This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.

1。ログイン<ol><li>バイオリアクターをパワーアップ。ログインページを開くには、任意の場所をクリックします。ユーザー名を選択し、パスワードを入力して「ログイン」をクリックします。 </li></ol> 2キャリブレーション<ol><li> pHセンサ（オートクレーブの前に2ポイント）を校正します。 </li><li> pHセンサを点検し、センサチップは電解液で満たされていることを確認します。 pH校正ソリューション（電解質）をpH4とpH7の二つのビーカーを用意し、蒸留水で使用可能な洗浄ボトルを持っています。 </li><li> pHセンサのpHケーブルを接続します。 Helloインタフェースの「アクション」タブに移動し、「キャリブレーション」をクリックします。キャリブレーション溶液の温度フィールドにおけるバッファの温度を入力します。 </li><li>バッファ1液（pH 4）中のpHセンサを配置し、「ゼロ」のフィールドに値を入力します。安定させ、「キャリブレーション1」ボタンをクリックし、グラフを待ちます。蒸留水でpHセンサーをすすぐ。 </li><li>バッファ2（pH7）にセンサを配置します。バッファを入力してください「スパン」フィールドに2の値。安定させ、2ボタンを校正クリックし、グラフを待ちます。 </li><li>クリックして &quot;閉じる&quot;をクリックして「保存」。 </li><li>溶存酸素（DO）センサーを校正します。 </li><li>確保DOセンサは、数時間のためにシステムに接続されることにより偏光されている。 Helloインタフェースの「アクション」タブに移動し、キャリブレーションをクリックします。 「DO」ボタンをクリックしてください。 </li><li> DOセンサーを外し、「ゼロ」フィールドに0を入力してください。安定させ、「校正1」ボタンをクリックし、グラフを待ちます。 </li><li> DOセンサーを再接続し、「スパン」フィールドに100と入力します。安定させ、「校正2」ボタンをクリックし、グラフを待ちます。 </li><li>クリックして &quot;閉じる&quot;をクリックして「保存」。 </li></ol>センサーおよび試薬容器を3オートクレーブしてからインストール<ol><li> AUTOC校正、場所センサおよびサーマルウェルの後溶岩パウチ及び121℃、15psiで30分間オートクレーブ。 </li><li>生物学的安全キャビネット（BSC）と70％イソプロピルアルコール（IPA）と転送パウチオートクレーブパウチを消毒。容器の外箱を取り出します。 </li><li> 70％IPAで内装を消毒し、生物学的安全キャビネット（BSC）の容器に移す。内装容器を取り出し、輸送中に与えた損害の容器と配管を点検します。 </li><li> pHをインストールし、2つのフロントポートにセンサーをDO。左バックポートにサーマルウェルをインストールします。センサーキャップを開きます。 </li><li>センサーポートを介してセンサガイド。ポートにしっかりとセンサーを通します。 </li><li> BSCの外容器に移す。 </li><li>容器のスリーブの外DOおよびpHセンサケーブルを掛け、何もスリーブになっていないことを確認してください。まず、スリーブに足を容器をスライドさせます。 </li><li>慎重に容器サーマルウェルに温度センサーを取り付けます。容器の底部ヒータに支えていることを確認してください。 </li><li>削除する彼らのバッグからチューブセット。バイオリアクターコントロールユニット上の対応するコネクタやポンプに配管のマッチングのカラーコーディング。 </li><li>そのガス出口にコネクタを押して、メインガスラインをインストールします。ガスコンセントにコネクターを時計回りにねじることによってマイクロガスラインをインストールします。排気フィルタチューブをインストールします。 </li><li>フィルタオーブンを開きます。そのチューブはフィルタにし、オーブンから2フックを通過するように、U-チャネル上で排気フィルタを固定します。 </li><li>チューブホルダーにコンデンサー袋でチューブを取り付けます。ドアを閉じます。 </li><li>次のバイオリアクター制御ユニットに経路追加ラインAとB、両方のメディア線、DOセンサーの背後にあるとベンチの上に採取ライン。 </li><li> DOおよびpHセンサにケーブルを接続します。 </li></ol> 4。中·マイクロキャリアを追加する<ol><li> 「アクション」タブに移動し、クリックしてコンピュータインタフェースの「コントロールポンプ」。 </li><li>殺菌フォーム未使用のメディア添加ライン（1オレンジバンド）とチューブを溶接するか、ルアーフィッティングを使用して、ミディ​​アムボトル/バッグ·ソースとの間の接続ル。 </li><li>上のメディアポンプをオンにスライダーをクリックしてください。メディアは培地の添加所望量後にオフポンプにするスライダをクリックしてください。 </li><li> RTで3時間、のCa 2 +のMg 2 +を含まないPBSをマイクロキャリアビーズを配置します。 </li><li>洗浄は、Ca 2 +、Mgを2 +フリーPBSで数回ビーズ。 </li><li> 115°C、15 psiので15分間オートクレーブ。 注：この実験では3グラム/ L（乾燥重量）を追加します。 </li><li>同様に、反応器に、水和し洗浄し、オートクレーブ処理されたマイクロキャリア媒体中のポンプは、ステップ4.1で追加されました。 </li></ol> 5。平衡とワンポイントDO校正<ol><li>オートにコントローラを設定し、必要な設定値を入力します。ここで、= 15 rpmで、温度SP = 37.0°C、pHは= 7.2、= 100％DO攪拌セットポイント（SP）を使用します。 Pを待ち平衡化arameters。 </li><li>センサーが完全に偏光していることを確認します。 DO現在価値が安定したことを確認します。 </li><li> 「アクション」タブに移動し、「キャリブレーション」をクリックします。 「DO A」をクリックし、「ワンポイント」をクリックしてください。 </li><li> 「スパン」の欄に「100」と入力します。 、クリックして「保存」と「閉じる」をクリックし「キャリブレート1」ボタンをクリックしてください： </li></ol> 6ファイル名を指定して実行を開始する<ol><li> [アクション]タブに移動します。 「バッチ」をクリックします。バッチ名を16文字以内で入力してオンスクリーンキーボードまたは外付けキーボードを使用してください。 </li><li>オンスクリーンキーボードの「非表示」ボタンをクリックしてください。オーバーレイで「開始」をクリックして確認し、「バッチを起動」をクリックしてください。 </li></ol> 7細胞で接種する<ol><li>未使用のメディア添加ライン（1オレンジバンド）と溶接による細胞ボトル/バッグ·ソースとの間の無菌接続を形成配管またはルアー継手を使用する。 </li><li>メディアポンプでチューブのシリコーン部分を取り付け、ポンプと容器との間のチューブに向かって矢印のようにします。 </li><li>管クランプが開いており、その分枝状管クランプが閉じているか確認してください。上のメディアポンプを回してセルを追加した後に「オフ」をクリックし、スライダーをクリックします。 </li><li> 「アクション」タブに移動し、「コントロールポンプ」をクリックします。 </li></ol> 8サンプリング<ol><li>として頻繁に文化を監視するために、必要に応じて接種した後、以下のように培養物からサンプルを描く。 </li><li> 「アクション」タブに移動し、「サンプルを取る」をクリックしてください。サンプリングポンプのサンプリングチューブを配置し、画面上の指示に従って、サンプリングストップコックを操作します。 </li><li>これらのサンプルについて少なくとも毎日、顕微鏡観察および細胞数を実行します。 </li><li>細胞は、この（c）に、所望の密度に達したとき1.2×10 6細胞/ ml ASE、ウイルス接種物を加えて細胞を感染させる。 </li><li>無菌的に20ミリリットルの注射器に接種材料を追加して、原子炉の予備加算ポートのいずれかに注射器を接続します。シリンジプランジャーを押して、反応器への接種材料を紹介。 </li><li>アデノウイルスの細胞内粒子濃度培養をサンプリングして分析し続けます。 </li></ol>

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	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications. , (2010).</li><li>Healthcare, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier+Cell+Culture+Principles+and+Methods.">Microcarrier Cell Culture Principles and Methods.</a> GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).</li><li>Simaria, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+cell+therapy+bioprocess+economics+and+optimization+Single-Use+cell+expansion+Technologies.">Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies.</a> Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).</li><li>Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+novel+pneumatic+mixing+for+single-use+bioreactor+application.">Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application.</a> BMC Proc. 5 (S8), O12 (2011).</li><li>Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactors+in+cell+culture-based+upstream+processing.">Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing.</a> BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).</li><li>Chaubard, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactors+for+viral+vaccine+production+challenges+and+opportunities.">Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities.</a> Biopharm Int Supp. , (2010).</li><li>Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+Effects+on+Animal+Cells+Grown+in+Microcarrier+Cultures.">Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures.</a> Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).</li><li>DePalma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-use+Equipment+on+Cusp+of+Industrialization.">Single-use Equipment on Cusp of Industrialization.</a> Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).</li><li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).</li><li>Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures. , (2012).</li></ol>

著者D.ジルーとY橋村は、この記事で使用される試薬および器具を生産するPBS Biotech社の従業員です。

この単回使用バイオリアクターシステムを使用するのが比較的簡単であり、原子炉監視および分析のためのリアルタイム分析を提供する。これは、3000万人以上の細胞/ mlに達し、セル密度を有する哺乳動物および昆虫細胞培養のための非常に適しています。本報告書11に記載されたA549細胞のほかに、私たちも同様にバイオリアクター中で、SF-9昆虫細胞を成長している。空気圧エアホイールが提供する穏やかな混合は、細胞の損傷を軽減します。この原子炉を設定するときに、いくつかのステップが重要である。まず、適切なpH値のキャリブレーションとは、センサーは培養液の最適なモニタリングのためおよびpHまたは系内の酸素を調整する試薬の添加のために重要であるようにしてください。第二に、試薬およびシードボトルは充填され、ルアーの添付ファイルは、BSCのような無菌環境で行う必要があります。試薬ボトルは、無菌環境の外に移動されると、バイオリアクターフィードラインへの接続は、微生物汚染を避けるために注意して行わなければならない。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;このバイオリアクターシステムは、それが細菌培養のために設計されていない哺乳動物および昆虫細胞株に適していますが。システムは、細菌細胞のために必要とされる急速混合し、酸素化を提供することはできません。細菌の増殖は最高の攪拌タンクバイオリアクターで達成される。哺乳動物または昆虫細胞培養のための他の単回使用バイオリアクターと比較して、このシステムは、使いやすいランの分析のための十分なデータを提供し、私たちが評価した他の単回使用システムよりも同等以上の細胞増殖を有している。 単回使用空気圧バイオリアクターシステムは、ワクチン、生物学的治療薬の分野における研究および臨床用途の多くを満たす幹細胞、および医学4をパーソナライズする可能性がある。また、このシステムの柔軟性がバッチ、フェドバッチ、灌流、およびトランスフェクションベースのバイオリアクターアプリケーション5を可能にする。最後に、単回使用の使い捨てバイオリアクターシステムはpotenを持つ大規模な工業生産のニーズを満たすためやガイドラインおよび国内外の規制当局6-10の勧告に付着したTiAl。

懸濁液中で成長する細胞は、凝集体として成長した細胞、および細胞基質に係留成長する：哺乳動物細胞株は、その増殖特性に基づいて3つのカテゴリに分類することができる。このビデオで実証エア輪バイオリアクターは、細胞の3種類すべてを成長することができるが、このビデオは、マイクロキャリア上で足場依存性細胞を増殖させるバイオリアクターの使用を実証します。細胞自体が生成物である - 足場依存性哺乳類細胞は、より多くの細胞を産生する目的のために成長させることができる。例えば、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、現在、細胞を採取し、病変組織にそれらを注入する目的で栽培されている。このビデオで実証空気圧バイオリアクターは、このアプリケーションのためのそのような間葉系幹細胞の産生に好適であることが判明した（セラら 、私信、2013）。 アンカレッジDEPendent哺乳動物細胞は、典型的には、それらが特別に処理された成長表面1に付着した細胞培養プレート、細胞培養フラスコまたはローラーボトルのような2D培養容器の小さなスケールを成長させる。より多くの細胞が望まれる場合、プレートまたはフラスコを、より多くのまたはより大きな血管を使用することによって拡張することができる。しかし、より費用対効果の足場依存性細胞の大量培養、細胞付着のための表面積を増大させるためのマイクロキャリアと呼ばれる小さな固体ビーズを使用することによって達成することができる。細胞の付着特性に応じて、マイクロキャリアのいくつかの異なるタイプは、デキストラン、ペプチド、またはコラーゲンコーティングされたように、市販されている。マイクロキャリアは、細胞増殖のための大きな表面積を提供体積比に大きな表面積を有し;マイクロキャリアは、細胞がバイオリアクターシステム2で高密度に培養されることを可能にする撹拌で懸濁状態に維持することができる。現在、bioreaの種類接着細胞は、マイクロキャリア上で増殖させるのコンスは、細胞コーティングされたマイクロキャリアの懸濁を維持するために、軸方向翼を使用するスピナーフラスコおよび撹拌タンクシステムを含む。 いくつかの要因は、酸素圧、剪断応力、表面マトリックス、および栄養および代謝物の濃度を含む細胞の培養に成功にとって重要である。バイオリアクターの使用は、増殖条件および有意に低い生産コスト1の電位のリアルタイムモニタリングを可能にする。を含む、 インビトロ細胞培養、撹拌した懸濁液、回転壁容器、中空繊維、ロッカープラットフォーム上でバッグ、バイオリアクター、流動床システム3のためのいくつかの一般的なバイオリアクターの設計がある。これらのシステムの多くは、高コスト、栄養濃度勾配が、流体力学的剪断、細胞凝集、困難サンプリングにおいて、監視、および制御するセルとして、細胞培養のための固有の問題を提示し-upスケールリットルスケールアップ。 各種の付着細胞株は、ウイルスワクチンの生産にまたは遺伝子治療適用のためのウイルスベクターの生産のためのいずれかの、ウイルスの産生に使用されている。このビデオでは、単回使用の空気圧（エアホイール）バイオリアクターシステムを用いて、本発明者らは、ヒト肺癌細胞（A549）腫瘍崩壊アデノウイルスの産生のためのマイクロキャリア上の細胞の培養を示す。空気圧バイオリアクターの設計は、バイオリアクターの底に散布したガスの浮力によって供給されて、垂直攪拌ホイールを使用しています。この穏やかな攪拌方法は、流体力学的剪断力を制限するが、それでも最適な培地と細胞を4ミキシングを保証する。撹拌槽型反応器と比較して、空気圧式反応器は、高容量空気ホイールバイオリアクターシステムと低い壁せん断応力（ 図1）を有している。攪拌タンクバイオリアクターとは対照的に、この単回使用の反応器の垂直インペラ内のガス気泡流により回転される穏やかで均一な媒質混合（ 図2）を可能にする容器。

<table><tbody><tr><td>PBS 3&amp;nbsp;</td><td>PBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single Use Assembly</td><td>PBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Lung Carcinoma Cells (A549)</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA, 0.25%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytodex 1 Microcarriers</td><td>GE</td><td>3781</td><td></td></tr><tr><td>Antifoam C</td><td>Sigma</td><td>A8011</td><td></td></tr></tbody></table>

cultivation of mammalian cells using a single-use pneumatic bioreactor system

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

図3では、バイオリアクターランの開始のためのパラメータが示されている。この図は、温度、溶存酸素、pHおよび撹拌のパラメータを設定する前に画面を示します。パラメータが設定されると、実行パラメータを連続的に監視され、調整が必要な条件を維持することができる。ソフトウェアは、問題の容易な同定を可能にする継続的な読み出しを生成します。 、FBS SAFCアンチフォームC、2mmのL-グルタミンおよびマイクロキャリアを3g / L 250ppmの10％を含むDMEM 2.5 Lを用いて、この実験では、システムは、そのように酸素原子百分率が50％である安定化され、温度は37℃であり、pHは7.2である。反応器を4×10 7細胞/ ml（または10細胞/マイクロキャリア）の濃度でA549細胞を接種される。この実行のために選択されたパラメータは、2時間（ 図4）内のマイクロキャリアに付着した細胞の大部分をもたらした。 12時間後、細胞を、鬼である平坦化マイクロキャリアの表面上に拡散trating記号（ 図5）。 24時間までに、マイクロキャリアは（ 図6）、細胞を含まない無マイクロキャリアおよびマイクロキャリア上の細胞の無い大きな塊の細胞の比較的均一な分布を有する。 A549細胞によるマイクロキャリアのコロニー形成の割合は、24時間、その後90％（ 図7）75重量％である。細胞を48時間後（ 図8）の後に〜100万個の細胞/ mlに指数関数的に成長し続けた。 50時間で腫瘍溶解性アデノウイルス（2×10 8ウイルス粒子/ ml）をの用量による感染後、密度がmlの120万個/まで増加した後、溶解感染が進むにつれて減少し始めた。ウイルス接種の〜10,000倍の増幅があった。 以前の実験では、ガスの流れを監視し、調節すること、細胞増殖（未発表データ）を最大化するために重要であることを見出した。急速に成長する細胞は、酸素のシステムとを枯渇することができます<html>ゼロに落とすDOレベル。細胞が成長を続けている間、それははるかに遅い速度であった。これは、対数増殖期の間に細胞の要求を満たすために酸素の流れを監視し、調整することが重要である。各ランは、毎日細胞数とpHは、DOおよび温度とを比較することにより、最適な成長のために分析することができる。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig1highres.jpg" /> さまざまな原子炉の容量で壁面せん断力を測定スターラータンクバイオリアクターと比較して空気圧バイオリアクターシステム（PBS）の図1に流体力学 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig2highres.jpg" /> 図2。空気圧エアホイールリアクターインペラー。 <html> 52008 / 52008fig3highres.jpg &quot;/&gt; バイオリアクターの実行を開始するために、パラメータの3空気圧エアホイールソフトウェアのスクリーンショット図。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" /> A549細胞2時間後に接種した。図4。マイクロキャリア植民地化。（平均マイクロキャリア径〜180程度である。） <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig5highres.jpg" /> 図5に12時間培養開始後、A549細胞は、取付平坦化、およびマイクロキャリアに広がっている。5highres.jpg &quot;ターゲット=&quot; _ブランク」&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" /> 培養中の24時間後に細胞で覆われた図6のマイクロキャリア。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig7highres.jpg" /> A549細胞によるマイクロキャリア植民地化の図7の割合は接種後。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig8highres.jpg" /> 図8 adenovir、培養前の生A549細胞の数と感染後当方は、ウイルス感染工程は50時間で起こったことに注意してください。

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Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

使い捨て空気圧バイオリアクターシステムを使用して、哺乳動物細胞の培養

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.3K ビュー.  Johns Hopkins University. Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells. 

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Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

拍動バイオリアクターを用いた工学生物学ベースの人工血管

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

生物工学

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

灌流マイクロバイオリアクターのチップベースの三次元細胞培養

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

生物学

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

マイクロスケール細胞刺激のための実験のための多目的自動化プラットフォーム

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

スフェロイドにおける哺乳動物細胞の大規模拡張のための連続供給することによって栄養規制

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

The functional behavior of cells in culture can be improved by culturing in more in vivo-like 3-dimensional culture environments16-21. This manuscript describes the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for in vivo-like mammalian tissue culture.

用中空糸バイオリアクター<em&gt;インビボ</em&gt;哺乳動物の組織培養様

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

高スループットの自動モデル IgG1 CHO 細胞での生産のための Microbioreactor システム

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain selection and by developing bioprocess parameters. Shake flasks have been used for this purpose. They, however, lack the capability to control the process parameters such as pH and dissolved oxygen (DO). This limitation can be overcome with the help of an automated micro-bioreactor. These bioreactors mimic cultivation at a larger scale. One of the major advantages of this system is the integration of the Design of Experiment (DOE) in the software. This integration enables establishing a design where multiple process parameters can be varied simultaneously. The critical process parameters and optimum bioprocess conditions can be analyzed within the software. The focus of the work presented here is to introduce the user to the steps involved in process design in the software and incorporation of the DOE within the cultivation run.

Here, we present a detailed procedure to run a Design of Experiment in an automated micro-bioreactor followed by cell harvest and protein quantification using a Protein A column.

中国ハムスター卵巣細胞培養におけるハイスループット自動マイクロバイオリアクターを用いたプロセス最適化

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

溶解性マイクロキャリアに基づく接着細胞の閉鎖系作製

Large-Scale Cell Production Based on GMP-Grade Dissolvable Porous Microcarriers

Researchers in the cell and gene therapy (CGT) industry have long faced a formidable challenge in the efficient and large-scale expansion of cells. To address the primary shortcomings of the two-dimensional (2D) planar culturing system, we innovatively developed an automated closed industrial scale cell production (ACISCP) platform based on a GMP-grade, dissolvable, and porous microcarrier for the 3D culture of adherent cells, including human mesenchymal stem/stromal cells (hMSCs), HEK293T cells, and Vero cells. To achieve large-scale expansion, a two-stage expansion was conducted with 5 L and 15 L stirred-tank bioreactors to yield 1.1 x 1010 hMSCs with an overall 128-fold expansion within 9 days. The cells were harvested by completely dissolving the microcarriers, concentrated, washed and formulated with a continuous-flow centrifuge-based cell processing system, and then aliquoted with a cell filling system. Compared with 2D planar culture, there are no significant differences in the quality of hMSCs harvested from 3D culture. We have also applied these dissolvable porous microcarriers to other popular cell types in the CGT sector; specifically, HEK293T cells and Vero cells have been cultivated to peak cell densities of 1.68 x 107 cells/mL and 1.08 x 107 cells/mL, respectively. This study provides a protocol for using a bioprocess engineering platform harnessing the characteristics of GMP-grade dissolvable microcarriers and advanced closed equipment to achieve the industrial-scale manufacturing of adherent cells.

著者スポットライト:溶解性マイクロキャリアによる細胞治療製造の進歩 

Here, we present a protocol to achieve the large-scale manufacturing of adherent cells through a fully closed system based on GMP-grade dissolvable microcarriers. The cultivation of human mesenchymal stem cells, HEK293T cells, and Vero cells was validated and met both quantity demands and quality criteria for the cell and gene therapy industry.

GMPグレードの溶解性多孔質マイクロキャリアに基づく大規模セル生産

Researchers in the cell and gene therapy (CGT) industry have long faced a formidable challenge in the efficient and large-scale expansion of cells. To ...