Name: measurement of smooth muscle function in the isolated tissue bath-applications to pharmacology research
Uploaded: 2015-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
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The Watts Laboratory through the years, and Dr. Marlene Cohen and Kathy Schenck for teaching us this assay over two decades ago. NIGMS R25GM074119 supported development of this teaching module for a Short Course in Integrative and Systems Pharmacology held on the campus of MSU from 2005 to 2013.

참고 :이 문서에 설명 된 모든 절차가 미시간 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 설립 지침에 따라 수행된다. 1. 시스템 준비 및 설정 <ol><li> 50 ㎖ 티슈 화장실까지 사용 조직 조 수축 실험에 필요한 양이 생리 식염수 (PSS) 5 L의 확인; PSS 조리법에 대한 표 2를 참조하십시오. 필요한 조직 세척의 숫자로 곱한 후 조직 화장실의 수 배에 목욕 볼륨을 곱에 의해 필요한 총 부피를 계산합니다. <ol><li> PSS을 지침으로 표 2를 사용합니다. 물 약 4 L의 염을 녹여. 참고 : HPLC - 유형 I 물을 권장합니다 </li><li> 엔드 솔루션 1.6 mM의 칼슘 그래서,이 용액에 (이수화 염을 사용하는 경우 147g / L) 1 M CaCl2를 솔루션 8 ML을 추가합니다. </li><li> 5 L.에 양자 sufficit PSS 솔루션 </li></OL&gt; </li><li> 순환 온수 목욕을 설정하여 37 ° C로 조직 목욕 시스템을 예열한다. 중요한 단계 : 시스템의 각 구성 요소들이 서로 직렬로 연결되어 있는지 확인, 물 재킷이다. 흐름의 방향은 중요하다 - 가장 높은 가시 연결에 가장 낮은 가시 연결에서 밖으로 각 구성 요소에 물 흐름을 보장합니다. </li><li> 데이터 수집 시스템을 켭니다. 실험 전에 힘 트랜스 듀서 적어도 15 분에 전원 온도를 평형합니다. 주 : 대부분의 힘 센서가 온도 변화에 민감하고 전원이인가 된 후 처음 열 드리프트를 전시 스트레인 게이지를 사용합니다. </li><li> 실행 데이터 수집 소프트웨어 및 데이터 수집 시스템과의 연결을 보장한다. 데이터 기록을 가능하게하는 제조 지침을 따르십시오. </li><li> 힘 센서가 조직이 조직 조 및 데이터 기록이 시작되기 전에 배치되기 전에 교정해야합니다; FO교정 llow 제조사의 지시. </li><li> 95 %, O2 / 5 % CO 2 의료용 가스 실린더에 조직 목욕 시스템을 연결하고 가스 누출을 점검 한 다음 시스템을 가압. </li><li> PSS와 조직 조 저수지 채우고 용액 시간은 최적 온도에 도달 할 수있다. 프라임 시스템 및이 시스템 및 튜브 내의 기포를 제거한다. </li><li> PSS 버퍼에 산소와 실험 기간 동안 조직 조에서 소개 될 예정 약물을 배포하는 브라운 운동을 제공 일관된 솔루션 폭기를 보장하기 위해 조직 목욕 폭기 장치를 확인합니다. 확인 폭기 / 거품 데이터 레코딩을 중단 할 조직의 움직임을 유발하지 않는다; 필요에 따라 가스 흐름을 감소시킨다. 참고 : 조직 목욕 및 데이터 수집 시스템은 이제 실험을 시작할 수 있습니다. </li></ol> 2. 조직 준비 <ol><li> 이상적으로, 동물에서 조직을 해부 직전에 사용하고 내가 직접 배치NTO PSS. 참고 : 일부 조직은 4 ° C에서 하룻밤 PSS에 저장 될 수 있지만, 적절한 컨트롤을 장기간 보관 후 조직의 기능을 검증하기 위해 수행해야합니다; 6 절을 참조하십시오. </li><li> 이 운동의 조직으로 흉부 대동맥을 사용합니다. </li><li> 제도적 지침에 따라 쥐를 마취 아래로 쥐의 등쪽을 배치합니다. 발가락 핀치이 고통스러운 자극에 대한 반사 반응의 손실을 통해 마취를 확인합니다. 참고 :이 프로토콜은 복강 내 주사를 통해 전달 펜 토바 비탈의 70 ㎎ / ㎏을 사용합니다. 쥐 마취에 대한 제도적 지침과 다를 수 있습니다. </li><li> 흉곽의 하단에있는 진동판을 따라 가위로 절개를 작성하여 기흉을 만듭니다. 그런 다음, 흉골에 흉곽의 바닥에서 절개를 계속 양분. </li><li> 멀리 해부 또는 척추의 상단에있는 그 장기를 따로 배치하고 척추를 따라 직접 거짓말 대동맥을 찾습니다. 참고 :이 STEP는 대동맥을 해부 할 수있는 충분한 작업 공간을 제공합니다. </li><li> 대동맥에 대한 모든 연결을 끊다; 및 식도, 폐, 등에서 진동판의 수준에서 척추에 수직 대동맥을 잘랐다. </li><li> 부드럽게 집게로 대동맥을 잡고 척추에서 대동맥을 해부 가위를 사용합니다. 심장을 향해 척추와 작업에 인접한 낮은 조리개 영역에서 해부를 시작합니다. 조직에 손상을 줄 수 있습니다 대동맥 조직에 추가 당기지하기 위해 예방 조치 또는 예인선을해야합니다. </li><li> 즉시 PSS를 포함하는 준비된 해부 접시에 대동맥을 배치합니다. 참고 : 반지에 대동맥의 해부 가장 검은 실라 스​​틱 기반을 가지고 해부 접시에 이루어집니다. 이는 해부 접시에 안정성을 제공하면서, 대동맥 cannulate하고 접시에 체결 될 수있다 와이어의 사용을 허용한다. 검은 배경 해부 에이즈 대비를 제공합니다. 케어는 내피로 cannulating 와이어의 사용에주의가 필요합니다원점이라 세포층 용기의 와이어 루멘에 대해 과량의 마찰에 의해 제거 될 수있다. </li><li> 와이어를 타고 한 쪽 끝에 작은 90 ° 각도를하고 가이드 와이어를 고정하기 위해 실라 스​​틱 기반에 각진 끝을 밀어 넣습니다. 해부 접시에 전체 대동맥를 놓습니다. </li><li> 집게와 가이드 와이어의 끝을 잡고 부드럽게 대동맥의 루멘에 와이어를 스레드. </li><li> 집게를 사용하고 와이어에 대동맥을 밀어 넣습니다. 가이드 와이어의 자유 단부는 볼 곡선 부드럽게 와이어이며 조직을 안정화시키기 위해 접시의 실라 스​​틱 파운데이션에 자유 단을 배치하는 경우. </li><li> 흉부 대동맥은 흰색과 다소 섬유 나타날 때까지 작은 vannas 가위와 집게를 사용하는 등 혈관 주위 지방 조직과 다른 모든 관계없는 조직, 혈전을 제거합니다. </li><li> 와이어에서 청소 대동맥을 제거하고 폭 약 3-5mm이다 반지의 대동맥을 잘라 가위를 사용합니다. </li><li> TI의 쌍 중 하나에 대동맥 고리를 배치후크를 잡고 부드럽게 후크 위에 반지를 슬라이드 집게를 사용하여 ssue 후크. 두 번째 훅이 과정을 반복합니다. 복잡하게 얽힌하지 않는 후크를 보장하기 위해주의; 그림 3 참조. </li><li> 각 후크가 부착 된 다른 실크 봉합사를 가지고 있는지 확인하십시오. 다른 손으로 묶여 힘 변환기에있을 것입니다 10-4cm 긴 조각 봉합 동안 하나의 후크, 유리 또는 스테인리스 스틸 막대에 부착을 허용 실크의 작은 매듭 루프를 가지고 있는지 확인; 그림 3 참조. 주 : 대동맥가 후크 고정되면, 조직은 조직 조 내에 장착 될 준비; 그림 3 참조. </li><li> 반복하여 두 번째 조직 목욕 실에서 제 대동맥 고리를 탑재, 2.14-2.15 단계를 반복합니다. </li></ol> 목욕 3. 조직 배치 <ol><li> 이 시스템에서, 조직 화장실 자체가 고정되어 있습니다. 이 때, 그리고 온도에 와서 솔루션을 따뜻하게, 폭기 PSS와 조직 화장실을 채우기 허용전자. </li><li> 실크 봉합사로, 스테인리스 스틸 막대에 말뚝에 조직 준비의 고리 중 하나를 묶어. 조직 목욕 챔버로이 끝을 놓습니다. 링 스탠드에로드를 연결하고 버퍼에 몰입 조직을 유지하기 위해 PSS 가득 염색 접시에 다른 쪽 끝을 배치; 그림 3 참조. <ol><li> 조직 목욕 챔버에서로드와 조직을 배치하고 조직이 완전히 PSS에 침지하고로드가 안전해야합니다; 그림 3 참조. </li><li> 힘 변환기에 다른 봉합을 묶어 조직과 힘 센서 사이의 봉합에 느슨하게해야합니다. 참고 :이 느슨 마이크로 미터를 조정하여 제거됩니다; 그림 3 참조. </li></ol></li><li> 두 번째 대동맥 링과 조직 조 챔버에 대해 이러한 단계를 반복합니다. </li></ol> 4. 수동 장력 설정 주 : 각 조직은 평활근 세포가 OPTIMA 응답하는 길이 (LO)가에서야. 예비 실험은 각각의 조직 유형에 대해 수행되어야이 길이 검사 할 달성 최적 연신 장력을 결정한다. 쥐 흉부 대동맥 4g의 최적의 수동적 스트레칭 긴장이있다. <ol><li> 2g에 장력을 증가시키고 고원 도달하는 조직 기다릴 마이크로 미터 / 랙과 피니언을 사용한다. 고원에 도달하면, 긴장 또 다른 2g을 높이고 고원에 조직을 기다립니다. 참고 : 2g의 초기 장력이 설정 고원에 도달 한 후 대동맥 고리에서, 조직은 다음 ~ 1.6 g에 휴식을 취한다. 2g의 두 번째 응용 프로그램은 ~에 조직이 다시 긴장하고 긴장이 감소되는 3.6 g을, 조직을 가져올 것입니다. 따라서, 총 장력 4g을 첨가 한 후, 소프트웨어는 장력의 약 3.2 g을 나타내야한다. </li><li> 두 번째 대동맥 링과 조직 조 챔버에 대해 이러한 단계를 반복합니다. </li></ol> 5. 평형의 약국 만들기 <ol><li> 의 조직을 평형조직에 수동적 긴장을 적용한 후 60 분. </li><li> 평형 단계에서 조직마다 15 ~ 20 분을 씻는다. 조직 목욕을 배출하고 따뜻하게 저수지에서 PSS와 PSS를 교체합니다. 주 :이 시간 동안, 조직을 수동 장력의 손실에 의해 지시되는, 긴장한다. </li><li> 이 시간 동안, 그래서 약물 콘텐츠의 단지 소량이 원하는 농도를 달성하기 위해 필요한, ​​욕중의 실제 농도보다 적어도 1000 배 더 집중 될 필요가 실험 약물을 준비한다. </li></ol> 6. 초기 도전 <ol><li> 평형 기간의 끝에서, 조직을 한 번 씻어 최종 데이터를 저장하고, 모든 입력을 다시 제로. </li><li> 조직이 응답되는 (활성 수축의 원인이됩니다 화합물) 작용제를 선택합니다. 주 : 래트 흉부 대동맥, 동맥 평활근 적극적 기인의 신경 분포에 알파 아드레날린 수용체 작용 물질로 수축한다교감 신경계에 의해 조직. 아드레날린 작용제 아드레날린 작용제 휴식의 원인이 주어진 장 조직에서 유용하지 않을 것입니다. 이 경우, 아세틸 콜린 (콜린성 수용체)와 같은 수용체 작용제이 사용될 수있다. 페닐에 아세틸 콜린 양에 대한 대안은 상기 제 1 도전 높은 칼륨 (K) 등의 비 - 수용체 작용제를 사용하는 것이다. 평활근에서 높은 K 간접적으로 열린 칼슘 채널을 운영하고 있으며, 따라서 평활근의 무결성의 일반적인 지표로 볼 수 있습니다. <ol><li> 조직 조 10 -5 M 페닐에 추가하여 첫 번째 과제 또는 웨이크 업 과제를 수행합니다. 50 ml의 조직 조에서이 농도를 달성 10-2 M 페닐에 솔루션의 50 μl를 추가합니다. 주 : PSS 50 ㎖에 50 μl의 최종 농도는 스톡보다 1000 배 더 적은 정도로, 1 / 1000 희석, 또는 10-5 M. 조직 목욕 C 내에서 볼륨과 볼륨의 일관성 유지 보수 기술hamber 최종 약물 농도를 결정하는 단계에 중요하다. </li></ol></li><li> 데이터의 기울기가 제로가되면 조직 조에 10-5 M 페닐에 추가하고 다음 피크 고원 수축을 허용한다. 사후 실험 분석을 돕기 위해 각 실험 이벤트를 기록해야합니다. </li><li> 고원 후 비우고 새로운 PSS와 조직 목욕 챔버를 보충에 의해 철저하게 작용 물질을 세척 할 것. 뿐만 아니라 이러한 이벤트를 기록해야합니다. 참고 : 엄지 손가락의 규칙은 목욕 작용제의 농도가 각각 세척으로 10 배 감소한다는 것입니다. 이상 3-4 세척이 필요할 수 있지만 아래로 다시 평형 기준 톤 (긴장)에 조직을 가지고있다. </li><li> 진행하기 전에 ~ 10 분 동안 기준 톤에서 조직의 나머지 부분을 보자. </li></ol> 7. 실험 주 : 프라 조신, 알파 아드레날린 수용체 길항제는 농도 RESP를 시프트 조직 조 챔버에 도입 될온세 곡선 페닐에 (PE)에; 이것은 명백한 적대입니다. <ol><li> 한 목욕 차량을 추가 (H 2 O)하는 프라 조신이 용해시켰다. 다른, 프라 조신의 적절한 농도를 추가합니다. 이 경우, 5 × 10-9 M 또는 욕실에서 5 nM의 농도를 달성하기 위해 다른 하나의 욕 차량의 25 μL 프라 조신과의 10 -5 M 농도의 25 μL를 추가한다. 주의 : 차량의 첨가 본 실시 예에서는 불필요 해 보이지만 혈관 작용 될 전위 (예를 들면, DMSO, 에탄올, 아세트산)가 다른 차량을 사용할 때, 그렇게하는 것이 필수적이다. 이 혈관에 작용하는 수에 대한 증거가있는 경우에도 해당 차량을 추가합니다. </li><li> 화장실에서 차량 / 프라 조신을두고 1 시간 동안 조직을 씻어하지 않습니다. <ol><li> 조직을 균등화하는 동안, 작용제 (PE)의 여러 농도를 준비합니다. 예를 들어, &lt;더 반응을 유도하지 농도 (농도에서 광범위한 포함/ 최대 응답 (능가 농도 EM&gt; 10 -9 M PE) 예를 들어, 10 -4 M PE). 농도 - 반응 곡선은 10 -1 M 주식 솔루션에서 PE의 여섯 별도의 원액 (10-6 -10 -1 M) 연속 희석을 통해을, 자연 로그 때문에. 각각의 농도에 필요한 볼륨이 모든 화장실 (예&gt; 300 μL)에 필요한 트리플 전체 부피보다 약간 더 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 표 1에 기재된 바와 같이 작용제를 추가로 계속. 참고 :이 실험은 PE하는 누적 농도 반응 곡선을 생성합니다; 각각의 반복은 계정에 이미 목욕에 추가 물질의 양을합니다. 더 이상 수축을하지 않을 때까지 추가 증가가 발생하거나, 전체 곡선은 plateaued있다. <ol><li> 티슈 (threshold)에 도달 될 때까지 개별적으로 약물 농도를 추가한다. </li><li> 아무런 변화가 발생하지 않으면, 다음의 농도를 추가시리즈; 표 2를 참조하십시오. 참고 : 이러한 추가의 타이밍이 사용 작용제에 따라 달라집니다. 예를 들어, 노르 에피네프린과 페닐에 수축이 빠르게 개발하고 분 이내에 고원해야합니다. 이와는 대조적으로, 엔도 텔린 1 수축은 천천히 개발하고 가까운 45 분 동안 고원하지 않을 수 있습니다. 다른 실험만큼, 이와 같은 곡선의 형성 후에 조직에서 수행 될 수있다 (1) 밖으로 세척 물질; 및 (2)는 정상적인 조직 수축성 동작으로 복귀하고 이전 자극의 영향을받지 않는 것으로 입증 될 수있다. </li></ol></li></ol> 8. 데이터 분석 <ol><li> 이전과 개입 직후에 데이터를 저장해야합니다 (예를 들어, 웨이크 업 또는 전체 곡선). </li><li> 찾기 및 데이터 분석에 도움이 각 조직 조 챔버 / 입력 채널에 대한 조직의 기준을 설정합니다. </li><li> 기준이 설정되면, 각각의 농도에 대한 최대 응답을 발견하고, 찬 기록기준선에서 GE. 순차적으로 농도의 각을 통해 이동하고 기준선 이동을 기록합니다. </li><li> 결과 데이터를 그래프입니다. 어떤 그래프 프로그램에서이 작업을 수행합니다. 참고 : 그래프 패드 프리즘이 약리학을 위해 설계, 이것은 여기에 제시된 실험의 종류에 이상적입니다. </li></ol>

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Authors have nothing to disclose.

연구 도구로 아이소 메트릭 힘의 측정은 150 세 이상이지만, 수축 조직 2 수용체의 특성에 대한 프로토 타입 기술되고 있습니다. 이 기술의 힘은 단순함과 다양성에있다 : 길항제의 존재 또는 부재 하에서 작용 물질의 농도를 증가시킴으로써 유도 반응을 기록함으로써, 정보의 무수한 각 약물의 약리학 적 특성 및 수용체에 대해 유도 될 수있는 그것은 3-5을 결합한다. 이러한 유형의 실험이 또한 사용될 길항제 비경쟁 자연 대 경쟁에 대한 정보뿐만 아니라, 수용체 얼룩이 비특이적 약효 6-8 가너. 따라서,이 절연 조직 조 간단한 실험으로 치환 작용제 - 유도 된 근육 수축을 매개하는 수용체의 약리학 비교적 완전한 프로파일을 생성 할 수있다. 효능 작용의 측면에서, 제해당 조직에서 작용제의 전자 상대 효능 (E MAX)과 힘 (EC 50) 같은 조직 한 다른 작용제의 응답에 비해 계산 될 수있다. 우리의 실험에서는, 래트 흉부 대동맥 비히클 또는 종래 수축을 조직 조에 α 1 아드레날린 작용제 페닐에 첨가하고 생성 한 시간 동안 α 1 아드레날린 수용체 길항제 프라 조신 (5 ㎚) 중 하나와 함께 배양 하였다. 수정 된 결과를 두 선물 도표 녹색 응답이 최대로 표시 PE에 의해 달성의 최대 수축으로 표시 한 그림 1의., ½ 최대 수축하게 표시하고 응답하는 것이 원인이 된 PE 농도와 관련. 이러한 값을 식별하는 것은 반 최대 (50 %) 반응 또는 EC (50) 값을 달성 작용제의 유효 농도를 식별한다. 불행하게도, 작용제에 의존하는 매개 변수를 사용하여수용체 결합 특성이 9 복잡 할 수 있습니다 결정하기 위해 혼자에요. 상수 길항제 해리 PK (B)의 -log 10 몰 길항제 -log 10 : 이상적으로, 수용체 길항제를 사용하여 추가 실험은 약물과 수용체 사이의 상호 작용을 정의하는 중요한 두 가지 중요한 파라미터들의 계산을 허용 필요한 농도의 농도 - 반응 곡선에서 두 배의 우측 시프트 (PA (2)) (10)을 유도한다. K 및 PA B 2 이득들이 작용제 독립적 값이며, 심지어 다른 조직 (11) 사이에 일정하게 유지된다는 사실로부터 유용성 양쪽 모두. 다른 계산 된 값 (50)을도 2의 데이터로부터 약동학 B는 다음 방정식을 이용하여 계산 될 수 있고, EC에 기초 : = 2 × 10-8 M 프라 조신의 부재하에 50 EC 사전에 EC (50)프라 조신의가 나타나지 않는 = 7 × 10 -6 M 다음의 수학 식 B에 K를 풀 : 로그인 (DR-1) = [B] 로그 - K B 로그 장소 : [B]는 길항제 농도 = 5 X 10-9 M. 로그인 (5 × 10-9 M) = -8.3 박사 = 없을 길항제 / EC (50)의 존재 EC 50 값의 용량 비율. 우측 시프트가있는 경우,이 값은 1보다 클 것이다. 따라서 : 박사 = 7 × 10 -6 M / 2 × 10 -8 M 700 × 10 -8 M / 2 × 10 -8 M = 2분의 700 = 350 [B]와 박사를 대체 : K B를 기록 - = -8 (350-1)를 기록 2.54 = -8 - KB 로그 의 pKa B = 10.54 프라 조신은 α 1 아드레날린 RECEPT와 상호 작용할 때 프라 조신이 값은 얻은 값과 일치페닐에 프린에 수축을 매개 아드레날린 수용체 α 1 아드레날린 수용체임을 제안 또는 12,13. 몇 가지 단계는이 실험의 성공에 매우 중요합니다. 조직은 조직의 생존력 상실을 방지하기 위해 박리 후 남아 있어야 PSS. 모든 아이소 메트릭 근육 준비 수동 장력 (14, 15)에 대해 최대한의 힘을 생성하는 최적의 길이 긴장 관계를 가지고있다. 이 프로토콜에서 설명하는 실험에서, 최적의 수동 장력 티슈는 이전에 수동 장력 0.5 g의 잠깐 씩 첨가하여 결정 하였다. 조직 톤없이 시작해야하고 평형의 30 분 후, 조직 활성 톤 생성의 KCl (80 mM)을 최대의 농도로 도전되었다. 이어서, 조직을 세척하고, 기준 계조로 복귀시켰다. 기준선에서 15 분 후, 수동 장력의 또 다른 0.5 g을 넣고,이 프로세스의 고원까지 반복활성 장력을 추가 수동 긴장을 달성했다. 예비 실험에서, 수동 장력 4g 총량 대동맥에서 최대 활성 장력 발생을 달성하도록 결정하고, 따라서 장력의 총량이 이전에 평형화 고리 상에 배치된다. 절차 적으로, 이는 종래 수동 장력 애플리케이션을 제로로 최선이지만, 실험 전에 언제든 수행 될 수있다. 실험 또는 해부 어느 시점에서, 조직을 스트레칭 오버, 부정적인 조직의 생존과 실험 결과에 영향을 미칠 것입니다. 이 단계는 과량 신축성 높은 가능성을 갖는 한, 조직 욕에 배치 할 때 가장 필수적이다. 수와 기간에 적절한 세정, 재현 효과를 위해 필요합니다. 두 번째 문제는 너무 빨리 조직이 기준 긴장 돌아왔다 초기 접종 후, 또는 그 이전에, 비정상적인 반응 발생합니다. 가역 길항제 / 저해제를 공부하는 경우, 조직은 inhibi로, 추가 작용제하기 전에 세척하지 마십시오토르 농도는 감소 될 것이다. 분리 된 조직 목욕 분석에 주목할만한 장점과 단점이 있습니다. 단점 : 조직은 후크 고리의 제거 수술 또는 배치하는 동안 손상의 다른 정도가 발생할 수 있습니다. 내피 세포의 환상 대동맥의 내벽이 때문에 전지 층을 손상시키지 않도록주의가 후크 고리의 위치에주의해야한다. 조직들은 또한 조직 조에서 생존하는 시간의 뚜렷하게 상이한 길이를 가질 수 있고,이 결정되어야한다; 모든 조직은 동일하다. 이와 더불어, 조직은 시간이 컨트롤은 모든 실험 필요한 제어가되도록 하루 종일 자신의 응답에서 변경 될 수 있습니다. 이것의 좋은 예는 전형적인 8 시간의 실험 기간 동안 100 %에 의해 수축력 최대로 향상 기니피그 기관이다. 물에 난 용성이다 마약 PSS에 침전 수 있습니다. 마지막으로, 누적차 효능에 대한 수용체의 탈감작이 발생하는 경우 작용제는 다른 결과를 초래할 수있는 약물의 비 누적 추가; 안지오텐신 II는 빠른 과내를 보여줍니다 하나의 약물이다. 장점 : 조직 조 실험의 주요 이점 중 하나는 실시간이라는 것이다; 그것은 전개하고 신속하게 결론을 확인하고 실험 기간 동안 다음 단계뿐만 아니라 문제 해결을 계획 할 수 있습니다으로 한 실험을 볼 수 있습니다. 실험은 할 수있는 일이 걸립니다. 여러 조직은 통상적 동물 자체 조절 역할을 할 수 있도록 하나의 동물에서 제조 될 수 있으며, 그 강도를 실험에 추가한다. 약물 조직의 비교적 순수한 응답을 테스트하도록 하나는 다른 요소로부터 조직을 분리 할 수있다. 그러한 조직 조 시스템과 같은 시험 관내 실험은 생체 내 실험과 비교하여 약물의 적은 양의 사용을 허용한다. 본원에 기재된 염기성 실험 설계가 될 수광범위하게 추가 매개 변수의 기록 또는 다른 외부 자극의 도입을 허용하도록 수정했습니다. 예를 들어, 전극의 첨가는 근에 분포하는 신경 16,17의 전기장 자극 허용한다. 열이나 산도 프로브의 추가로, 수축 온도에 응답하여 pH의 영향도 18,19를 측정 할 수있다. 이와 유사하게, 산소는 부분적으로 또는 저산소증 유도 효과를 평가하기 위해 N이 전체에서 대체 할 수 있습니다. 또한,이 비디오에 사용 된 아이소 수축력 측정의 기본 원칙은 동일한 세포 내 칼슘 20 등척성 장력 개발 및 변경을 허용 수반 측정 시스템을 개발하는데 사용될 수있다. 그 시스템은 빠르게 반응 동안 조직 샘플을 고정 할 수있는 신호 변환 이후도 용이하게 검토되고, 신호 전달 경로 시스템의 생화학 적 활성을 검증 할 수 있도록. EQU의 변화이 작업을 수행하는 데 사용할 수 있습니다 ipment은 거대하다. 이 모든 시스템 구성 또는 자동 양손은 여러 다른 회사에서 구입하실 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 조직 화장실 조직 홀더는 사내 미시간 주립 대학 기계 상점에 의해 손으로 날려 (조직 화장실)과 손 건설 (홀더)이었다.

약리학 분야는 150 년 이상 격리 된 조직 목욕 시스템을 사용하고있다. 이 시스템의 범용성은 고혈압, 심장 부전, 당뇨병, 위장 질환, 방광 질환 또는 장애를 가진 수백만 명의 개인을 치료 한 요법의 기초를 형성하는 이러한 지식으로, 수용체 및 수용체 신호 전달을 특성화하기 위해 전세계 과학자 허용했다 장애, 천식, 연하 장애, 몇 가지 이름. 이 조직은 조직의 기능을 할 수 있습니다로이 날을 위해, 고립 된 조직 목욕, 신약 개발 및 기초 연구의 중요한면을 남아있다. 이 주피터 과정에서는 공식적인 프로토콜은 수용체의 특성을 허용 아이소 메트릭 수축을 측정하는 격리 된 조직 목욕 실험의 데이터를 이용하여 시각 및 가상 실험을 설명하기 위해 공유됩니다. 이 기술의 주요 장점은 조직 생활된다는 것이다몸에 관련된 생리 학적 결과 (수축 또는 이완)와 전체 조직으로 차 기능. 이 단계 (약물 - 수용체 상호 작용, 신호 전달, 두 번째 메신저 세대, 평활근의 흥분의 변화, 조직 기능의 변화)의 합성이다. 다른 기술은 이러한 각 단계의 연구 (예, 방사성 리간드 약물 친 화성, 두 번째 메신저의 측정에 대해 구속력을) 할 수 있지만, 분리 된 조직 조 기술은 이러한 모든 단계를 하나의 통합 할 수 있습니다. 또 다른 장점은 조직의 기능을 유지하는 셀룰러 설정 대 조직에 더 의미가있는 중요한 약물 학적 변수의 계산을 허용한다는 것입니다; 이 조사 된 약물이 전체 몸에서 어떻게 작동하는지에 가까운 온다.

<table><tbody><tr><td>LabChart Software</td><td>ADInstruments</td><td></td><td>7.2</td></tr><tr><td>PowerLab (4 channel)&amp;nbsp;</td><td>ADInstruments</td><td>ML760</td><td></td></tr><tr><td>QuadBridge (4 channel)</td><td>ADInstruments</td><td>ML112</td><td>ML112</td></tr><tr><td>Grass Adapter Cable</td><td>ADInstruments</td><td>MLAC11</td><td>MLAC11</td></tr><tr><td>Grass Force-displacement Transducer</td><td>Grass Instrument Co</td><td>FT03</td><td>FT03</td></tr><tr><td>Grass Transducer Cable</td><td>Grass Instrument Co</td><td>TAC-7 REV-1</td><td></td></tr><tr><td>BNC to BNC Cable</td><td>ADInstruments</td><td>MLAC01</td><td></td></tr><tr><td>IsoTemp 2100</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>IC-2100</td></tr><tr><td>Tissue Bath</td><td>Multiple Sources&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Physiological Salt Solution</td><td></td><td></td><td>PSS</td></tr><tr><td>Braided Silk Suture</td><td>Harvard Apparatus</td><td>51-7615</td><td>SP104</td></tr><tr><td>Ring Stand</td><td>Humboldt MFG Co</td><td>H-2122 7</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Dishes</td><td>Handmade with Silicone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>VWR Scientific</td><td>63010-100</td><td>R-3603</td></tr><tr><td>Hose Clamps</td><td>Cole-Parmer Instrument Co</td><td>06832-08</td><td>SNP-8</td></tr><tr><td>50 ml Muscle Bath</td><td>Eberhartglass Blowing</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Warming Chambers</td><td>Eberhartglass Blowing</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Gas Dispersion Tube</td><td>Ace Glass</td><td>7202-06</td><td>7202-02</td></tr><tr><td>Micrometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Custom Stands</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Three-prong Clamps</td><td>VWR International</td><td></td><td>Talon</td></tr><tr><td>S-connector</td><td>VWR International</td><td></td><td>Talon</td></tr><tr><td>Tissue Hooks</td><td>Hand Made in House</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Dissection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Stereomicroscope MZ6</td><td>Leica</td><td></td><td>10447254</td></tr><tr><td>Stereomaster Microscope Fiber-optic Light Source</td><td>Fisher Scientific</td><td>12562-36</td><td>12562-36</td></tr><tr><td>Culture Petri Dish</td><td>Pyrex</td><td></td><td>7740 Glass</td></tr><tr><td>Sylgard Silicone Elastomer</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 170 Kit</td></tr><tr><td>Vannas Scissors</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co</td><td>160-150</td><td>160-150</td></tr><tr><td>Splinter &amp;amp; Fixation Forceps</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co</td><td>160-55</td><td>160-55</td></tr></tbody></table>

measurement of smooth muscle function in the isolated tissue bath-applications to pharmacology research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

효능 작용의 관점에서, 소정의 조직의 상대적인 작용제 효능 (E MAX) 및 효능 (EC 50)는 계산과 같은 조직 한 다른 작용제의 반응과 비교 될 수있다. 우리의 실험에서는, 래트 흉부 대동맥 비히클 또는 종래 (도 1)을 조직 조에 α 1 아드레날린 작용제 페닐에 추가 및 수축을 발생시키는 1 시간 동안 α 1 아드레날린 수용체 길항제 프라 조신 (5 ㎚) 중 하나와 함께 배양 하였다. 그림 2 선물는도 1의 결과를 수정했습니다. 녹색 응답은 PE에 의해 달성의 최대 수축 반응하는 것이 원인이 최대, ½ 최대 수축 등으로 표시 한 후 PE 농도와 연관로 표시 표시했다. 이러한 값을 식별하는 것은 반 최대 (50 %) 반응을 달성하거나 EC 작용제의 유효 농도를 식별하는 것이다 <sUB&gt; (50) 값입니다. 이 S 자형 곡선 물류 기능 EC 50 값의 커브 피팅 및 계산에 사용할 수있는 사용이 example.Computer 소프트웨어에서 donegraphically했다. 생성하고 이러한 결과를 해석에서, 농도 - 반응 곡선을 작성하는 작용제 낮고 높은 농도를 사용하는 것이 중요하다. 충분히 안정된 점 기준과 최대 고원을 표시하지 않고, EC (50) 및 E MAX는 추정 될 수있다. 이이 예에서는 그래픽으로 이루어졌다. S 자형 곡선 로지스틱 함수를 사용하는 컴퓨터 소프트웨어는 EC (50)의 커브 피팅 값과 계산에 사용될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig1highres.jpg" /> 그림 1 :. 조직 목욕 회로도 만화 이중 벽에 배치 조직의 고리를 나타내는, 물 재킷 조직 바일. 버퍼 유출입은 챔버의베이스에 통합 된 3 방향 스톱 콕 유리에 의해 조절된다. O 2 / CO 2 PSS 또는 가스의 누설을 방지하는 개스킷에 의해 밀봉된다 폭기 통해 버블 링시켰다. 재순환 입력 적절한 재순환을 유지하고 온도를 야기 disregulation 공기 주머니의 형성을 방지하기 위해 출력 이하이다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig2highres.jpg" /> 그림 2 :. 쥐 흉부 대동맥 + 내피 세포는 위의 그림은 네 개의 개별 실험 (다른 동물과 다른 색상으로 표시되는 다른 세트 업에 다른 연구자들에 의해 수행) PE에 의한 수축을 이동하는 프라 조신의 능력을 테스트를 보여줍니다. 프라 조신 (5 nM의)은 명확 병렬 방식으로 PE - 유도 수축 곡선을 우측으로 이동했다. 그림 3 : 쥐 흉부 대동맥 + 내피 세포 그래픽 부재 (차량)에 PE에 대한 EC 50 값의 추정 및 길항제의 존재 (프라 조신).. 그린 라인 (그룹 C는) 만 표시됩니다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 소금 </td><td> MW (g / 몰) </td><td> 5 리터 </td><td> FINAL mM의 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> (g) </td></tr><tr><td> 염화나트륨 </td><td> 58.45 </td><td> 37.99 </td><td> (130) </td></tr><tr><td> 의 KCl </td><td> 74.56 </td><td> 1.75 </td><td> 4.7 </td></tr><tr><td> KH2PO4 </td><td> 136.1 </td><td> 0.8 </td><td> 1.18 </td></tr><tr><td> 황산• 7H20 </td><td> 246.5 </td><td> 1.45 </td><td> 1.17 </td></tr><tr><td> NaHCO3를 </td><td> 8421 </td><td> 6.25 </td><td> 14.9 </td></tr><tr><td> 우선 당 </td><td> 180.16 </td><td> (5) </td><td> 5.5 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> (380) </td><td> 0.05 </td><td> 0.03 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 정상 생리 소금 솔루션 (PSS) 조리법이 실험에 사용 된 중탄산염 버퍼 PSS의 내용.. 모든 염의 분자량 원하는 농도를 달성하기 dH보다 2 O 5 L에 첨가 량이 포함된다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 목욕 농도 </td><td> 작용제를 첨가 조로 이루어 </td></tr><tr><td> 1 × 10-9 M </td><td> 50 ml의 1 × 10 -6 M </td></tr><tr><td> 3 × 10-9 M </td><td> 100 ㎖의 1 × 10-6 M </td></tr><tr><td> 1 × 10-8 M </td><td> 35 ml의 1 × 10 -5 M </td></tr><tr><td> 3 × 10 -8 M </td><td> 100 ㎖의 1 × 10-5 </td></tr><tr><td> 1 × 10-7 M </td><td> 35 ml의 1 × 10 -4 M </td></tr><tr><td> 3 × 10 -7 M </td><td> 100 ㎖를 1 × 10 -4 M </td></tr><tr><td> 1 × 10 -6 M </td><td> 35 ml의 1 × 10 -3 M </td></tr><tr><td> 3 × 10 -6 M </td><td> 100 ㎖의 1 × 10-3 M </td></tr><tr><td> 1 × 10 -5 M </td><td> 35 ml의 1 × 10-2 M </td></tr><tr><td> 3 × 10-5 M </td><td> 100 ml의 1 × 10-2 M </td></tr><tr><td> 1 × 10 -4 M </td><td> 35 ml의 1 × -1 M </td></tr></tbody></table> 표 2 :. 목욕 티슈 첨가제 작용제 농도 작용제의 양은 프로 각 욕에 첨가 될perly 누적 농도 - 반응 곡선을 구축. 원하는 욕 농도는 작용제의 농도를 증가시키는 양의 순차 첨가를 통해 달성된다. 각 추가 계정에 목욕에 이미 존재하는 작용제의 농도를합니다. 이 작용제의 단일 농도 증가량을 사용하여 발생 될 조직 조에서의 부피 증가를 최소화하기 위해 행해진 다.

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Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

약리학 연구에 고립 된 조직 목욕-애플리케이션에서 부드러운 근육 기능의 측정

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

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Drugs Acting on Autonomic Nervous System: Adrenergic Agonists and Antagonists Agents

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Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between 100-400 &mu;m in diameter function primarily in directing blood flow to various organs according to the overall requirements of the body. The rat mesenteric artery has a diameter greater than 100 &mu;m. The myography technique, first described by Mulvay and Halpern1, was based on the method proposed by Bevan and Osher2. The technique provides information about small vessels under isometric conditions, where substantial shortening of the muscle preparation is prevented. Since force production and sensitivity of vessels to different agonists is dependent on the extent of stretch, according to active tension-length relation, it is essential to conduct contraction studies under isometric conditions to prevent compliance of the mounting wires. Stainless steel wires are preferred to tungsten wires because of oxidation of the latter, which affects recorded responses3.The technique allows for the comparison of agonist-induced contractions of mounted vessels to obtain evidence for normal function of vascular smooth muscle cell receptors.
We have shown in several studies that isolated mesenteric arteries that are contracted with phenylyephrine relax upon addition of cumulative concentrations of extracellular calcium (Ca2+e). The findings led us to conclude that perivascular sensory nerves, which express the G protein-coupled Ca2+-sensing receptor (CaR), mediate this vasorelaxation response. Using an automated wire myography method, we show here that mesenteric arteries from Wistar, Dahl salt-sensitive(DS) and Dahl salt-resistant (DR) rats respond differently to Ca2+e. Tissues from Wistar rats showed higher Ca2+-sensitivity compared to those from DR and DS. Reduced CaR expression in mesenteric arteries from DS rats correlates with reduced Ca2+e-induced relaxation of isolated, pre-contracted arteries. The data suggest that the CaR is required for relaxation of mesenteric arteries under increased adrenergic tone, as occurs in hypertension, and indicate an inherent defect in the CaR signaling pathway in Dahl animals, which is much more severe in DS.
The method is useful in determining vascular reactivity ex vivo in mesenteric resistance arteries and similar small blood vessels and comparisons between different agonists and/or antagonists can be easily and consistently assessed side-by-side6,7,8.

An automated myography method for force measurements in isolated mesenteric arteries is described. It employs a Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A to determine responses to phenylephrine and extracellular calcium. The method allows consistent determination of isometric responses to agonists in small vessels of diameters of 60 - 300 &mu;m, independently.

자동 와이어 Myography를 사용 Mesenteric 동맥 수축과 휴식 연구

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

연구

의학

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties of the smooth muscle as well as changes induced by pathology. This method provides critical information for understanding bladder function while overcoming major methodological difficulties encountered in in vivo experiments, such as surgical and pharmacological manipulations that affect stability and survival of the preparations, the use of human tissue, and/or the use of expensive chemicals. It also provides a way to investigate the properties of each bladder component (i.e. smooth muscle, mucosa, nerves) in healthy and pathological conditions.
The urinary bladder is removed from an anesthetized animal, placed in Krebs solution and cut into strips. Strips are placed into a chamber filled with warm Krebs solution. One end is attached to an isometric tension transducer to measure contraction force, the other end is attached to a fixed rod. Tissue is stimulated by directly adding compounds to the bath or by electric field stimulation electrodes that activate nerves, similar to triggering bladder contractions in vivo. We demonstrate the use of this method to evaluate spontaneous smooth muscle contractility during development and after an experimental spinal cord injury, the nature of neurotransmission (transmitters and receptors involved), factors involved in modulation of smooth muscle activity, the role of individual bladder components, and species and organ differences in response to pharmacological agents. Additionally, it could be used for investigating intracellular pathways involved in contraction and/or relaxation of the smooth muscle, drug structure-activity relationships and evaluation of transmitter release.
The in vitro smooth muscle contractility method has been used extensively for over 50 years, and has provided data that significantly contributed to our understanding of bladder function as well as to pharmaceutical development of compounds currently used clinically for bladder management.

This manuscript presents a simple, yet powerful, in vitro method for evaluating smooth muscle contractility in response to pharmacological agents or nerve stimulation. Main applications are drug screening and understanding tissue physiology, pharmacology,&#160;and pathology.

하부 요로 약리학을 평가하는 방법으로 방광 평활근 스트립 수축성

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that system. Changes in blood flow to the small intestine can result in effects on the absorptive functions of the organ. Particular interest in toxins liberated from feedstuffs through fermentative and digestive processes has developed in ruminants as an area where productive efficiencies could be improved. The video associated with this article describes an in vitro bioassay developed to screen compounds for vasoactivity in isolated cross-sections of bovine mesenteric artery and vein using a multimyograph. Once the blood vessels are mounted and equilibrated in the myograph, the bioassay itself can be used: as a screening tool to evaluate the contractile response or vasoactivity of compounds of interest; determine the presence of receptor types by pharmacologically targeting receptors with specific agonists; determine the role of a receptor with the presence of one or more antagonists; or determine potential interactions of compounds of interest with antagonists. Through all of this, data are collected real-time, tissue collected from a single animal can be exposed to a large number of different experimental treatments (an in vitro advantage), and represents vasculature on either side of the capillary bed to provide an accurate picture of what could be happening in the afferent and efferent blood supply supporting the small intestine.

The small intestine is frequently exposed to toxins that can influence blood flow and negatively impact nutrient absorption. Using a multimyograph and mesenteric artery and vein isolates, compounds or toxins of interest can be screened for vasoactivity.

생물 검정으로 소 장간막 동맥과 정맥의 섹션을 분리하고 사용하면 소장에서 Vasoactivity을 테스트

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

신경과학

Contractility Measurements of Human Uterine Smooth Muscle to Aid Drug Development

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We describe methods to measure ex vivo myometrium contractility. This assay can be used to investigate factors and molecules involved in the modulation of myometrial contraction and to determine their excitatory or inhibitory actions, and hence their therapeutic potential in vivo. Biopsies are obtained from women undergoing cesarean section delivery with informed consent. Fine strips of myometrium are dissected, clipped and attached to a force transducer within 1 mL organ baths superfused with physiological saline solution at 37 &#176;C. Strips develop spontaneous contractions within 2&#8211;3 h under set tension and remain stable for many hours (&#62;6 h). Strips can also be stimulated to contract such as by the endogenous hormones, oxytocin and vasopressin, which cause concentration-dependent modulation of contraction frequency, force and duration, to more closely resemble contractions in labor. Hence, the effect of known and novel drug leads can be tested on spontaneous and agonist-induced contractions.
This protocol specifically details how this assay can be used to determine the potency of known and novel agents by measuring their effects on various parameters of human myometrial contraction. We use the oxytocin- and V1a receptor antagonists, atosiban and SR49059 as examples of known compounds which inhibit oxytocin- and vasopressin-induced contractions, and demonstrate how this method can be used to complement and validate pharmacological data obtained from cell-based assays to aid drug development. The effects of novel agonists in comparison to oxytocin and vasopressin can also be characterized. Whilst we use the example of the oxytocin/ vasopressin system, this method can also be used to study other receptors and ion channels that play a role in uterine contraction and relaxation to advance the understanding of human uterine physiology and pathophysiology.

This article describes experimental protocols to study ex vivo contractions of human myometrium and their application in drug discovery. This technique is used to improve the understanding of myometrial physiology and pathophysiology as well as to validate pharmacological data from novel research probes or drug leads.

보조 약물 개발에 인간 자 궁 평활 근의 수축 측정

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

패치 클램프 전기 생리학 및 압력 Myography를 사용하여 간선 평활근 Kv7 칼륨 채널 기능을 탐색

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

생물학

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Pressure myograph systems are exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized to a suitable transmural pressure. The near physiological condition achieved in pressure myography permits in-depth characterization of intrinsic responses to pharmacological and physiological stimuli, which can be extrapolated to the in vivo behavior of the vascular bed. Pressure myograph has several advantages over conventional wire myographs. For example, smaller resistance vessels can be studied at tightly controlled and physiologically relevant intraluminal pressures. Here, we study the ability of 3rd order mesenteric arteries (3-4 mm long), preconstricted with phenylephrine, to vaso-relax in response to acetylcholine. Mesenteric arteries are mounted on two cannulas connected to a pressurized and sealed system that is maintained at constant pressure of 60 mmHg. The lumen and outer diameter of the vessel are continuously recorded using a video camera, allowing real time quantification of the vasoconstriction and vasorelaxation in response to phenylephrine and acetylcholine, respectively.
	To demonstrate the applicability of pressure myography to study the etiology of cardiovascular disease, we assessed endothelium-dependent vascular function in a murine model of systemic hypertension. Mice deficient in the &alpha;1 subunit of soluble guanylate cyclase (sGC&alpha;1-/-) are hypertensive when on a 129S6 (S6) background (sGC&alpha;1-/-S6) but not when on a C57BL/6 (B6) background (sGC&alpha;1-/-B6). Using pressure myography, we demonstrate that sGC&alpha;1-deficiency results in impaired endothelium-dependent vasorelaxation. The vascular dysfunction is more pronounced in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice, likely contributing to the higher blood pressure in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice. 
	Pressure myography is a relatively simple, but sensitive and mechanistically useful technique that can be used to assess the effect of various stimuli on vascular contraction and relaxation, thereby augmenting our insight into the mechanisms underlying cardiovascular disease.

In pressure myography, an intact small segment of a vessel is mounted onto two small cannulas and pressurized to a suitable luminal pressure. Here, we describe the method to measure vasorelaxation response of the mouse 3rd order mesenteric arteries in c57 and sGC&alpha;1-/- mice using pressure myography.

압력 Myography를 사용 쥐과 저항 동맥의 기능을 평가

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

마우스의 심장 수축력의 조사에 대 한 격리 유두 근육의 수축력 측정

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic diseases. Endothelial dysfunction represents a major culprit for the reduced vasodilatation and enhanced vasoconstriction of arteries. Adipose (fat) tissues surrounding the arteries play important roles in the regulation of endothelium-dependent relaxation and/or contraction of the vascular smooth muscle cells. The cross-talks between the endothelium and perivascular adipose tissues can be assessed ex vivo using mounted blood vessels by a wire myography system. However, optimal settings should be established for arteries derived from animals of different species, ages, genetic backgrounds and/or pathophysiological conditions.

The protocol describes the use of wire myography to evaluate the transmural isometric tension of mesenteric arteries isolated from mice, with special consideration of the modulation by factors released from endothelial cells and perivascular adipose tissues.

혈관 주위 지방 조직에 의해 변조에 초점을 맞춘 분리 된 장 간 동맥을 사용 하 여 혈관 톤 응답성의 평가

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

<meta charset="utf8"></head><body>위장관 역학 및 운동성에 대한 약물 효과를 연구하기 위한 프로토콜

Using An In Vitro Tissue Perfusion System to Detect the Functional Activities of Isolated Intestinal Tubes in Real Time

Gastrointestinal diseases, which have a high incidence, pose considerable challenges for humans. The small intestine is integral to food and drug digestion and absorption and plays a crucial role in treating these diseases. The intestinal tube movement experiment, a common and essential in vitro method, is utilized to study gastrointestinal dynamics. This includes the preparation of the isolated intestinal tube, as well as the suspension of the prepared intestinal tube in the bath and its connection to a signal detector. This is followed by the recording and analysis of a series of parameters, such as tension, which can be used to assess intestinal motor function, as well as considerations for keeping the intestinal tube active in vitro. The standardized program from sampling to data collection greatly improves the repeatability of the experimental data and ensures the authenticity of the recording of intestinal tension after physiological, pathological, and drug intervention. Here we present the key problems in experimental operation and a valuable reference experimental protocol for studying drugs that regulate gastrointestinal motility.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Rat Intestinal Tubes에 대한 약물 영향에 대한 신뢰할 수 있고 재현성 있는 In Vitro 평가

We present a method for isolating rat intestinal tubes and assessing the impact of drugs on their tension, frequency, and amplitude in vitro. This method offers a valuable approach for researchers investigating intestinal tubes.