과 같은 방식으로 배양 물로부터 시료를 그린다 </li><li> &quot;작업&quot;탭으로 이동하여 &quot;샘플을 채취&quot;를 클릭합니다. 샘플링 펌프 샘플링 튜브를 삽입하고 화면의 지시에 따라 샘플링 꼭지를 조작 할 수 있습니다. </li><li> 이러한 샘플에 적어도 매일 현미경 관찰 및 세포 수를 수행합니다. </li><li> 셀이 C에서 원하는 농도에 도달했으면1.2 × 106 세포 / ml ASE, 바이러스 접종 물을 첨가하여 세포를 감염시킨다. </li><li> 무균는 20 ㎖ 주사기로 접종을 추가하고, 반응기에 공급 부가 포트 중 하나에 연결 주사기. 주사기 플런저를 눌러 반응기로 접종을 소개합니다. </li><li> 샘플링을 계속 아데노 바이러스 세포 내 입자 농도에 대한 문화를 분석. </li></ol>

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	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications. , (2010).</li><li>Healthcare, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier+Cell+Culture+Principles+and+Methods.">Microcarrier Cell Culture Principles and Methods.</a> GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).</li><li>Simaria, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+cell+therapy+bioprocess+economics+and+optimization+Single-Use+cell+expansion+Technologies.">Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies.</a> Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).</li><li>Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+novel+pneumatic+mixing+for+single-use+bioreactor+application.">Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application.</a> BMC Proc. 5 (S8), O12 (2011).</li><li>Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactors+in+cell+culture-based+upstream+processing.">Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing.</a> BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).</li><li>Chaubard, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactors+for+viral+vaccine+production+challenges+and+opportunities.">Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities.</a> Biopharm Int Supp. , (2010).</li><li>Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+Effects+on+Animal+Cells+Grown+in+Microcarrier+Cultures.">Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures.</a> Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).</li><li>DePalma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-use+Equipment+on+Cusp+of+Industrialization.">Single-use Equipment on Cusp of Industrialization.</a> Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).</li><li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).</li><li>Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures. , (2012).</li></ol>

저자 D. 지로와 Y Hashimura이 문서에서 사용되는 시약 및 장비를 생산 PBS 바이오 테크의 직원입니다.

이 회용 바이오 리액터 시스템은 사용하기 비교적 간단하고 반응기 모니터링 및 분석을위한 실시간 분석을 제공한다. 그것은 매우 잘 천만명 이상의 세포 / ml에 도달 한 세포 밀도가 포유 동물과 곤충 세포 배양에 적합하다. A549 세포는이 보고서 11에 설명 외에, 우리는뿐만 아니라 생물 반응기에서 SF-9 곤충 세포를 성장했다. 공압 공기 휠이 제공하는 부드러운 혼합 세포 손상을 줄일 수 있습니다. 이 반응기를 설정할 때 몇 가지 단계가 중요하다. 첫째, 적절한 산도의 교정 및 센서는 문화의 최적의 모니터링 및 산도 또는 시스템의 산소를 조절 시약을 첨가 한 중요 않습니다. 둘째, 시약 및 종자 병이 채워지고 루어 첨부는 BSC로 무균 환경에서 이루어져야한다. 시약 병은 무균 환경에서 벗어나게되면, 생물 반응기 공급 라인의 연결은 미생물이 오염되지 않도록주의해야합니다. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt;이 생물 반응기 시스템이이 박테리아 배양을 위해 설계되지 포유 동물과 곤충 세포주 잘 작동하는 동안. 시스템은 세균 세포에 필요한 산소와 급속한 혼합을 제공 할 수 없다. 세균의 성장에 가장 교반 탱크 생물 반응기에서 수행됩니다. 포유 동물 또는 곤충 세포 배양에 대한 다른 일회용 바이오 리액터에 비해,이 시스템은 사용하기 쉽고 실행의 분석을 위해 충분한 데이터를 제공하고, 우리가 평가 한 다른 단일 사용 시스템보다 비슷하거나 더 나은 세포의 성장이 있습니다. 회용 바이오 리액터 공압 시스템은 세포를 연구 biotherapeutics, 백신의 임상 응용 분야에서의 여러 줄기를 충족 할 가능성, 및 개인화 된 약 4를 갖는다. 또한,이 시스템의 유연성은 배치, 회분, 관류 및 형질을 기반으로 생물 반응기 애플리케이션 다섯 수 있습니다. 마지막으로, 단일 사용 회용 바이오 리액터 시스템이 poten대규모 산업 생산의 요구를 충족하고, 가이드 라인과 국내 및 국제 규제 기관 6-10의 권장 사항을 준수 자유형.

현탁액에서 성장 세포 응집체로서 세포 성장 및 세포 기질에 고정 성장 : 포유류 세포 선은 그들의 성장 특성에 따라 세 개의 카테고리 중 하나로 분류 될 수있다. 이 비디오에서 보여준 공기 륜 생물 반응기는 세포의 세 가지 유형을 성장할 수 있지만,이 비디오는 마이크로 캐리어에 고정 장치 의존 세포를 성장하는 생물 반응기의 사용을 설명합니다. 세포 자체 산물 - 앵커리지 종속 포유류 세포보다 세포를 생산하기위한 목적으로 성장시킬 수있다. 예를 들어, 인간의 골수 유래 중간 엽 줄기 세포는 현재 세포를 수확하고 병든 조직으로 이들을 주입 목적으로 재배되고있다. 이 동영상에서 입증 공압 생물 반응기가이 애플리케이션에 대한 이러한 중간 엽 줄기 세포의 제조에 적합한 입증되었다 (세라 외., 개인 통신, 2013). 앵커리지 출발endent 포유 동물 세포는 일반적으로 그들이 특별하게 취급 성장 표면에 부착 한 세포 배양 접시, 세포 배양 플라스크, 또는 롤러 병으로 2D 배양 용기에서 작은 규모의 성장하고 있습니다. 이상의 셀이 요구되는 경우, 플레이트 또는 플라스크 개 이상의 용기를 사용하여 확장 될 수있다. 그러나,보다 비용 효율적인 앵커리지 의존적 세포의 대량 배양, 세포 부착을위한 표면적을 증가시키기 위해 마이크로 - 고체 담체라는 작은 비드를 사용하여 수행 할 수있다. 세포의 부착 특성에 따라, 마이크로 캐리어의 여러 다른 유형의 코팅 된 덱스 트란과 같은, 펩타이드, 콜라겐과 같은 시판 중이다. 마이크로 캐리어는 세포 성장을위한 큰 표면적을 제공 부피비 큰 표면적을 갖고; 및 마이크로 캐리어 세포 바이오 리액터 시스템이 높은 밀도로 배양 할 수 교반과 현탁액에서 유지 될 수있다. biorea의 현재 형식부착 세포는 마이크로 캐리어에 성장 ctors 셀 코팅 마이크로 캐리어들의 현탁액을 유지하기 위해 축 방향 임펠러를 사용하여 스피너 플라스크 및 교반되는 탱크 시스템을 포함한다. 여러 가지 요인 산소 장력, 전단 응력, 표면 행렬, 영양소 및 대사 산물 농도를 포함한 세포의 배양에 성공에 중요하다. 생물 반응기의 사용은 실시간 성장 조건의 모니터링 및 상당히 낮은 생산 비용 1 전위 허용한다. 를 포함하여 체외 세포 배양, 교반 서스펜션, 회전 벽 용기, 중공 섬유, 로커 플랫폼에서 가방 생물 반응기, 유동층 시스템 3에 대한 몇 가지 일반적인 생물 반응기 설계가 있습니다. 이들 시스템의 대부분은 높은 비용, 영양소 농도 기울기, 유체 역학적 전단력, 세포 응집 어려움 샘플링에서, 모니터링 및 제어 CEL 같이, 세포 배양을 위해 고유의 문제를 제시하고 - 최대 스케일리터 규모입니다. 다양한 점착성 세포주 바이러스 백신의 제조 또는 유전자 치료 응용을위한 바이러스 벡터의 제조 중, 바이러스의 생산에 사용된다. 이 비디오에서는, 단일 사용 공기 (에어 휠) 생물 반응기 시스템을 사용하여, 우리는 인간의 폐암 세포 (A549) 콜리 틱 아데노 바이러스의 생산을위한 마이크로 캐리어에 세포의 문화를 보여줍니다. 공압 생물 반응기 설계는 생물 반응기의 바닥으로 살포 기체의 부력에 의해 구동되는 수직 교반 휠을 사용한다. 이 부드러운 교반 방법은 유체 ​​역학적 전단력을 제한하지만 여전히 최적 배지 및 세포가 4를 혼합 보장한다. 교반 탱크 반응기에 비해, 공기 반응기 심지어 대용량 에어 휠 바이오 리액터 시스템 (도 1)와 낮은 벽 전단 응력을 갖는다. 교반 탱크 생물 반응기는 대조적으로,이 단일 사용 반응기의 수직 임펠러는 기포의 스트림 내에서 켜져부드럽고 균일 한 매체의 혼합 (그림 2)을 허용 용기.

<table><tbody><tr><td>PBS 3&amp;nbsp;</td><td>PBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single Use Assembly</td><td>PBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Lung Carcinoma Cells (A549)</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA, 0.25%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytodex 1 Microcarriers</td><td>GE</td><td>3781</td><td></td></tr><tr><td>Antifoam C</td><td>Sigma</td><td>A8011</td><td></td></tr></tbody></table>

cultivation of mammalian cells using a single-use pneumatic bioreactor system

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

그림 3에서 생물 반응기 실행의 개시에 대한 매개 변수가 표시됩니다. 이 그림은 온도, 용존 산소, pH와 교반의 매개 변수를 설정하기 전에 화면을 보여줍니다. 매개 변수가 설정되면, 실행 파라미터는 연속적으로 모니터링하고 조정이 필요한 상태를 유지하도록 할 수있다. 이 소프트웨어는 문제를 쉽게 식별 할 수있는 연속 판독 값을 생성합니다. DMEM은 10 % FBS, SAFC 안티 폼 C 250 PPM, 2mm의 L-글루타민 및 3g / 마이크로 캐리어들의 L을 함유하는 2.5 L를 이용하여 본 실험에서, 시스템은 매우 산소 퍼센트가 50 %, 인 안정 온도는 37 ° C이며, pH는 7.2이다. 반응기를 7 × 104 세포 / ml (또는 / 미세 담체 10 세포)의 농도에서 A549 세포를 접종한다. 이 실행을 위해 선택된 파라미터는 2 시간 (도 4) 내에 마이크로 캐리어에 부착 된 세포의 대다수되었습니다. 12 시간 후, 세포는 악마입니다(그림 5) 평탄화 및 마이크로 캐리어 표면에 확산 trating 표지판. 24 시간으로, 마이크로 캐리어 (그림 6) 세포없이 어떤 마이크로 사업자 및 마이크로 캐리어에 세포의 더 큰 덩어리와 세포의 비교적 고른 분포를 가지고있다. A549 세포에 의해 마이크로 캐리어 식민지의 비율은 24 시간 후 90 % (그림 7) 75 %이다. 세포는 48 시간 (그림 8) 후 ~ 1,000,000 세포 / ml로 기하 급수적으로 증가하는 것을 계속했다. 50 시간에 온 콜리 틱 아데노 바이러스 (2 × 10 8 비리 온 / ㎖)의 투여에 의해 감염 후, 밀도는 ML 1,200,000 세포 / 증가하고 용균 감염이 진행됨에 따라 감소하기 시작했다. 바이러스 접종 ~ 10,000 배 증폭이 있었다. 이전의 실험에서, 우리는 가스 흐름을 모니터링하고 조정하는 것은 세포의 성장 (게시되지 않은 데이터)를 극대화하는 데 중요한 것으로 나타났습니다. 빠르게 성장하는 세포는 산소 시스템을 고갈 수<html> 제로로 떨어지는 DO 수준입니다. 세포는 성장을 계속하지만, 훨씬 더 느린 속도로했다. 그것은 모니터링 및 대수 성장 단계에서 세포의 요구를 충족시키기 위해 산소 유량을 조정하는 것이 중요하다. 각각의 실행은 매일 세포 수와 산도, DO, 온도를 비교하여 최적의 성장을 분석 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig1highres.jpg" /> 다양한 원자로 볼륨에서 벽 전단력을 측정 교반기 탱크 생물 반응기에 비해 공압 생물 반응기 시스템 (PBS)의 그림 1 유체 역학. <img alt="그림이" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig2highres.jpg" /> 그림 2 공압 에어 휠 원자로 임펠러. <html> 52008 / 52008fig3highres.jpg &quot;/&gt; 생물 반응기의 실행을 시작하는 매개 변수의 3 공압 에어 휠 소프트웨어 스크린 샷 그림. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" /> A549 세포 2 시간 게시물 접종 그림 4 마이크로 캐리어 식민지. (평균 마이크로 캐리어 직경 ~ 180 μm의.) <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig5highres.jpg" /> 도 5에서 12 시간 배양 개시 후, A549 세포는 부착 평탄화 및 마이크로 캐리어 상으로 확산된다.5highres.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" /> 문화 24 시간 후 세포로 코팅 된 그림 6 마이크로 캐리어. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig7highres.jpg" /> A549 세포에 의해 마이크로 캐리어 식민지의 그림 7 비율 접종을 게시 할 수 있습니다. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig8highres.jpg" /> 도 8 adenovir 함께 예비 배양에서 생존 A549 세포의 수와 포스트 감염우리는. 바이러스 감염 단계는 50 시간에서 발생합니다.

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Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

단일 사용 공압 생물 반응기 시스템을 사용하여 포유 동물 세포의 배양

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

타악기 생물 반응기를 사용하여 생물 공학 기반 혈관의 이식

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

연구

생체공학

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

Perfused 마이크로 bioreactors의 칩 기반의 입체 세포 배양

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

생물학

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

마이크로 스케일 세포 자극 실험을위한 다목적 자동화 플랫폼

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

회전 타원체의 포유 동물 세포의 대규모 확장을위한 지속적인 공급함으로써 영양 규정

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

The functional behavior of cells in culture can be improved by culturing in more in vivo-like 3-dimensional culture environments16-21. This manuscript describes the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for in vivo-like mammalian tissue culture.

에 대한 중공의 생물 반응<em&gt; 생체</em&gt; -처럼 포유류 조직 문화

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

높은 처리량의 사용 모델 IgG1 조 세포에서의 생산을 위한 Microbioreactor 시스템 자동화

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain selection and by developing bioprocess parameters. Shake flasks have been used for this purpose. They, however, lack the capability to control the process parameters such as pH and dissolved oxygen (DO). This limitation can be overcome with the help of an automated micro-bioreactor. These bioreactors mimic cultivation at a larger scale. One of the major advantages of this system is the integration of the Design of Experiment (DOE) in the software. This integration enables establishing a design where multiple process parameters can be varied simultaneously. The critical process parameters and optimum bioprocess conditions can be analyzed within the software. The focus of the work presented here is to introduce the user to the steps involved in process design in the software and incorporation of the DOE within the cultivation run.

Here, we present a detailed procedure to run a Design of Experiment in an automated micro-bioreactor followed by cell harvest and protein quantification using a Protein A column.

중국 햄스터 난소 세포 재배에서 고처리량 자동화 마이크로 바이오리액터를 사용한 공정 최적화

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

용해 가능한 마이크로캐리어를 기반으로 한 부착 세포의 폐쇄 시스템 생산

Large-Scale Cell Production Based on GMP-Grade Dissolvable Porous Microcarriers

Researchers in the cell and gene therapy (CGT) industry have long faced a formidable challenge in the efficient and large-scale expansion of cells. To address the primary shortcomings of the two-dimensional (2D) planar culturing system, we innovatively developed an automated closed industrial scale cell production (ACISCP) platform based on a GMP-grade, dissolvable, and porous microcarrier for the 3D culture of adherent cells, including human mesenchymal stem/stromal cells (hMSCs), HEK293T cells, and Vero cells. To achieve large-scale expansion, a two-stage expansion was conducted with 5 L and 15 L stirred-tank bioreactors to yield 1.1 x 1010 hMSCs with an overall 128-fold expansion within 9 days. The cells were harvested by completely dissolving the microcarriers, concentrated, washed and formulated with a continuous-flow centrifuge-based cell processing system, and then aliquoted with a cell filling system. Compared with 2D planar culture, there are no significant differences in the quality of hMSCs harvested from 3D culture. We have also applied these dissolvable porous microcarriers to other popular cell types in the CGT sector; specifically, HEK293T cells and Vero cells have been cultivated to peak cell densities of 1.68 x 107 cells/mL and 1.08 x 107 cells/mL, respectively. This study provides a protocol for using a bioprocess engineering platform harnessing the characteristics of GMP-grade dissolvable microcarriers and advanced closed equipment to achieve the industrial-scale manufacturing of adherent cells.

저자 스포트라이트: Advancing Cell Therapy Manufacturing with Dissolvable Microcarriers 

Here, we present a protocol to achieve the large-scale manufacturing of adherent cells through a fully closed system based on GMP-grade dissolvable microcarriers. The cultivation of human mesenchymal stem cells, HEK293T cells, and Vero cells was validated and met both quantity demands and quality criteria for the cell and gene therapy industry.

GMP 등급의 용해성 다공성 마이크로캐리어를 기반으로 한 대규모 셀 생산

Researchers in the cell and gene therapy (CGT) industry have long faced a formidable challenge in the efficient and large-scale expansion of cells. To ...