Name: intracellular recording, sensory field mapping, and culturing identified neurons in the leech, hirudo medicinalis
Uploaded: 2013-11-04T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
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1. 전극과 생리 식염수 용액의 제조 <ol><li> 동물을 해부하기 전에 생리 식염수 및 전극을 준비합니다. 115.3 밀리미터의 NaCl, 1.8 mM의 염화칼슘, 4.0 밀리미터의 KCl, 10 mM 트리스 / 말레 산 또는 HEPES를 : 거머리 링어의 솔루션은 다음과 같이 구성됩니다. 7.4으로 산도를 조정합니다. </li><li> 와이어가 부드러운 다크 그레이 마감이 될 때까지 20 분 동안 표백제 소량으로 청소 실버 와이어를 찍기 또는하여 자세로-C1 와이어를 준비합니다. 사용하기 전에 증류수로 와이어를 씻으십시오. 그런 앰프에 연결 마이크로 피펫 홀더에 와이어를 배치합니다. </li><li> 피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리의 날카로운 유리 전극을 준비합니다. 전극 저항은 20 MΩ의 주문에 있어야한다. </li><li> 3 M의 아세트산 칼륨 용액을 피펫 찰 및 마이크로 피펫 홀더에의 삽입합니다. </li><li> 세포 외 전극 용으로 다시 팁을 휴식, 상술 한 바와 같이 날카로운 유리 피펫을 준비날카로운 가장자리 근처에 다른 날카로운 피펫을 바르고. 그 다음은 connectives를 찢어지지 않도록 끝을 연마 화재. 플라스틱 세포 전극은 한 전극과 신경 사이 좋은 접촉이로 작동합니다. </li><li> 흡입 용 고무 튜브와 주사기가 장착되어 있습니다 (자세로-C1 와이어) 마이크로 피펫 홀더에 세포 외 기록 전극을 삽입합니다. 적어도 실버 와이어의 수준에 전극에 식염수를 그리는 주사기를 사용합니다. </li><li> 특정 신호 기록 장치의 사용 설명서에 따라 하드웨어 (앰프와 자극 절연체) 및 소프트웨어 기록 매개 변수를 설정합니다. 아래에서 설명하는 실험에 사용되는 장비에 대한 세부 정보를 볼 수 Leksrisawat 등. 22을 참조하십시오. </li></ol> 2. 복부 신경절의 해부 <ol><li> 거머리 링거액과 함께 큰 실리콘 엘라스토머 늘어선 접시에 거머리를 해부하다. 동물은 그 길이 방향으로 할 것이다 늘어 나면복부 신경 코드 (그림 1A 참조)를 제거하는 것이 더 쉽습니다. </li><li> # 10 또는 # 11 크기 메스, 복부 정중선에서 매우 얕은 인하와 함께 세로 절개를합니다. 복부 컷의 중간 2/3rd에 대한 그림 1B에 표시됩니다. 꼬임없이 동물이 완전히 개방되고, 혈액 동 연신 될 때까지 검은 색 스타킹 (복부 혈액 동)을 건드리지 않게하십시오. 이 혈액 동은 복부 정중선을 따라 동물의 길이를 실행합니다. VNC는이 혈관의 내부에 포함된다. </li><li> 피부 닉에 혈액 동 (그림 2) 미세 홍채 가위를 사용하는 동물의 전체 길이를 절단 한 후. 동에서 미세 홍채 가위 중 하나 블레이드 슬립 약간 신경 조직에서 분리 할 수​​있는 날을 올립니다. 신경 뿌리, 분절 신경 또는 신경 사이의 connectives을 피하면서 동에게 VNC의 길이를 잘라. </li><li> 다음으로 복부 신경 코드의 일부를 제거혈관 뿌리 합류 위치로 원위 뿌리 절단. 복부 신경 코드의 길이를 따라 각 신경절에 대해이 과정을 반복합니다. </li><li> 작은 페트리 접시에 하나 또는 두 개의 신경절의 세그먼트를 전송합니다. 신경 또는 하나의 신경절은 일부 여유와 긴장 고정해야합니다. </li><li> 신경절 아교 칼집이 약간 아교 칼집을 통해 관심의 신경 세포에 impaling 때 주위에 이동하는 신경 세포 기관을 방지하기 위해 뻗어되도록 connectives과 뿌리를 핀. 핀은 뿌리 블랙 부비동 통해 축삭 손상 (도 3)를 최소화하기 위해이 connectives의 중간에 배치해야한다. </li><li> 현미경 준비와 페트리 접시를 놓고 이동을 방지하기 위해 접시의 바닥에 왁스로 고정. </li><li> 조심스럽게 그림 4A와 같이 신경 세포를 확인하기 위해 거울과 빛 콘덴서를 사용하여 광선을 초점 (개략적으로 그림 (b)에 나타낸 바와 </st룽&gt;). 신경절의 중심에 두 개의 큰 Retzius 셀을 주목하라. </li><li> 는 Rz, T, P, 및 N 뉴런의 세포 내 녹화를 만들기 위하여주의 깊게 관심의 세포에 전극의 끝 부분을 배치하고 부드럽게 보조개가 아교 칼집에서 볼 때까지 끝을 내립니다. </li><li> 전극 홀더 또는 조작 (매우 신중하게)되도록를 눌러 그 셀에 전극의 끝 &quot;아빠&quot;. </li><li> 활동 전위를 불러 일으키는 세포로 양의 전류 (1-10 NA)의 짧은 펄스 (30 ~ 40 밀리 초)을 주입한다. </li></ol> 3. 복부 신경절 준비에서 배양 된 뉴런 <ol><li> 소 태아 혈청 (FCS) (도 3)와 L-15를 함유하는 깨끗한 접시 신경절 복부 측면을 핀. 세포 내 녹화를 위해 위의 수행으로 신경이 약간 늘어 지도록 뿌리를 핀. 미세 가위, 닉 한 끝에 아교 캡슐은 다음 아교 캡슐 가로 질러, 캡슐 미만 가위 블레이드 슬립도 5a에 도시 된 바와 같이. </li><li> 15 분 동안 진탕의 요리와 장소에 콜라게나 / 디스 파제 100 μL 나누어지는를 추가합니다. 노출 된 세포 기관 주변의 문화 매체를 이동하여 세포를 검사합니다. 세포가 최소한의 흡입으로 나올 때까지 또 다른 15 분 이상에 대한 통에 세포를 반환합니다. </li><li> 부드럽게 신경절 세포를 추출하는 주사기에 부착 된 피펫을 사용합니다. 이 전지 본체의 직경보다 약간 크도록 사격 피펫 팁 닦아. 성인에서 거머리는 Rz 세포의 경우, 직경이 약 50 ㎛이어야한다. </li><li> 이것은 피펫 내부 나와 세포의 가능성을 감소할수록 필라멘트없이 직경이 다른 피펫의 다양한 준비한다. 치핑에서 팁을 보호하기 위해 바닥에 목화 공을 사용하여 80 % 에탄올 (EtOH로)를 포함하는 병에 피펫을 저장합니다. 세포를 흡입하기 전에 매체 피펫 밖으로 EtOH로 세척해야합니다. </li><li> 효소 처리 후 씻어효소 함유 배 (FCS)와 L-15와 매체를. 관심의 세포를 확인하고 조심스럽게 주사기 (그림 6A)를 잡아 당겨 피펫으로 그립니다. (FCS와 함께) L-15가 포함 된 다른 접시에 흡입 된 세포를 방전. </li><li> 지금까지, 모든 절차는 비 멸균했다. 멸균 후드에서 다음 단계를 수행합니다. 멸균 페트리 접시 안에 다른 위치에 (FCS와 함께) 멸균 L-15의 3 ~ 4 큰 방울을 넣습니다. </li><li> 그 (것)들을 세척하고 드롭 주위를 불고, 이전에 언급 한 방울 중 하나에 세포를 피펫. 매체의 3 ~ 4 방울에 일련의이 과정을 반복합니다. </li><li> (FCS와 함께) L-15로 가득 깨끗한 배양 접시에 세포를 놓습니다. </li><li> 실온에서 1-24 시간 동안 세포를 품어. 그 후 깨끗한 세포가 도금 될 수있다. 몇 시간 또는의 세포를 떠나 밤새 세포 외 기질은 쉽게 떨어져 온다. 더 이상 프로세스를 생성하는 즉시 세포를 접시. </li><li> 마이크로 웰 디에게 코트에 멸균 기판을 사용하여<html> 쉬하고 실험을 배양하기 전에 (야간) 완전히 건조 할 수 있습니다. </li><li> 접시 코팅 한 후, L-15 배지 소량 후 멸균 수로 가볍게 접시 씻어. FCS없이 L-15 솔루션을 사용하는 것을 기억 세포가 접시를 준수 할 수 있도록 추가되었습니다. 셀은 기판에 접착 한 후 배지를 온화 FCS와 L-15로 변경 될 수있다. 세포가 몇 시간 FCS와 L-15 배지 전환 한 다음, 도금 후에 사용되는 경우에 필요한 것은 아니다. </li><li> 빠른 시냅스 (그림 6B)를 유도하기 위해 도금시에 서로 옆에 셀을 배치합니다. 뉴런의 짝에 24 시간 측정 생리 활성 후. </li><li> (제 2의 세포 내 전극을 사용하여 쌍을 이루는 세포에서 세포 내 전극과 기록 응답을 통해 한 신경 세포를 자극) 세포의 배양 쌍으로 RP 또는 시냅스 응답을 기록하는 세포 내 전기 생리학 기술을 사용합니다. </li></ol>제목 &quot;&gt; 4. 신경절 몸 벽 제조 예 <ol><li> 상술 한 바와 같이 탄성 중합체 줄 지어 접시에 아래 거머리 등의 측면을 핀. </li><li> 절단 된 신경절의 반대편에 뿌리를 한쪽으로 피부 (그림 (b)의 확대도 7a를) 핀 또는 신체의 모든 뿌리 신경절 (그림 7C)에 거머리의 복부 측면에 창을 그대로 벽. </li><li> 감각 세포 (T, P, N) 불에 살짝 같은 세그먼트의 피부에 닿는 연마 된 작은 유리 막대를 사용 중 하나의 안정적인 세포 녹음을 얻은 후. 에서 기록중인 신경 세포가 N 셀이면 더 많은 압력은 피부에 도포 될 필요가있을 것이다. 피부는 핀셋으로 협지되는 경우 대부분의 경우에, N 세포에만 반응 할 것이다. 하나는 피부를 손상 시키거나하는 방식으로 제조를 방해하여 세포 내 레코딩 변위 하듯이 때문에 이들 세포는 마지막 시도되어야한다. </li><li> 하나는해야한다신속하게 충분한 정보와 함께 피부 신경절을 스케치 할 수있는 그 감동을 하나의 특정 신경 세포의 수용 필드를 결정하는 데 사용할 수있는지도. 신경절의 양쪽에 최대한 많은 P 및 T 세포에서 녹음 한 후 N 세포를 시도한다. </li><li> 감각 신경이 주동이 또는 꼬리 방식으로 다음 피부에 인접한 세그먼트의 뿌리 중 connectives 여행을 통해 프로세스가있는 경우에 조사하기 위해,에 관해서 신경 사이의 connectives는 절단 할 수 있고, 수용 필드는 재검토 검출 확산. 수용 분야의 손실이 있었다 경우 기본적으로 하나 검토하고 있습니다. </li></ol> 5. 형광 염료를 주입 <ol><li> 상술 한 바와 같이 거머리 신경절을 준비합니다. </li><li> 루시퍼 노란색-CH (3.0 %)과 염화 리튬 (300 ㎜)의 용액으로 미세 전극을 입력합니다. </li><li> 설명 된 신경절의 복부 측 또는 감각 세포는 Rz 세포 중 하나를 꿰 뚫기위. </li><li> 15 분의 전극을 통해 음의 전류 (3NA)을 전달하여 셀에 염료를 주입한다. 100 밀리 초에 펄스 지속 시간, 2 Hz에서 주파수를 설정합니다. </li><li> 수은등과 FITC / GFP 필터 세트와 흥분 염료에 의해 염색 채워진 뉴런 시각화. </li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+molecular+data+demonstrate+that+commercially+available+medicinal+leeches+are+not+Hirudo+medicinalis.">Diverse molecular data demonstrate that commercially available medicinal leeches are not Hirudo medicinalis.</a> Proc. Biol. Sci. 274, 1481-1487 (2007).</li></ol>

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실험이 세트의 목적은 1) 가르치고 전시 세포 내 기록의 기본 원칙을 식별 뉴런과 2) 성인 거머리를 사용하여 이러한 특정 신경 세포 유형에서 발생할 수있는 전기 신호의 특성 모양을 인식하는 것이 었습니다. 이 신경 생리 학적 연구를 위해 거머리를 이용하여 조사의 풍부한 역사는 연구는 신경 회로 및 개발 과정뿐만 아니라 시냅스 수리 및 재생 10시 유전자 조절의 문제를 해결에서 진행되고있다. 신경 조절은 특히 생물 기원 아민의 경로를 통해, 또한 거머리에서 성공적인 연구 방향이었다. 생리 식염수를 통해 신경계의 도파민 및 기타 약물 에이전트를 추가함으로써, 도파민은 의사 결정 문제 (24, 25)를 크롤링 (23)와 모터 패턴에 관련된 신경 네트워크를 변조 것으로 나타났습니다. 이 실험 방법은 바보입니다르 (저렴) 교육 연구소에 변조를 통합 할 수있는 방법, 그리고 식염수의 이온 화장 조정은 네른스트 골드만 지킨 - 카츠 방정식을 가르 칠 수있는 효과적인 방법입니다. 신경절 준비로 성공하기는 신경절 이전 세포 내 전극과 소마를 찌를 시도에 팽팽하게하는 것이 중요합니다. 아교 패킷에 아래로 밀어, 그렇지 않으면 소마 이동합니다. 문화에 신경을 제거하는 신경절을 desheathing 때 제거 될 때 somas가 손상되지 않도록 신경절에 걸쳐 절단 할 때뿐만 아니라, 관심있는 지역을 피하십시오. 또한, 효소의 과도한 배양은 신경 세포를 제거하기에 너무 깨지기 쉬운 존재가 발생할 수 있습니다. 그것은 효소의 각 배치는 자신의 행동에 약간 다르기 때문에 최적의 배양 시간을 달성하기 위해 몇 가지 시행 착오가 필요합니다. 배양 배지를 최적화하기 위해 추가 조사는이 기술을 향상시킬 수 있었다. 바리인슐린, 당, 또는 성장 인자의 존재와 같은 OU에 요인, 문화의 이상 유지 보수를 위해 검사 할 수 있습니다. 세포는는 Rz 세포에서 세로토닌 합성으로 송신기를 합성하는 자신의 능력을 유지하는지 확인하려면, 중립 붉은 얼룩이 세로토닌 프로세스에 라벨을 적용 할 수 있습니다. 부상 및 재생 조직에 또한 미세 아교 침공 부상 후 핵 얼룩 일에 의해 정량화 될 수있다. 이 준비가 재생 및 수리뿐만 아니라 신경 회로를 검사에서 제공하는 많은 혜택을 가지고 있지만, 시냅스의 다양한 수용체 아형의 약물 분자 식별이 완전히 특징되지 않았습니다. 표현 시퀀스 태그 라이브러리는 26 사용할 수 있으며, 의약 거머리의 게놈은 현재 27 조립되고 있지만, 일부 모델 준비에 비해 거머리의 주요 제한은 특정 세포 유형에 선택적 유전자의 게놈을 수정할 수있는 기능입니다. 배아의 t에서그의 제한은 유전자 발현을 조절하는 28 DNA 또는 dsRNA를 주입함으로써 해결되었다. 유전자 총 기술은 최근에 거머리 신경 무척추 넥신 (innexin) 단백질을 표현하기 위해 사용되었다. Hirudo verbana (HVE-inx6)에서 innexin의 식 의약 거머리 29 자궁외 간극 결합의 형성에 충분하다. 의약 거머리 또는 H. 그것은 30이었다로 버베나는 향후 몇 년 동안 생리와 전기 시냅스의 진화에 대한 우리의 이해를 진행해야합니다.

힐 준비가 식별 (감각, 모터 및 동물의 중추 신경계 (CNS) 내에서 간 신경 세포의 기능을 조사하는 데 유용합니다. 거머리 신경 세포의 유용한 속성은 자신의 활동 전위 및 생물 물리학 적 특성의 모양이 특징적인 점이다 세포 분류 관련 (즉 P, N, T,는 Rz). 더욱이 신경 세포만큼 사십오일 1,2 그들의 전기적 특성을 유지할 수있는 적합한 배지에서 배양 동물로부터 제거 될 수있다. 전기 생리학 녹음을하는 방법을 학습에 대한 거머리 신경절의 뚜렷한 장점은 세포가 특징적으로 안정적으로 할 수있는 패턴의 신경절에 배치되는 것입니다 신경절에서 신경절 및 동물에서 동물로 별개의 세포 유형의 식별. 독특한 위치와 거머리 신경절에있는 신경 세포의 형태는 이미 1891 3 등 Retzius에 의해 관찰되었다. 일에 대한 지식전자 ID 및 신경 세포의 기능은 신경 회로를 조사하는 주어진 세포 유형과 실험을하기에 유리하다. 인해 그들이 해부 현미경으로 볼 수 있으며, 인 somata 선택적 그들의 전기적 특성을 기록하기위한 미소 전극과 찔 수 신경절 뉴런 사이의 비교적 대형 인 somata한다. 염료 및 큰 분자는 각각의 세포 및 패치 클램프에 의해 연구 채널 속성에 주입 할 수있다. 다양한 신경 세포의 특징적인 활동 전위의 다양한 형태로 발생시키는 이온 전류는 4-7 확인되었습니다. 신경 분포의 패턴과 CNS 내의 개별 신경 세포의 분기 조사에서 시냅스 연결이 확인 된 뉴런 2.8와 문화를 재현하고있다. 거머리 신경의 연구도 ë으로뿐만 아니라 전기 생리학으로 측정 할 수있는 기능 회로의 개발에 대한 통찰력을 제공하고 있습니다전자 동물 행동 연구. 거머리 CNS는 전체 동물의 문화 4-6,9-12에있는 신경 세포의 수리 및 재생과 관련된 메커니즘을 연구하기위한 귀중한 준비를 역임했다. 포유류의 뇌에서는 속성과 개별 식별 뉴런의 연결 측면에서 행동을 설명하는 것은 어려운 작업입니다. 원칙적으로 하나는 거머리 덜 복잡한 시스템의 연구는 고등 동물에 사용되는 기본 메커니즘을 정의하는 데 도움이 될 수 있기를 바랍니다 수 있습니다. 수영 패턴 (13, 14)과 심장 (15)의 리듬의 기초가 사용되는 연결은 잘 거머리 특징으로하고 있습니다. 양쪽 전기 화학 통신을 형성하는 일부 거머리 뉴런의 능력은 흥미 롭다. 다른 사람이 단방향 화학적하지만 양방향 전기적으로 7하는 동안 일부 연결은 양방향이다. 동물 내에서 시냅스 연결을 이해뿐만 아니라 같은 일반을 다시배양 접시에 연결 전자는 시냅스 16-18뿐만 아니라 시냅스 (19)의 약리학 적 프로파일을 조사하기위한 강력한 도구입니다. 여기에 설명 된 세포 내 기록 및 자극 기술은 neuroethology 개발에 약물 분석 및 연구를위한 기초를 제공한다. 또, 분절성 복부 신경 코드는 신경 지배 피부 패치로 해부 될 수있다. 살아있는 피부 패치 및 뉴런을 유지하는 기능, 감각 수용 필드는 CNS에서 각각 복부 신경절 내의 감각 신경의 세포체 (즉 소마)로부터 전기 신호를 기록하여 탐색 할 수있다. 이것 하나는 피부에 힘을 다양한 각도를 적용하여 감각 엔딩의 민감도를 평가하고 수용 필드를 매핑 할 수 있습니다 가벼운 터치, 압력 및 유해 (고통) (20, 21)를 자극. 이 거머리 신경절 피부 준비의 장점은 하나의 캘리포니아N 해부학 적으로 수용 필드 맵을 그리고 전기 응답이 기록되고 일단 확인 된 신경 세포의 연결 과정을 추적. 후술 세 거머리 실험 전체 학술 실험실이 비용 효과적인 교육 모듈을 만드는 하나의 시편, 여러 번으로 완료 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>182 silicone kit</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Tris/maleic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleach&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>To chloride silver wire</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>To adjust pH</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>To adjust pH</td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase</td><td>Boehringer Mannheim</td><td>269-638</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 with L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>041-01415H</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Ready Systems Ag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>04-001</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose-Monohydrate</td><td>Merck</td><td>8342</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin sulfate&amp;nbsp;</td><td>any supplier</td><td></td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibco</td><td>043-0503H</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>3375</td><td>Free acid, crystalline</td></tr><tr><td>Concanavalin A Type IV</td><td>Sigma</td><td>C 2010</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine Hydrobromide</td><td>Sigma</td><td>P 7890</td><td>MW 15-30,000</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Microwell plate, 60 x 10 &amp;mu;l</td><td>Falcon</td><td>3034</td><td>Flat bottom, 10 in a bag</td></tr><tr><td>Dissecting tools</td><td>World Precision Instruments</td><td>assortment</td><td></td></tr><tr><td>Intracellular electrode probe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Faraday cage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insect Pins</td><td>Fine Science Tools, Inc</td><td>26001-60</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope (100X)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiber optic lamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small adjustable mirror</td><td></td><td></td><td>To direct light beam toward the preparation.</td></tr><tr><td>Glass electrodes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS7095B5X</td><td>Box of 200, Suction electrodes</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>MD4-M3-R</td><td>&amp;nbsp;Can fix for base or on a metal rod</td></tr><tr><td>Raised preparation stand</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silver wire (10/1,000 inch)</td><td>A-M Systems</td><td>782500</td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>any company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AC/DC differential amplifier</td><td>A-M Systems</td><td>Model 3000</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 26T</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td>27T</td><td></td></tr><tr><td>Head stage</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td></td><td>Comes with AC/DC amplifier</td></tr><tr><td>LabChart7</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electrical leads</td><td>any company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass tools&amp;nbsp;</td><td>make yourself</td><td></td><td>For manipulating nerves</td></tr><tr><td>Cable and connectors</td><td>any company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes with bulbs&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7</td><td>Box of 500</td></tr><tr><td>Beakers</td><td>any company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wax or modeling clay</td><td>any company or local stores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>Grass Instruments</td><td>SD9 or S88</td><td></td></tr><tr><td>Plastic tip for suction electrode</td><td>local hardware store (Watt&amp;rsquo;s brand)</td><td>&amp;frac14; inch OD x 0.170 inch ID</td><td>Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size.</td></tr></tbody></table>

intracellular recording, sensory field mapping, and culturing identified neurons in the leech, hirudo medicinalis

민물 거머리, Hirudo medicinalis는, 신경 생리학, neuroethology 및 발달 생물학 분야에서 과학적인 문제를 해결하기 위해 사용 된 다양한 모델 생물이다. 이 보고서의 목적은 다른 신경계 준비에 전문성을 갖춘 생리에 사용이 될 것입니다, 또는 거의없는 전기 생리학 경험 생물학 학생에 하나의 문서에 거머리 시스템의 실험 기술을 통합하는 것입니다. 우리는 신경절에서 확인 된 신경 회로에서 세포 내 기록에 대한 거머리를 해부하는 방법을 보여줍니다. 다음으로 우리는 알려진 기능의 개별 세포가 배양 접시에서 배양하는 신경절, 어떻게 문화에 그 뉴런에서 기록에 제거 할 수있는 방법을 보여줍니다. 그 다음 우리는 감각 모터 필드를 매핑에 사용되는 신경 지배 피부의 패치를 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 거머리의 준비는 아직 널리 신경이 networ의 기본적인 전기적 특성을 해결하는 데 사용됩니다KS, 행동, 시냅스, 개발. 또한 신경 생리학 교육 연구소에 대한 적절한 교육 모듈이다.

거머리 신경절에있는 감각 신경의 세포 내 기록은 그림 4C에 도시들은 별개의 전압과 시간의 흔적을 특징으로한다. 건강한 거머리 신경절 세포 휴식 세포막 전위는 -45 -60 MV이다. 전위가 작은 것 (이하 네거티브)되는 경우에 하나의 유리 전극을 변경해야하거나, 전위가 여전히 낮은 경우, 신경 코드의 또 다른 세그먼트로 이동. 작은 진폭 자발적인 활동 전위는 전극은 운동 신경 세포에 있음을 나타낼 수 있습니다. 이 신경절 몸 벽에 발생하면 전류 주입은 신경 세포가 여전히 피부에 붙어있는 근육 중 하나를 innervates 여부를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 고리 건설자의 운동 신경 세포 (AE)는 신경절 (그림 4B)의 복부 측면에 그것은 고리 건설자의 근육을 활성화하여 상승하는 환상 체 (능선 또는 세그먼트)의 원인이됩니다. 감각 세포에 전류를 주입하는 활동 전위를 연상한다도 4c에 도시 한 특성을 가진 파형들. 파형이 다르게 보일 경우는 불균형 다리 또는 오프셋 용량 보정으로 인해 수 있습니다. 하나는 세포 내부 다리의 균형을하는 방법에 대한 자세한 내용은 신호 수집 장치와 함께 제공되는 설명서를 참조해야합니다. 도 4C의 전류 펄스의 시작과 끝에 자극 아티팩트를 주목하라. 이 다리는 균형을 때 유물이 보는 방법입니다. 거머리 신경절에서 뉴런의 차 문화는 접시에 전기 화학적 시냅스를 형성한다. 초기 배양 된 세포의 전기적 특성들은 생체에 정확히 동일하지 않다. 그러나 몇 일 후에 자극은 신경절에 기록 된 것과 거의 구별 할 수 없다. 이것은는 Rz 세포의 한 쌍의 그림 (c)에서 보여줍니다. 문화에 7 시간 후 시냅스 전위의 진폭은 1-2 MV했다. 문화 싸이에서 56 시간 후naptic 전위는 10 MV (그림 6C에서 최고 흔적)보다 더 컸다. 활동 전위의 모양도 문화 56hr 후 변경합니다. 기재된 조건 하에서, 이러한 세포는 몇 일 동안 생존한다. 세포 간 통신은 신경 뿌리 또는 connectives을 자극하고 신경절의 뉴런에서 기록에 의해 설명 될 수있다. 이러한 신경을 자극하는 것은 다른 신경절 세포에 강력한 시냅스 전위 활동 전위를 생성합니다. 그림 (b)의 흔적은 동물에서 제거하고 접시에서 고정했다 신경절에 Retzius 세포에서 기록되었다. 블랙 트레이스에 결합 세포 외 전극인가 드레시 홀드 자극하여 유발시켰다. 자극 전압의 증가는 활동 전위 (빨간색 추적을) 발사 셀을 일으켰습니다. 염료 또는 말 무 과산화 효소 형광 자신의 형태를 연구하는 이들 세포에 주입 할 수있다. 루시퍼 노란색이는 Rz에 주입전극을 통해 음의 전류를 전달하여 신경 세포. 대안.도 9a는 분사가 시작된 직후에 염료를 도시 공기압의 퍼프를 사용하여 염료를 주입하는 것이다. 삼십 분 후에 염료는 이미 신경 뿌리 (그림 9B)으로 확산했다. 염료의 분류는, 애플리케이션에 따라 간극 결합을 통과 할 수있다 예를 들어 작은 분자량의 염료가 전기적 시냅스를 식별하는 데 사용된다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig1.jpg" width="600px" /> 그림 1. . 복부 거머리 해부 (A) 동물 철저 거머리 식염수로 채워진 엘라스토머 늘어선 접시에 복부 쪽을 고정합니다 (B) 앞쪽에 걸쳐 얕은 절개 :. 후방 축이 중간 선에 바로 옆되어 신경 손상을 방지하기 위해서 코드. 검은 혈액 동 (contaiNS 복부 신경 코드)를 쉽게 볼 수있다. 칼집에 비해 흰색 하나 노출 신경절을 참고. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50631/50631fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig2.jpg" width="600px" /> 그림 2. 블랙 부비동의 해부. 혈관 (화살표) 조심스럽게 복부 신경 코드 (이중 화살표)를 노출 한면에 차단해야한다. 해부 및 녹화 요리 사이에 전송할 때 복부 신경 코드를 조작 할 수있는 핸들로 사용하기 위해 분절 뿌리 주위에 그대로 혈관의 세그먼트를 남겨주세요. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50631/50631fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3"FO : 콘텐츠 폭 = SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50631/50631fig3.jpg&quot;폭 &quot;3 인치&quot;= &quot;400px&quot;/&gt; 복부 신경 코드의 그림 3. 격리 된 부분. 분절 뿌리에 남아있는 혈관의 조각에 의해 분절 connectives의 끝에서 복부 신경 코드를 고정은 전기 생리학 기록에 대한 신경을 노출합니다. 신경의 스트레칭 긴장은 하나가 식별 세포 기관을 볼 수 있으며, 날카로운 유리 전극과 아교 시스의 쉬운 침투를 허용 할 것이다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50631/50631fig3highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig4.jpg" width="600px" /> 그림 4. 거머리 신경절 세포 해부학. (A) 이상적으로 Retzius 세포 (R) 및 기타 대형 세포 기관 (P-키를 눌러현미경과 빛 콘덴서가 제대로 설정되어있는 경우 우레은 T-터치, N-통각, AE-환형 건설자)는 명확하게 볼 수 있습니다. (B) 신경절 세포의 개략도. somas의 위치에 약간의 차이로 인해 신경절이 뻗어 긴장된 고정하는 방법으로 각 신경절에 발생합니다. 이러한 뉴런의 소마의 기록 (C) 활동 전위가 특징적인 파형이있다. 이 스파이크는 세포 (전압과 시간의 흔적을 오버레이 사각형 펄스)에 양의 전류를 주입하여 유발 하였다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50631/50631fig4highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig5.jpg" width="600px" /> 그림 5. 개별 세포 기관을 제거하는 신경절을 Desheathing. (A) 아교 시스주의 깊게 관심 손상 세포를 방지하기 위해 신경절 가로 질러해야합니다. 빨간색 선이는 Rz 뉴런의 소마 타격 피하기 위해 컷을 나타냅니다. 칼집을 열면 소화 효소에게 결합 조직의 매트릭스에 액세스 할 수 있습니다. (B) 아교 칼집이 열린 후에 신경절 밖으로 불룩 건강한 세포 기관은. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50631/50631fig5highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig6.jpg" width="600px" /> 그림 6. 거머리 신경절에서 뉴런을 배양. (A) 세포가 마이크로 피펫을 사용하여 신경절에서 흡입과 문화 매체를 포함하는 요리로 전송됩니다. (B) 서로 근처에 여러 셀을 배치는 식별 뉴런 사이의 시냅스의 속도를 증가시킬 것이다. 여기에 스투두 개의 뉴런의 MPS는 시냅스를 형성했다. (C) 뉴런 문화 전시 약간 다른 전기적 특성에. 상단 트레이스는 세포가 도금 된 후 인접 셀 7 시간, 56 시간 자극에 의​​해 유발 된 시냅스 잠재력을 보여줍니다. 바닥 흔적은 직접적는 Rz 셀 중 하나에 전류를 주입함으로써 유발 하였다. 시냅스 전위 진폭의 증가를주의 문화의 56 시간 후 활동 전위 파형을 변경합니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50631/50631fig6highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig7.jpg" width="600px" /> 그림 7. 매핑 수용 필드의 거머리 신경절 체벽 준비. (A) 한 가지 방법은 1-3 신경절과 함께 몸 벽의 전체 섹션을 제거하는 것입니다. 여기서 한쪽 뿌리 ㄴ했다EEN 컷과 신경절은 측으로 고정되어 있습니다. (B)는 높은 배율에서 신경절을 고정. (C) 또 다른 방법은 수용 필드를 매핑하는 동안 그대로 신경절에서 몸의 벽과 기록의 작은 창을 만드는 것입니다 . (DG)가 감각 뉴런의 각각은 기계적 자극에 대한 특징적인 응답을 나타낸다. (D) 가벼운 터치가 아니라 P 또는 N 세포의 T 세포 활성을 되살린다. (E) T 세포 반응은 강한에 응답하여 차단 자극, P 세포의 활성화에 방법을 제공. 자극이 강한 N 세포를수록 (FG)가 활성화되고는. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50631/50631fig7highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig8.jpg" width="600px" /> FigurE 8. 거머리 신경절에서 활성을 유발. connectives의 세포 외 자극은 신경 코드에서 시냅스 전달을 조절하는 데 사용된다. (A)가 이것은 connectives 중 하나로 흡입 전극을 부착하고 작은 전압을인가함으로써 수행된다. 날카로운 유리 전극 (화살표) 신경절에 Retzius 셀을 impaling 볼 수 있습니다. (B) 시냅스 전위 (블랙) 뒤에 자극 이슈와 활동 전위 (빨간색)를 표시하는 전압과 시간의 흔적이. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50631/50631fig8highres.jpg" target="_blank">더 보려면 여기를 클릭하십시오 이미지</a> . <img alt="그림 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig9.jpg" width="600px" /> 그림 9. 거머리의 신경 세포에 염료를 주입. (A) 루시퍼 노란색은 현재 죽 전달하여 체세포에 주입 할 수있다기록 미세 우. 수은 램프와 FITC 필터 세트는 다음 형광을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. (B) 염료는 Rz으로 확산하고있다는 주사 후 약 30 분 축삭. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50631/50631fig9highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

이 문서는 거머리를 사용하여 세 가지 신경계 준비 사항 : 세포 내 기록을 복부 신경절에있는 신경 세포에서, 복부 신경절에서 뉴런을 배양하고, 감각 필드를 매핑하는 신경 지배 피부의 패치에서 기록.

세포 내 기록, 감각이 필드를 매핑하고, 거머리의 배양 확인 된 뉴런, Hirudo의 medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

intracellular-recording-sensory-field-mapping-culturing-identified

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

19.6K 조회수.  University of Kentucky.  이 문서는 거머리를 사용하여 세 가지 신경계 준비 사항 : 세포 내 기록을 복부 신경절에있는 신경 세포에서, 복부 신경절에서 뉴런을 배양하고, 감각 필드를 매핑하는 신경 지배 피부의 패치에서 기록. 

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Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal. Simultaneously recording from multiple nerves and muscles gives us precise information about the timing of neural activity. Previous recording methods have worked for two electrodes, but the study of additional nerves or muscles required combining and averaging the recordings of multiple animals, which made it difficult to determine fine details of timing and phasing, because of variability from response to response, and from animal to animal. Implanting four individual electrodes has a very low success rate due to the formation of adhesions that prevent animals from performing normal feeding movements. We developed a new method of electrode fabrication that reduces the bulk of the electrodes inside the animal allowing for normal feeding movements. Using a combination of glues to attach the electrodes results in a more reliable insulation of the electrode which lasts longer, making it possible to record for periods as long as a week. The fabrication technique that we describe could be extended to incorporate several additional electrodes, and would be applicable to vertebrate animals.

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

A technique is described for implanting four in vivo electrodes to monitor the neuromuscular control of feeding behavior in Aplysia californica.

의 전극 제작 및 주입 Aplysia californica 손상, 자유롭게 행동 동물의 다중 채널 및 신경 근육질 레코딩을위한

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal.  ...

연구

신경과학

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

운동에 의해 변조된 뉴런의 생리, 형태학의 및 Neurochemical 특성화

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to perturb gene expression patterns in selected segments of leech embryos, leaving the untreated segments as internal controls.
The pneumatic capillary gun can be used to reach internal layers of cells at early stages of development without opening the specimen. As a method for localized introduction of substances into living tissues, the biolistic delivery with the gun has several advantages: it is fast, contact-free and non-destructive. In addition, a single capillary gun can be used for independent delivery of different substances. The delivery region can have lateral dimensions of ~50-150 &#181;m and extends over ~15 &#181;m around the mean penetration depth, which is adjustable between 0 and 50 &#181;m. This delivery has the advantage of being able to target a limited number of cells in a selected location intermediate between single cell knock down by microinjection and systemic knockdown through extracellular injections or by means of genetic approaches.
For knocking down or knocking in the expression of the axon guidance molecule Netrin, which is naturally expressed by some central neurons and in the ventral body wall, but not the dorsal domain, we deliver molecules of dsRNA or plasmid-DNA into the body wall and central ganglia. This procedure includes the following steps: (i) preparation of the experimental setup for a specific assay (adjusting the accelerating pressure), (ii) coating the particles with molecules of dsRNA or DNA, (iii) loading the coated particles into the gun, up to two reagents in one assay, (iv) preparing the animals for the particle delivery, (v) delivery of coated particles into the target tissue (body wall or ganglia), and (vi) processing the embryos (immunostaining, immunohistochemistry and neuronal labeling) to visualize the results, usually 2 to 3 days after the delivery.
When the particles were coated with netrin dsRNA, they caused clearly visible knock-down of netrin expression that only occurred in cells containing particles (usually, 1-2 particles per cell). Particles coated with a plasmid encoding EGFP induced fluorescence in neuronal cells when they stopped in their nuclei.

In this video, we show a procedure for an accurate biolistic delivery of reagents into live tissue with a novel miniature gene gun. We are knocking down the expression of the axon guidance molecule Netrin in leech embryos by delivering molecules of dsRNA into the ventral body wall and ganglia of single segments.

현지화된 RNAi과 약용 거머리의 이소성 유전자 발현

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

생물학

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" />
Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

NRCC 패치 - 클램프 칩에 대한 세포의 Culturing 및 전기 생리학

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용<em&gt; 생체 내</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

메뚜기에 신경 활동을 특성화하기 위해 다중 단위 기록 방법 (<em&gt; Schistocerca 아메리카나</em&gt;) 강한 회로

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

의 감각 뉴런의 분리<em&gt; 군소 californica</em&gt; 글루타메이트 전류의 패치 클램프 녹음을위한

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent and divergent anatomical connections including feed forward and feedback wiring. Furthermore, information of the same origin is partially sent via parallel pathways to different and sometimes into the same brain areas. To understand the evolutionary benefits as well as the computational advantages of these wiring strategies and especially their temporal dependencies on each other, it is necessary to have simultaneous access to single neurons of different tracts or neuropiles in the same preparation at high temporal resolution. Here we concentrate on honeybees by demonstrating a unique extracellular long term access to record multi unit activity at two subsequent neuropiles1, the antennal lobe (AL), the first olfactory processing stage and the mushroom body (MB), a higher order integration center involved in learning and memory formation, or two parallel neuronal tracts2 connecting the AL with the MB.&#160;The latter was chosen as an example and will be described in full. In the supporting video the construction and permanent insertion of flexible multi&#160;channel wire electrodes is demonstrated. Pairwise differential amplification of the micro&#160;wire electrode channels drastically reduces the noise and verifies that the source of the signal is closely related to the position of the electrode tip. The mechanical flexibility of the used wire electrodes allows stable invasive long&#160;term recordings over many hours up to days, which is a clear advantage compared to conventional extra&#160;and intracellular in vivo recording techniques.

Simultaneous extracellular long term recordings from two different brain neuropiles or two different anatomical tracts were established in honeybees. These recordings allow the investigation of temporal aspects of neuronal processing across different brain areas at the single neuron as well as at the ensemble level in a behaving animal.

행동을 한 꿀벌 두 신경 처리 단계에서 동시 장기 녹음

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

Zebrafish의<em&gt; 시츄</em&gt; 척수 척추 감각과 운동 뉴런 전기 생리 녹음 준비

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

준비 및 Xenopus laevis Tectal 신경의 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 프로토콜

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

세포 내 기록, 감각이 필드를 매핑하고, 거머리의 배양 확인 된 뉴런, Hirudo의 medicinalis

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의 전극 제작 및 주입 Aplysia californica 손상, 자유롭게 행동 동물의 다중 채널 및 신경 근육질 레코딩을위한

운동에 의해 변조된 뉴런의 생리, 형태학의 및 Neurochemical 특성화

현지화된 RNAi과 약용 거머리의 이소성 유전자 발현

NRCC 패치 - 클램프 칩에 대한 세포의 Culturing 및 전기 생리학

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용

메뚜기에 신경 활동을 특성화하기 위해 다중 단위 기록 방법 (

의 감각 뉴런의 분리

행동을 한 꿀벌 두 신경 처리 단계에서 동시 장기 녹음

Zebrafish의

준비 및 Xenopus laevis Tectal 신경의 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 프로토콜