Name: bladder smooth muscle strip contractility as a method to evaluate lower urinary tract pharmacology
Uploaded: 2014-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
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이 연구는 (LB)에 NIH R37 DK54824 및 R01 DK57284 보조금에 의해 지원되었다

여기에 설명 된 모든 절차는 피츠버그 대학에서 IACUC위원회에 의해 승인됩니다. 1 솔루션 <ol><li> 법에 따라 크렙스 솔루션을 준비합니다. 염화나트륨 (118)의 KCl 4.7, 염화칼슘 1.9, 황산 1.2, 탄산 수소 나트륨 24.9, KH 2 PO 4 1.2, 포도당 11.7 : MM의 조성. </li><li> 95 % O 2, 5 % CO 2 크렙스을 공급하십시오 및 실험을하는 동안 사용되는 37 ºC 물을 욕조에 넣습니다. 제쳐 놓고 ~ 실온에서 폭기 된 크렙스 용액 200 ㎖를 조직 절제술에 사용되는. </li><li> 화난 크렙스의 산도 (~ 7.4)와 삼투압 (~ 300 mOsm)를 측정한다. </li></ol> 2 실험 장치 (회로도 그림 1A) <ol><li> (95 % O 2, 5 % CO 2) 10 ㎖의 크 레브와 챔버 화난 채 웁니다. </li><li> 37 ° C에 챔버를 가열하는 순환 수 펌프를 시작합니다; 필요한 장비를 켜 : 앰프 (들), 자극 (들) 및 기록 소프트웨어입니다. </li><li> 1g의 무게와 트랜스 듀서를 보정합니다. </li></ol> 3 조직 (그림 1B) 다음 단계 다음 (~ 10~12주 이전 200~250g) 성인 순진한 여성 스프 라그 돌리 쥐에서 방광을 제거 <ol><li> 해부 영역과 필요한 장비 준비 : 전기 면도기, 치아 포셉, 메스 블레이드, 해부 가위, microscissors을,이 해부 집게, 조직 클립 (또는 실크 봉합사), 크렙스와 함께 실 가드 코팅 해부 접시 (저자는 뒤몽 집게 # 3를 선호) 조직 해부 핀입니다. </li><li> 유도 챔버에서 흡입 이소 플루 란 (2 O 4 %)으로 동물을 마취. 마취 동안 건조 함을 방지하기 위해 눈에 수의학 연고를 사용합니다. 연속 호흡율, 외부 자극에 응답하고, 휘어진 인출 후방 사지의 손실을 관찰함으로써 마취의 레벨을 모니터링한다. </li><li> 동물 면도 하복부 마취 할 때정말이에요. 중간 선 복부 절개를 통해 골반 장기 노출. 방광과 요도를 확인합니다. 근위부 요도에 가까운 방광 경부에서 절단하여 방광을 제거합니다. 화난 크렙스 솔루션을 가득 실 가드 코팅 접시에 즉시 조직을 놓습니다. </li><li> 필요한 경우,이 시점에서 추가적인 조직을 제거 : 요도, 위장 (GI) 관 및 / 또는 전립선 조각 등 </li><li> IACUC 승인 된 방법 (예를 들면, 마취제 또는 과다 보조 방법이어서 질식 CO 2)를 사용하여 동물을 희생한다. </li><li> 더 해부 조직을 안정시키기 위해, 방광 돔, 목, 및 요관을 통해 조직을 해부 핀을 삽입합니다. 조직을 늘리지 않습니다. 지방, 결합 조직, 근위부 요도, 요관하고있는 경우를 제거합니다. </li><li> 플랫 시트를 만드는 돔 기지에서 방광을 열고 장막면이 아래 / 내강면을 위로 (그림 1B). 조직의 각 모서리에 해부 핀을 놓습니다. 방광 돔을 제거전자와 목 조직. </li><li> 실험의 목적은 점막 (요로 상피 및 고유 층 - 다이어그램도 1C 참조)의 기여를 결정하는 경우 평활근 수축을, 함께 및 장착 점막없이 배뇨근 스트립의 특성을 비교한다. 이를 위해, 조직 스트립을 절단하기 전에 신중 홍채 해부 현미경 하에서 미세 가위 집게를 사용하여 스프링 점막층을 제거. 실험의 끝에, 점막의 완전한 제거를 확인하기 위해 H &amp; E 염색 용 스트립을 고정한다. 이 절차는 쥐의 방광에 비해 마우스 방광에서 쉽게합니다. </li><li> ~ 2 × 8mm (그림 1B)의 스트립으로 돔 기지에서 세로로 조직을 잘라. 넥타이 또는 각 스트립의 양단에 조직 클립을 첨부합니다. NOTE : 한 래트 방광은 보통 4 스트립으로 절단 할 수 있지만, 스트립의 수는 증가하거나 감소 동물 / 방광 크기에 따라. </li><li> exper에 스트립 전송imental 실. 한 조직의 수축을 측정하는 힘 센서, 각 스트립의 끝과 고정 유리 / 금속 막대에 다른 연결합니다. 참고 : 조직 챔버의 크기 (20 ㎖의 이상으로 0.2 ml)에 따라 다릅니다. 쥐의 방광에 대한 일반적인 챔버 스트립이 완전히 용액에 침수 될 충분한 높이를 제공하는 5 ~ 20 ㎖의입니다. 일부 챔버 내장 자극 전극, 다른 사람 없습니다에게 제공됩니다. 케어 달리 전계 자극이없는 신뢰성, 전극의 모든 접속 상태가 양호한 것을 확인해야한다. </li><li> 베이스 라인 장력이 1g (~ 10 MN)이 도달 할 때까지 부드럽게 조직을 스트레칭하여 각 스트립에있는 힘의 정의 금액을 적용합니다. 처음에 조직은 기준선 장력의 감소로 기록되어있는 이완되는 경향이있다. 워시 조직은 약 및 따뜻한 폭기 크렙스를 사용하여 15 분마다 각 세척 후 1g 기준선 장력을 조정합니다. (기준 긴장이 안정적 조직 ~ 1-2 시간이나 때까지 평형을 허용즉, 더 이상의 조직 휴식). </li><li> ~ 5 분간, 또는 고원 응답까지 조에 직접의 KCl (80 ㎜)에 추가하여 시험 조직 생존력이 도달된다. 고농도의 KCl에 대한 응답은 또한 실험 동안 또는 실험의 끝에서 반복 (데이터 해석 부 밑에 정규화 참조) 스트립 다른 약물에 대한 반응을 정규화 또는 사이에 사용될 수있다. </li><li> 따뜻한 화난 크렙스 씻을 조직을 여러 번 (3-5x)는 조직 전처리 조건에 반환 할 수 있습니다. </li></ol> 4 자극 프로토콜 <ol><li> 이러한 SCI, BOO 또는 신생아와 같은 다른 동물 모델에서 평활근 스트립을 사용, 자연, 근원 활동이나 평활근에 병리의 효과를 알아보고자 하였다.이 그림은 개발하는 동안 방광 자발적인 활동의 변화를 조사하기 위해이 방법을 사용하는 방법을 보여줍니다 및 SCI 후. 또한, 약학 제제는 SP를 변조하는데 사용될 수있다ontaneous 활동.도 3은 자발 활동 및 평활근 톤 KCNQ 채널 변조기, flupirtine 및 XE991,의 효과를 도시한다. </li><li> 직접 정의 된 시간 간격으로 목욕 농축 원액으로부터 화합물을 첨가함으로써 약리학 평활근 자극 구조체 농도 반응 곡선. 차량 및 시간 효과를 설명하기 위해 병렬 스트립에 약물 및 차량을 사용합니다. <ol><li> 1000X 최종 작업 농도에서 원하는 시험 화합물의 원액을 확인합니다. 10-5 M, 3 × 10-5 M, 10-4 M, 3 × 10-4 M, 10-3 M, 3 × 10-3 M : 카바 콜 (CCH), 무스 카린 수용체 작용제를 들어, 다음과 같은 종목을 준비 10 -2 M. 욕실에서 최종 농도는 10 -5 M (그림 4C, D)에 10 -8 M이다. 10-8 M, 10-7 : 뉴로 메딘의 B (NMB), 봄베 신 수용체 서브 타입 1 작용제를 들어, 다음과 같은 주식을 준비M, 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M 및 욕조에 최종 농도 아르 10 -11 M에서 10 -4 M. CCH와 NMB 모두 조직의 수축력을 증가 할 것으로 예상된다. </li><li> 응답이 고원 (그림 4C, D)에 도달로 10 ml의 조직 목욕하는 순간 각 CCH 원액의 10 μl를 추가합니다. 병렬 스트립에서 차량 (물)의 같은 양을 추가합니다. 마찬가지로, 각 뉴로 메딘의 B 원액의 10 ㎕의 모든 ~ 5 분을 추가합니다. 참고 : 그림 4 종에서 스트립의 평활근에 NMB와 CCH의 흥분성 효과를 관찰한다. </li><li> 흥분 에이전트, 일반적으로 CCH 또는 KCl을 사전 계약 조직의 평활근의 이완 특성을 조사합니다. </li><li> 길항제 반응을 차단하는, 자극 작용제 전에 조직 침투를 허용하기 위해 길항제 10-20 분 동안 조직을 전처리. </li></ol></li><li> 신경 STIM을 위해평활근의 위험률도라는 전기장 자극 (EFS) 3.13에 단계 하나를 따라 아래에 설명 된대로 계속합니다. EFS는 선택적 평활근에 비해 신경을 활성화하기위한 것입니다. 자극 파라미터는주의 깊게 평활근에 직접 자극을 피하도록 선택되어야한다. <ol><li> 자극 매개 변수를 설정 : 아래 단계에 설명도 5A, B에 도시 된 바와 같이 자극 (단일 펄스 또는 기차), 기간 (펄스 지속 시간 및 열차 시간), 빈도와 강도의 유형을. <ol><li> 단일 펄스 자극, 세트 펄스 지속 시간, 간 자극 간격과 원하는 자극의 수하십시오. 통상, 자극 지속 기간 파라메터는 원하는 간격 (도 5a)에 전달 0.05-0.3 msec의 지속 기간의 하나의 펄스이다. 자극 강도에 대한 단계 4.3.1.4을 따르십시오. </li><li> 기차 자극의 경우, 기차 시간 간 열차 간격을 설정합니다. 방광 조직에 대한 일반적인 값은 3-10 초는 적어도 1m를 전달떨어져에서 (그림 5B). 조직의 피로 (즉, EFS 수축 제어 기간 동안 감소)가 발생하는 경우, 간 열차 간격을 증가시킨다. </li><li> 기차에서 펄스의 기차 자극의 주파수 (번호를 설정 - 그림 (b)). 0.5-50 Hz에서 범위의 주파수 응답 곡선을 실행. 방광의 일반적인 주파수는 ATP 및 아세틸 콜린에 의해 매개 재현하고 안정적​​인 수축을주고 10 ~ 20 Hz에서입니다. 이 방법은 콜린성 및 신경 전달에 퓨린 메커니즘의 기여를 평가하는 데 사용할 수있는 방법을 보여주는 그림 5에서 마우스 방광 스트립 EFS의 자극에 따라 주파수 응답을 관찰한다. </li><li> 자극 강도를 확립 : 수축의 진폭이 정체기에 도달 할 때까지 (하여 열차의 주파수를 일정하게 유지하는 경우) 체계적 자극의 세기 (전압)을 증가시킨다. </li><li> 에 따라 자극의 강도를 설정합니다실험의 목표로하고 있습니다. 목표 - 유발 신경을 수축을 증가시키는 경우, 수축의 진폭이 최대 수축 ~ 50 %가되도록 준 최대 강도를 사용한다. 목표 - 유발 신경을 수축을 감소시키는 경우, ~ 최대 진폭의 80 %가 조직의 피로를 방지하기 위하여 강도를 설정한다. </li></ol></li><li> 자극 매개 변수 (기간, 빈도와 강도)가 설립되면, EFS- 20 ~ 30 분 약물 검사 전에 안정 수축을 유발 ~ 수 있습니다. 참고 : (; 0.5 μM TTX) 신경 전송, 나 + 채널 차단제, 테트로도톡신와 블록 신경 전송을위한 EFS의 선택을 확인합니다. TTX 비교적 쉽게 떨어져 세척 같이, 실험의 시작에서이 단계를 수행한다. 또한, (단계 4.3.5 참조. 아래) 실험의 끝에이를 수행. </li><li> 최종 작업 농도가 1,000 배의 재고 솔루션을 준비 : 알파, 베타 - 메틸렌 ATP (ABMA, 퓨린 수용체의 활성화를및 desensitizer) 10 -2 M, 아트로핀 (무스 카린 수용체 길항제) 10 -3 M (그림 5C). 도 6에 다른 예를 관찰한다. 5HT4 수용체 작용제, 시사 프라이드 (3 × 10-6 M, 10-6 M을, 3 × 10-5 M, 10-5 M, 3 × 10-4 M을, 10-4 M, 3 × 10-3 M, 10-3 M)는, 조직 수축성 및 SB-203186 (3 × 10-3 M), 5HT4 수용체 길항제를 증가 시사 프라이드의 효과를 반전. </li><li> EFS (그림 5C)에 ABMA의 효과와 아트로핀을 테스트하려면, 두 개의 제어 주파수 응답 곡선을 수행합니다. 10 μM의 최종 농도에 화장실에 10 -2 M ABMA의 10 μl를 추가합니다. 이는 평활근에 직접 퓨린 수용체의 자극에 조직을 수축한다. 기준에 대한 응답을 반환 한 후, 주파수 응답 곡선을 반복합니다. 최종 정광 10 -3 M의 아트로핀의 10 μl를 추가1 μM의 이온. (무스 카린 수용체를 차단하기 위해 필요한 아트로핀) ~ 10 분, 반복 주파수 응답 곡선 후. 병렬 스트립의 각 단계에서, 차량, 물 10 μl를 추가합니다. NOTE :도 6의 다른 예를 들어, 정의 된 시간 간격들 (~ 15 분마다, 설명을 참조)에서 각 시사 프라이드 스톡 용액 10 μL를 추가 직접 조에 SB-203186 스톡 용액 10 ㎕를 다음과에 미치는 영향을 모니터링 수축을 EFS는 유도. 병렬 스트립에서 자동차, DMSO의 10 μl를 추가합니다. 시사 프라이드의 효과를 관찰,도 6 인간 방광과 회장 조직에서 EFS-유발 된 수축에 대한 5HT4 수용체 작용제는. 또한 인간 방광 및 회장 조직에서 EFS-유발 된 수축에 DMSO의 효과, 시사 프라이드 용 차량을 관찰 . </li><li> EFS 프로토콜의 끝에 나트륨 + 채널 차단제, 테트로도톡신 (TTX으로 신경 전달을 차단하여 EFS의 선택성을 확인; 0.5-1 &amp;# 181; M). TTX에 강한 수축이 남아있을 경우, 이후의 실험에서 자극의 지속 시간과 강도를 조절하는 것이 좋습니다. </li></ol></li><li> 사전 또는 사후 시냅스 사이트 (그림 7A)를 약물의 효과를 결정하기위한 4.3.2 단계 1을 따르십시오. 카르 바콜하는 재현 응답을 설정하고 EFS는 다음 약물 X를 추가 </li><li> 실험의 끝에, 또는 클립을 풉니 스트립을 풀어, 여분의 유체를 제거하고 나머지를 사용하여 각 스트립의 중량을 측정하는 티슈 종이 위에 부드럽게 그들을시킨다. 또한 단면적을 결정하는 캘리퍼스를 사용하여 조직의 길이를 측정한다. 이 정보는 데이터의 정상화를 위해 사용된다 (5.4 절 참조). </li></ol> (5) 데이터 분석 적절한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하여 (예를 들어, Windaq, LabChart). <ol><li> 자발적 활동의 경우, 이전과 약물에 의한 반응과 나의 절정에 적어도 30 초 창을 선택슈어의 진폭과 근육 조직 활동의 주파수 (그림 3). <ol><li> 방광의 다른 부분 사이의 차이가 수축 반응에 기여하고 있는지 여부의 주파수 스펙트럼을 결정하기 위해 고속 푸리에 변환 분석을 사용하여 (예를 들어, 목 대 돔) 또는 개발 병리 및 약물 8. </li></ol></li><li> 평활근 톤 효과 전에 약물 유발 반응의 피크에서, 적어도 10-30 초간의 윈도우를 선택 및 수축의 진폭을 측정한다. </li><li> 신경을-유발 된 수축에 대한 효과를 위해 전 약물 유발 반응의 피크에서의 수축 곡선 (최소 3) 아래의 진폭, 지속 시간 및 면적을 측정한다. 주 : 퓨린 및 콜린성 다른 성분을 가지고 있기 때문에 반응 속도 EFS 유도 수축 곡선 아래의 면적 및 진폭 모두를 측정 할 필요가있다. 퓨린 성분이 빠르고 일시적인 (ATP는 purinergi를 활성화칼슘의 신속한 유입을 허용 같은 P2X1 C 등의 이온 성 채널, 그들은 이에 곡선 아래 면적에 대한 피크 진폭 응답에보다 덜 기여) 둔감. 콜린성 성분 (ACH 궁극적 수축을 유도하는 평활근 탈분극 이온 채널을 활성화 세포 내 경로를 활성화하기 위해 더 많은 시간을 필요로 대사 무스 카린 성 수용체를 활성화시킨다) 느리고 유지된다. 따라서, 무스 카린 성분 곡선 아래 면적을 측정하여 더 포착된다. </li><li> 스트립 및 약물 치료를 통해 결과를 비교할 수 있도록 데이터를 정규화한다. 정규화를 위해 선택된 파라미터는 병리학 적 조건이 연구 또는 실험 설계, 시험 화합물에 의해 좌우되어서는 안된다. 이러한 매개 변수를 사용 스트립 중량, 단면적, KCl을 응답 (도 4b), 다른 수축성 에이전트 최대 반응의 최대 반응 (도 7b) 또는 %의 % 중에서(예를 들어, CCH) 또는 편안한 에이전트 (예를 들어, 파파 베린). </li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

본 논문에서는 방광 생리학 및 병리학뿐만 아니라, 방광 기능 장애를 치료하기위한 새로운 약물의 발견을 돕는 관련된 중요한 과학적 문제들을 해결하는데 사용할 수있는 시험 관내 평활근 수축 방법에서 간단한 설명. 우리는 방광 평활근 수축의 발달 병리학 적 및 약리학 적 특성 (그림 2-4), 신경 전달 변조 (그림 5-7A), 종의 차이 (그림 4), 장기?...

방광 평활근 소변 제거를 유도하기 위해 소변의 저장을 허용하도록 완화하고, 계약. 휴식은 내장 평활근 속성으로하고 배뇨근 베타 아드레날린 수용체 (β 인간의 3 AR)을 활성화 교감 신경에서 노르 에피네프린 (NE)의 토닉 릴리스에 의해 매개된다. 보이드는 교감 입력을 억제하고 아세틸 콜린 / ATP는 방광 평활근 일을 계약을 해제 부교감 신경을 활성화함으로써 달성된다. 뇌 및 / 또는 척수 손상, 신경 변성 질환, 당뇨병, 방광 출구 폐색 또는 간질 성 방광염 등 다양한 병적 상태, 뿌리깊 수명이 환자의 품질에 심각한 영향을주지 않고, 방광 기능을 변경할 수있다. 평활근, 원심성 또는 구 심성 신경 및 / 또는 이러한 조건은 하나의 블래 더에 영향을 미치는 요소에 의해 평활근의 수축을 변경할점막. 생체 내 및 방광 기능을 연구하기위한 생체 외 방법에서 여러 가지가 개발되어왔다. 생체은 방광 내압 측정은 방광 기능의 기본 측정이다. 이는 생리적 조건 하에서 주변 정보의 수집을 허용 그대로 제제이더라도, 평활근 스트립의 사용이 바람직하다하는 상황들이있다. 이러한 수술 및 / 또는 약리학 적 조작이 생존과 생체 제제의 안정성, 또는 영향을 미칠 수있는 상황을 포함 연구는 인간의 조직 또는 고가의 화학 물질의 사용을 필요로 할 때. 이 방법은 또한 방광의 각 구성 요소에 대한 약물, 나이 및 병리 효과 시험을 용이하게, 평활근, 점막, 원심성 및 구 심성 신경 즉. 방광 스트립은 과학적 질문에 대답 할 수 많은 그룹으로 수년에 걸쳐 이용되어왔다. 그들은 에바에 사용되었다근원 성 자발적인 활동 luate 변경 병리에 의해 유도. 이 활동은 과민성 방광 (OAB)의 긴급 및 주파수 증상에 기여하는 것으로, 따라서 OAB 3-9 개발되고 약물의 대상이다. 방광 스트립 또한 이완 또는 평활근 수축를 유도하는 대상이 될 수있는 이온 채널 및 / 또는 수용체 및 / 또는 세포 내 경로를 발견 할 목적으로 평활근 톤을 변조 근육 조직 및 신경 세포의 요인을 조사하기 위해 사용 하였다 3,10- 13. 다른 연구는 병리 (14, 15)에 의해 유도 된 송신기와 관련된 수용체 및 변경을 포함하여 신경 전달 물질의 특성에 초점을 맞추고있다. 또한,이 방법은 장기 19-21과 약물 구조 - 활성 관계의 평가 사이 22-24, 16 종 (18)로부터의 조직 사이의 비교를 위해 사용되어왔다. 이 방법의 확장은 지표 성과 데 사용되었습니다원심성 신경 송신기 (25)로부터 방출에 약물의 효과를 전자. 또한, 조직 (방광, 요도, 위장관, GI) (연구 승인을 수술 또는 장기 기증 조직부터) 동물이나 인간에서 수확 및 척수 손상 (SCI), 방광 출구 폐색을 포함한 동물의 다양한 모델에서 다양한 (BOO), 간질 성 방광염 (IC)은이 기술을 이용하여 조사 할 수있다. 본 논문에서는 위에서 언급 한 여러 과학적인 문제를 해결하기 위해 필요한 실험 프로토콜과 함께이 방법의 사용을 예시한다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Tissue Bath System with Reservoir</td><td>Radnoti, LLC</td><td>159920</td><td>isolated tissue baths</td></tr><tr><td>Warm water recirculator pump</td><td>Kent Scientific Corporation&amp;nbsp;</td><td>TPZ-749</td><td>to keep tissue baths to 37 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>Computer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Data Acquisiton System</td><td>DataQ Instruments</td><td>DI-710-UH</td><td>To view, record and analyze data</td></tr><tr><td>Transbridge Transducer Amplifier</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-TBM4M</td><td>Transducer amplifier</td></tr><tr><td>Grass stimulator</td><td>Grass Technologies</td><td>Model S88</td><td>Stimulator</td></tr><tr><td>Anesthesia System</td><td>Kent Scientific Corporation&amp;nbsp;</td><td>ACV-1205S</td><td>To anesthetesize the animal</td></tr><tr><td>Anesthetizing Box</td><td>Harvard Apparatus</td><td>500116</td><td>To anesthetesize the animal</td></tr><tr><td>Anesthesia Masks</td><td>Kent Scientific Corporation&amp;nbsp;</td><td>AC-09508</td><td>To anesthetesize the animal</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materials and Surgical Instruments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning Corp</td><td>184 SIL ELAST KIT</td><td>To pin, dissect, &amp;amp; cut tissue</td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Corning</td><td>3160-152</td><td>To dissect/cut tissue</td></tr><tr><td>Insect Pins</td><td>ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins</td><td>Size 5</td><td>To pin tissue</td></tr><tr><td>Bench Pad</td><td>VWR International</td><td>56617-014</td><td>Absorbent bench underpads</td></tr><tr><td>Rat surgical Kit</td><td>Kent Scientific Corporation&amp;nbsp;</td><td>INSRATKIT</td><td>To remove and dissect tissue</td></tr><tr><td>2 Dumont #3 Forceps</td><td>Kent Scientific Corporation&amp;nbsp;</td><td>INS500064</td><td>To remove and dissect tissue</td></tr><tr><td>Tissue Forceps</td><td>Kent Scientific Corporation&amp;nbsp;</td><td>INS500092</td><td>To remove and dissect tissue</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Kent Scientific Corporation&amp;nbsp;</td><td>INS500236</td><td>To remove and dissect tissue</td></tr><tr><td>Scalpel blade</td><td>Kent Scientific Corporation&amp;nbsp;</td><td>INS500239</td><td>To remove and dissect tissue</td></tr><tr><td>Professional Clipper&amp;nbsp;</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>CLP-223&amp;nbsp;45</td><td>To remove fur</td></tr><tr><td>Suture Thread</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-50</td><td>Tie tissue</td></tr><tr><td>Tissue Clips</td><td>Radnoti, LLC</td><td>158802</td><td>Attach tissue to rod/transducer</td></tr><tr><td>1 g weight</td><td>&amp;nbsp;Mettler Toledo</td><td>11119525</td><td>For transducer calibration</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Krebs Solution:&lt;br /&gt;Sodium chloride&lt;br/&gt; Potassium chloride&lt;br/&gt; Monobasic potassium phosphate&lt;br/&gt; Magnesium sulfate&lt;br/&gt; Dextrose&lt;br/&gt; Sodium bicarbonate&lt;br/&gt; Calcium chloride&lt;br/&gt; Magnesium chloride</td><td>&amp;nbsp;&lt;br /&gt;Sigma&lt;br/&gt; Fisher&lt;br/&gt; Fisher&lt;br/&gt; Fisher&lt;br/&gt; Fisher&lt;br/&gt; Sigma&lt;br/&gt; EMD&lt;br/&gt; Baker</td><td>&amp;nbsp; &lt;br /&gt;S7653&lt;br/&gt; P217-500&lt;br/&gt; P285-3&lt;br/&gt; M65-500&lt;br/&gt; D16-500&lt;br/&gt; S5761&lt;br/&gt; CX0130-2&lt;br/&gt; 2444</td><td>To prepare Krebs solution</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>029405</td><td>To anesthetesize the animal</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Oxygen tank</td><td>Matheson Tri Gas</td><td>ox251</td><td>To use with anesthesia system</td></tr><tr><td>Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide)&amp;nbsp;</td><td>Matheson Tri Gas</td><td>Moxn00hn36D</td><td>To aerate Krebs solutions</td></tr></tbody></table>

bladder smooth muscle strip contractility as a method to evaluate lower urinary tract pharmacology

우리는 체외 방광 평활근 수축을 측정하는 방법, 및 약리학 적 및 생리 평활근의 성질뿐만 아니라 병리학 적 변화에 의한 조사에 대한 사용을 설명한다. 이 방법은 수술 및 약리학 적 제제의 안정성 및 생존에 영향을 조작, 인체 조직의 사용 및 / 또는 고가의 화학 물질의 사용과 같은 생체 내 실험에서 발생 주요 방법론적인 어려움을 극복하면서, 방광 기능을 이해하는데 중요한 정보를 제공한다. 또한 건강하고 병적 조건의 각 방광 성분 (즉, 평활근, 점막, 신경)의 성질을 조사하는 방법을 제공한다. 방광은 마취 된 동물, 크렙스 용액에 넣고, 스트립으로 절단 제거한다. 스트립 따뜻한 크렙스 용액으로 채워진 챔버에 배치됩니다. 일단 아이소 장력에 부착수축력을 측정하는 n 개의 트랜스 듀서, 타단은 고정 된로드에 부착된다. 티슈 직접 목욕 또는 생체 내에서 방광 수축을 유발 유사한 신경을 활성화 전기장 자극 전극에 의해 화합물을 추가로 자극한다. 우리는이 방법의 사용은 발전 과정 및 실험 척수 손상 후 자발 평활근 수축을 평가 보여, 신경 전달 (관련된 송신기 및 수용체), 평활근 활성의 조절에 관여하는 인자의 성질, 개별 블래 성분의 역할 종 및 약리 에이전트에 응답 기관의 차이. 또한, 송신기는 릴리스 수축 및 / 또는 평활근의 이완, 약물 구조 활성 관계 및 평가에 관련된 세포 내 경로를 조사를 위해 사용될 수있다. 체외 평활근 수축 방법은 광범위하게 사용되어왔다 FO오십년 이상 R, 크게 방광 기능에 대한 우리의 이해뿐만 아니라 현재 방광 관리를 위해 임상 적으로 사용되는 화합물의 제약 발전에 기여 데이터를 제공하고 있습니다.

자발적인 근육 조직 활동 자발적인 근육 조직 활동은 출생 후의 개발 6-9 병리 (예를 들어, SCI, BOO) 3-5으로 변화를 겪는 중요한 평활근 특징입니다. 이 액티비티는 과민성 방광 (OAB) (2)의 증상에 기여하는 것으로 생각되기 때문에, 변조 수용체, 세포 내 경로 및 약리 제의 평가는 OAB 및 기타 평활근 장애에 대한 효과적인 치료법을 개?...

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Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

이 원고는 약리학 제제 또는 신경 자극에 반응하여 평활근 수축을 평가하기위한 시험 관내 방법에있어서, 간단하지만 강력한을 제시한다. 주요 응용 프로그램은 약물 검사 및 이해 조직 생리학, 약리학, 병리학이다​​.

하부 요로 약리학을 평가하는 방법으로 방광 평활근 스트립 수축성

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

26.2K 조회수.  University of Pittsburgh School of Medicine.  이 원고는 약리학 제제 또는 신경 자극에 반응하여 평활근 수축을 평가하기위한 시험 관내 방법에있어서, 간단하지만 강력한을 제시한다. 주요 응용 프로그램은 약물 검사 및 이해 조직 생리학, 약리학, 병리학이다​​. 

비디오: Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

Mouse Bladder Wall Injection

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. Before starting injections, the surgical area must be cleaned with soap and water and antiseptic solution. Surgical equipment must be sterilized before use and between each animal. Each mouse is placed under inhaled isoflurane anesthesia (2-5% for induction, 1-3% for maintenance) and its bladder exposed by making a midline abdominal incision with scissors. If the bladder is full, it is partially decompressed by gentle squeezing between two fingers. The cell suspension of interest is intramurally injected into the wall of the bladder dome using a 29 or 30 gauge needle and 1 cc or smaller syringe. The wound is then closed using wound clips and the mouse allowed to recover on a warming pad. Bladder wall injection is a delicate microsurgical technique that can be mastered with practice.

Mouse bladder wall injection is a useful approach to orthotopically study bladder stem cell and cancer biology. This delicate microsurgical method can be mastered with careful technique and practice.

마우스 블레더 월 주입

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. ...

연구

의학

Manual Muscle Testing:  A Method of Measuring Extremity Muscle Strength Applied to Critically Ill Patients 

Survivors of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other causes of critical illness often have generalized weakness, reduced exercise tolerance, and persistent nerve and muscle impairments after hospital discharge.1-6 Using an explicit protocol with a structured approach to training and quality assurance of research staff, manual muscle testing (MMT) is a highly reliable method for assessing strength, using a standardized clinical examination, for patients following ARDS, and can be completed with mechanically ventilated patients who can tolerate sitting upright in bed and are able to follow two-step commands. 7, 8 
This video demonstrates a protocol for MMT, which has been taught to &ge;43 research staff who have performed &gt;800 assessments on &gt;280 ARDS survivors. Modifications for the bedridden patient are included. Each muscle is tested with specific techniques for positioning, stabilization, resistance, and palpation for each score of the 6-point ordinal Medical Research Council scale.7,9-11 Three upper and three lower extremity muscles are graded in this protocol: shoulder abduction, elbow flexion, wrist extension, hip flexion, knee extension, and ankle dorsiflexion. These muscles were chosen based on the standard approach for evaluating patients for ICU-acquired weakness used in prior publications. 1,2.

Manual Muscle Testing:  A Method of Measuring Extremity Muscle Strength Applied to Critically Ill Patients

Survivors of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and critical illness frequently develop long-lasting muscle weakness. Manual muscle testing (MMT) is a standardized clinical examination commonly used to measure strength of peripheral skeletal muscle groups. This video demonstrates MMT using the 6-point Medical Research Council scale.

수동 근육 시험 : 끝단 근육 강도를 측정하는 방법은 매우 불길한 환자에게 적용

Survivors of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other causes of critical illness often have generalized weakness, reduced exercise tolerance, ...

Evaluation of Biomaterials for Bladder Augmentation using Cystometric Analyses in Various Rodent Models

Renal function and continence of urine are critically dependent on the proper function of the urinary bladder, which stores urine at low pressure and expels it with a precisely orchestrated contraction. A number of congenital and acquired urological anomalies including posterior urethral valves, benign prostatic hyperplasia, and neurogenic bladder secondary to spina bifida/spinal cord injury can result in pathologic tissue remodeling leading to impaired compliance and reduced capacity1. Functional or anatomical obstruction of the urinary tract is frequently associated with these conditions, and can lead to urinary incontinence and kidney damage from increased storage and voiding pressures2. Surgical implantation of gastrointestinal segments to expand organ capacity and reduce intravesical pressures represents the primary surgical treatment option for these disorders when medical management fails3. However, this approach is hampered by the limitation of available donor tissue, and is associated with significant complications including chronic urinary tract infection, metabolic perturbation, urinary stone formation, and secondary malignancy4,5.
Current research in bladder tissue engineering is heavily focused on identifying biomaterial configurations which can support regeneration of tissues at defect sites. Conventional 3-D scaffolds derived from natural and synthetic polymers such as small intestinal submucosa and poly-glycolic acid have shown some short-term success in supporting urothelial and smooth muscle regeneration as well as facilitating increased organ storage capacity in both animal models and in the clinic6,7. However, deficiencies in scaffold mechanical integrity and biocompatibility often result in deleterious fibrosis8, graft contracture9, and calcification10, thus increasing the risk of implant failure and need for secondary surgical procedures. In addition, restoration of normal voiding characteristics utilizing standard biomaterial constructs for augmentation cystoplasty has yet to be achieved, and therefore research and development of novel matrices which can fulfill this role is needed.
In order to successfully develop and evaluate optimal biomaterials for clinical bladder augmentation, efficacy research must first be performed in standardized animal models using detailed surgical methods and functional outcome assessments. We have previously reported the use of a bladder augmentation model in mice to determine the potential of silk fibroin-based scaffolds to mediate tissue regeneration and functional voiding characteristics.11,12 Cystometric analyses of this model have shown that variations in structural and mechanical implant properties can influence the resulting urodynamic features of the tissue engineered bladders11,12. Positive correlations between the degree of matrix-mediated tissue regeneration determined histologically and functional compliance and capacity evaluated by cystometry were demonstrated in this model11,12. These results therefore suggest that functional evaluations of biomaterial configurations in rodent bladder augmentation systems may be a useful format for assessing scaffold properties and establishing in vivo feasibility prior to large animal studies and clinical deployment. In the current study, we will present various surgical stages of bladder augmentation in both mice and rats using silk scaffolds and demonstrate techniques for awake and anesthetized cystometry.

Surgical stages of bladder augmentation are described using 3-D scaffolds in murine and rat models. To test the efficacy of biomaterial configurations for use in bladder augmentation, techniques for both awake and anesthetized cystometry are presented.

각종 설치류 모델에 Cystometric 분석을 사용하여 방광 증원을위한 Biomaterials 평가

Renal function and continence of urine are critically dependent on the proper function of the urinary bladder, which stores urine at low pressure and ...

생체공학

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

The lower urinary tract (LUT) functions as a dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a convenient time. While storing urine, however, the bladder is exposed for prolonged periods to waste products. By acting as a tight barrier, the epithelial lining of the LUT, the urothelium, avoids re-absorption of harmful substances. Moreover, noxious chemicals stimulate the bladder's nociceptive innervation and initiate voiding contractions that expel the bladder's contents. Interestingly, the bladder's sensitivity to noxious chemicals has been used successfully in clinical practice, by intravesically infusing the TRPV1 agonist capsaicin to treat neurogenic bladder overactivity1. This underscores the advantage of viewing the bladder as a chemosensory organ and prompts for further clinical research. However, ethical issues severely limit the possibilities to perform, in human subjects, the invasive measurements that are necessary to unravel the molecular bases of LUT clinical pharmacology. A way to overcome this limitation is the use of several animal models2. Here we describe the implementation of cystometry in mice and rats, a technique that allows measuring the intravesical pressure in conditions of controlled bladder perfusion.
	After laparotomy, a catheter is implanted in the bladder dome and tunneled subcutaneously to the interscapular region. Then the bladder can be filled at a controlled rate, while the urethra is left free for micturition. During the repetitive cycles of filling and voiding, intravesical pressure can be measured via the implanted catheter. As such, the pressure changes can be quantified and analyzed. Moreover, simultaneous measurement of the voided volume allows distinguishing voiding contractions from non-voiding contractions3.
	Importantly, due to the differences in micturition control between rodents and humans, cystometric measurements in these animals have only limited translational value4. Nevertheless, they are quite instrumental in the study of bladder pathophysiology and pharmacology in experimental pre-clinical settings. Recent research using this technique has revealed the key role of novel molecular players in the mechano- and chemo-sensory properties of the bladder.

Cystometry is an efficient technique to measure bladder function of small animals in vivo. The bladder is continuously infused at rates controlled through an intravesical catheter, whereas the urethra is left free for micturition. This allows for repetitive filling and emptying of the bladder, while intravesical pressure and voided volume are recorded.

작은 쥐의 Cystometry의 사용 : 방광 Chemosensation의 연구

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Contractility Measurements of Human Uterine Smooth Muscle to Aid Drug Development

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We describe methods to measure ex vivo myometrium contractility. This assay can be used to investigate factors and molecules involved in the modulation of myometrial contraction and to determine their excitatory or inhibitory actions, and hence their therapeutic potential in vivo. Biopsies are obtained from women undergoing cesarean section delivery with informed consent. Fine strips of myometrium are dissected, clipped and attached to a force transducer within 1 mL organ baths superfused with physiological saline solution at 37 &#176;C. Strips develop spontaneous contractions within 2&#8211;3 h under set tension and remain stable for many hours (&#62;6 h). Strips can also be stimulated to contract such as by the endogenous hormones, oxytocin and vasopressin, which cause concentration-dependent modulation of contraction frequency, force and duration, to more closely resemble contractions in labor. Hence, the effect of known and novel drug leads can be tested on spontaneous and agonist-induced contractions.
This protocol specifically details how this assay can be used to determine the potency of known and novel agents by measuring their effects on various parameters of human myometrial contraction. We use the oxytocin- and V1a receptor antagonists, atosiban and SR49059 as examples of known compounds which inhibit oxytocin- and vasopressin-induced contractions, and demonstrate how this method can be used to complement and validate pharmacological data obtained from cell-based assays to aid drug development. The effects of novel agonists in comparison to oxytocin and vasopressin can also be characterized. Whilst we use the example of the oxytocin/ vasopressin system, this method can also be used to study other receptors and ion channels that play a role in uterine contraction and relaxation to advance the understanding of human uterine physiology and pathophysiology.

This article describes experimental protocols to study ex vivo contractions of human myometrium and their application in drug discovery. This technique is used to improve the understanding of myometrial physiology and pathophysiology as well as to validate pharmacological data from novel research probes or drug leads.

보조 약물 개발에 인간 자 궁 평활 근의 수축 측정

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We ...

Ultrasonography of the Adult Male Urinary Tract for Urinary Functional Testing

The incidence of clinical benign prostatic hyperplasia (BPH) and lower urinary tract symptoms (LUTS) is increasing due to the aging population, resulting in a significant economic and quality of life burden. Transgenic and other mouse models have been developed to recreate various aspects of this multifactorial disease; however, methods to accurately quantitate urinary dysfunction and the effectiveness of new therapeutic options are lacking. Here, we describe a method that can be used to measure bladder volume and detrusor wall thickness, urinary velocity, void volume and void duration, and urethral diameter. This would allow for the evaluation of disease progression and treatment efficacy over time. Mice were anesthetized with isoflurane, and the bladder was visualized by ultrasound. For non-contrast imaging, a 3D image was taken of the bladder to calculate volume and evaluate shape; the bladder wall thickness was measured from this image. For contrast-enhanced imaging, a catheter was placed through the dome of the bladder using a 27-gauge needle connected to a syringe by PE50 tubing. A bolus of 0.5 mL of contrast was infused into the bladder until a urination event occurred. Urethral diameter was determined at the point of the Doppler velocity sample window during the first voiding event. Velocity was measured for each subsequent event yielding a flow rate. In conclusion, high frequency ultrasound proved to be an effective method for assessing bladder and urethral measurements during urinary function in mice. This technique may be useful in the assessment of novel therapies for BPH/LUTS in an experimental setting.

We describe the use of high frequency ultrasound with contrast imaging as a method to measure bladder volume, bladder wall thickness, urine velocity, void volume, void duration, and urethral diameter. This strategy can be used to assess voiding dysfunction and treatment efficacy in various mouse models of lower urinary tract dysfunction (LUTD).

요로 기능 검사를 위한 성인 남성 요로의 초음파 검사

The incidence of clinical benign prostatic hyperplasia (BPH) and lower urinary tract symptoms (LUTS) is increasing due to the aging population, resulting ...

A Decentralized (Ex Vivo) Murine Bladder Model with the Detrusor Muscle Removed for Direct Access to the Suburothelium during Bladder Filling

Previous studies have established the release of chemical substances from flat bladder mucosa sheets affixed in Ussing chambers and exposed to changes in hydrostatic pressure or mechanical stretch and from cultured urothelial cells upon hydrostatic pressure changes, stretch, cell swelling, or drag forces, and in bladder lumen at end of filling. Such findings led to the assumption that these mediators are also released in suburothelium (SubU)/lamina propria (LP) during bladder filling, where they affect cells deep in the bladder wall to ultimately regulate bladder excitability. There are at least two obvious limitations in such studies: 1) none of these approaches provide direct information about the presence of mediators in SubU/LP, and 2) the stimuli used are not physiological and do not recapitulate authentic filling of the bladder. Here, we discuss a procedure that enables direct access to the suburothelial surface of the bladder mucosa in the course of bladder filling. The murine detrusor-free preparation we created closely resembles filling of the intact bladder and allows pressure-volume studies to be performed on the bladder in the absence of confounding signaling from spinal reflexes and detrusor smooth muscle. Using the novel detrusor-free bladder model, we recently demonstrated that intravesical measurements of mediators cannot be used as a proxy to what has been released or present in the SubU/LP during bladder filling. The model enables examination of urothelium-derived signaling molecules that are released, generated by metabolism and/or transported into the SubU/LP during the course of bladder filling to transmit information to neurons and smooth muscle of the bladder and regulate its excitability during continence and micturition.

A Decentralized Ex Vivo Murine Bladder Model with the Detrusor Muscle Removed for Direct Access to the Suburothelium during Bladder Filling

The detrusor-free bladder model enables direct access to the suburothelium to study local mechanisms for regulation of biologically active mediator availability in suburothelium/lamina propria during storage and voiding of urine. The preparation closely resembles filling of an intact bladder and allows pressure-volume studies to be performed without systemic influences.

방광 충진 중 수부에 직접 접근할 수 있도록 제거된 분리기 근육이 있는 분권화된(Ex Vivo) 뮤린 방광 모델

Previous studies have established the release of chemical substances from flat bladder mucosa sheets affixed in Ussing chambers and exposed to changes in ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

약리학 연구에 고립 된 조직 목욕-애플리케이션에서 부드러운 근육 기능의 측정

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

생물학

In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

ATP, released from the urothelium in response to bladder distension, is thought to play a significant sensory role in the control of micturition. Therefore, accurate measurement of urothelial ATP release in a physiological setting is an important first step in studying the mechanisms that control purinergic signaling in the urinary bladder. Existing techniques to study mechanically evoked urothelial ATP release utilize cultured cells plated on flexible supports or bladder tissue pinned into Ussing chambers; however, each of these techniques does not fully emulate conditions in the intact bladder. Therefore, an experimental setup was developed to directly measure ATP concentrations in the lumen of the rodent urinary bladder.
In this setup, the bladders of anesthetized rodents are perfused through catheters in both the dome of the bladder and via the external urethral orifice. Pressure in the bladder is increased by capping the urethral catheter while perfusing sterile fluid into the bladder through the dome. Measurement of intravesical pressure is achieved using a pressure transducer attached to the bladder dome catheter, akin to the setup used for cystometry. Once the desired pressure is reached, the urethral catheter's cap is removed, and fluid collected for ATP quantification by luciferin-luciferase assay. Through this experimental setup, the mechanisms controlling both mechanical and chemical stimulation of urothelial ATP release can be interrogated by including various agonists or antagonists into the perfusate or by comparing results between wildtype and genetically modified animals.

In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

This protocol describes the procedure for measuring ATP concentrations in the lumen of the bladder in an anesthetized rodent.

생체 내 설치류에서 팽창 유발 요로 상피 ATP 방출의 내강 측정

ATP, released from the urothelium in response to bladder distension, is thought to play a significant sensory role in the control of micturition. ...

Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents

Detrusor smooth muscle (DSM) cells present within the urinary bladder wall ultimately facilitate urine storage and voiding. Preparation of the viable, fresh, and isolated DSM cells presents an important technical challenge whose achievement provides optimal cells for subsequent functional and molecular studies. The method developed and elaborated herein, successfully used by our group for over a decade, describes dissection of human urinary bladder specimens obtained from open bladder surgeries followed by an enzymatic two-step treatment of DSM pieces and mechanical trituration to obtain freshly isolated DSM cells. The initial step involves dissection to separate the DSM layer (also known as muscularis propria) from mucosa (urothelium, lamina propria, and muscularis mucosa) and the adjacent connective, vascular, and adipose tissues present. The DSM is then cut into pieces (2-3 mm x 4-6 mm) in nominal Ca2+-containing dissection/digestion solution (DS). DSM pieces are next transferred to and sequentially treated separately with DS containing papain and collagenase at ~37 &#176;C for 30-45 min per step. Following washes with DS containing enzyme-free bovine serum and trituration with a fire-polished pipette, the pieces release single DSM cells. Freshly isolated DSM cells are ideally suited for patch-clamp electrophysiological and pharmacological characterizations of ion channels. Specifically, we show that the TRPM4 channel blocker 9-phenanthrol reduces voltage-step evoked cation currents recorded with the amphotericin-B perforated patch-clamp approach. DSM cells can also be studied by other techniques such as single cell RT-PCR, microarray analysis, immunocytochemistry, in situ proximity ligation assay, and Ca2+ imaging. The main advantage of utilizing single DSM cells is that the observations made relate directly to single cell characteristics revealed. Studies of freshly isolated human DSM cells have provided important insights characterizing the properties of various ion channels including cation-permeable in the urinary bladder and will continue as a gold standard in elucidating DSM cellular properties and regulatory mechanisms.

We describe a method for preparation of the single freshly isolated detrusor smooth muscle cells from human urinary bladder specimens employing a two-step enzymatic procedure. The obtained viable DSM cells can be studied by various single cell techniques including the described amphotericin-B patch-clamp electrophysiology to reveal physiological and pharmacological properties.

9-페난트롤에 민감한 양이온 전류의 특성화를 위해 갓 분리된 인간 분리기 평활근 세포의 준비 및 활용

Detrusor smooth muscle (DSM) cells present within the urinary bladder wall ultimately facilitate urine storage and voiding. Preparation of the viable, ...