나는 생체내 세포 기록하고 세포내 얼룩 기술의 초기 개발에 도움을 브라운과 데이비드 맥스웰의 초기 교육 앤서니 테일러 감사합니다. 나는 collocalization 매크로에 대한 도움말 M. 실버 주셔서 감사합니다. 많은 학자 누구와 나는 R. 동아, M. 모리 타니, P. 루오, R. Ambalavanar를 포함하여이 기술의 개발에 대한 통찰력을 제공하는 협력 있습니다. 이 기술은 NIH 보조금 DE10132, DE15386 및 RR017971에서 상당한 지원 개발되었습니다.

1. 동물 준비 <ol><li> pentobarbital 나트륨 (50mg/kg IP) 및 난방 패드에 장소와 쥐 마취. 동물 가위로 사후 두개골을 overlying 피부를 면도. 발가락이 palpebral 반사의 부재로 모근뿐만 아니라 경우 마취 수준의 수술 수준이 탈퇴 반사와 발성의 부재에 대한 테스트에서 얻은되었음을 보증하기 위해 동물을 확인합니다. 마취 15 분 간격의 수준을 확인하고 나트륨 pentobarbital 15mg/kg의 주사 45 분마다에 의해 anesthetisa의 수술 수준을 유지합니다. </li><li> 무균 기술을 사용하고 복부와 허벅지 안쪽에 의해 형성 포복 절도에 사타구니 지역에서 절개 단지 말초하고 대퇴 정맥에 정맥 (1mm 직경, 클레이 아담스)과 대퇴 동맥에 삽입합니다. 턱밑 지역의 정중선 절개를 만들고, infrahyoid 근육을 반영합니다. 기관의 작은 절개를하고 환기를 허용하도록 정맥 (2mm 직경)를 삽입합니다. 동맥 정맥을 통해 place.Monitor 체계 diastolic 및 수축기 혈압에 확보 cannual trachael 주위에 치료를 타이. 철수와 palpebral 반응을 모니터링하는 것 외에도 지금 마취의 수준을 평가하기 위해 혈압을 모니터링합니다. 정맥 정맥을 통해 필요할 때 추가적인 마취를 관리할 수 있습니다. </li><li> stereotaxic 프레임에 쥐 장소와 소뇌를 폭로 craniotomy을 수행합니다. 쥐 때문에 환기에 tracheal 정맥을 연결합니다. humidified 공기와 100/min의 속도 2cm 3의 부피와 동물을 환기. 1cm H 2 O의 긍정적인 최종 날숨 압력이 폐 붕괴를 방지하기 위해 유지되어야합니다. 매 15 분 무기폐을 방지하기 위해 폐가 hyperinflate. 다음 예열 미네랄 오일 (30 ° C)와 함께 두뇌의 표면을 커버. 직접 두정 골과 interparietal 뼈 사이의 교차점 아래에있는 큰 정맥 구멍을 피하기 위해주의하십시오. </li><li> 전자기 진동에 결합 막대에 cyanoacrylate 접착제를 적용하고 턱뼈의 치극이라고에있는 막대를 부착합니다. 중 A / D 컴퓨터 출력 또는 신호 발생기의 진동에 mandible 사용하는 명령 신호를 이동합니다. </li><li> craniotomy에 인접한 피부 아래 siliver - 실버 염화물 접지 전극을 배치합니다. </li></ol> 2. 전극 준비 <ol><li> 수평 microelectrode의 풀러를 사용하여 석영 또는 aluminosilicate 유리의 microelectrodes를 조작. </li><li> 0.25M KCl과 0.5M 트리스 버퍼 HCL (산도 7.6) 또는 호수에서 2 % tetramethlyrhodamine (산도 6)에 녹아있는 5-10%의 biotinamide로 microelectrode를 입력합니다. 전극 시험기와 전극 임피던스를 확인합니다. 대구경 axons에서 기록하려면 60 - 80M Ω의 임피던스와 전극을 작은 axons과 interneurons 80 - 150MΩ의 임피던스와 전극을하십시오. </li><li> 전위계의 머리 단계에 microelectrode를 놓습니다. 동물의 머리 뒤에 위치에 고정되는 작은 망원경 (동봉 십자선과 함께 20X)을 통해 전극을 시각화. 이 전극은 stereotaxically 큰 정밀도로 위치를 수 있기 때문에 망원경을 사용하는 것이 중요합니다. </li></ol> 3. Electrophysiological 기록 및 세포 염색법 <ol><li> 피아 메이터의 작은 오프닝을 만들고 전극은 머리를 닿을 때 피드백 신호가 생산되도록 커패시턴스 피드백을 받으려는. 이것은 두뇌의 표면의 정확한 위치를 수 있습니다. </li><li> 반복 mandibular 변위를 생산 및 스테핑 모터의 두뇌에 전극 사전. </li><li> DC 가능성에 갑자기 방울로의 연​​결을 impalements을 인식하고 지속적인 시냅스 활동에 의해 intrasomatic의 연결 impalements를 확인합니다. 커패시턴스의 overcompensation으로 전극을 윙윙하거나 거의 성공적인 세포 침투를 생산하지 도청. 때문에 전극의 높은 임피던스의의 연결 반응이 거의 침투하기 전에 관찰되지 않습니다. </li><li> 당신이 신경을 찌르려고하고 침투가 안정 것으로 간주되면 램프 길게 및 사인 턱 운동을 사용하여의 연결 반응을 특징 5.지도 신경 세포의 수용 필드를 비 전도성 프로브로 머리 주위 피부와 내부 구강을 탐색하여 나무 막대기 등. 연구에 관련된 경우, 그러한 근육 수축 및 유해 자극과 같은 다른 기능 관련 자극에 신경 세포의 반응을 조사 6. 프라이 머리 도입 성의 nociceptive의 연결 수용체가 nociceptive 자극에 반응. 같은 pentobarbital 나트륨과 같은 일반적인 anesthesetics은 기본 수입 성의 뉴런에서 axonal 전도를 차단하는 것이 아니라 신경 전송을 우울하게하지 않습니다. 따라서 기본 수입 성의 축삭의 연결에 axonal 전도는 보존됩니다. </li><li> 15 70nA 분 총 주입 시간 (DC, 1 4nA) 전류 주입. 현재 분사하는 동안 전극 침투를 모니터링하고 막 잠재력이 - 30mV보다 긍정 될 경우에는 중단.</li></ol> 4. 조직 처리 <ol><li> (0.9 % NaCl 38 헹굼 혈관과 pentobarbital의 과다 복용 (140mg/kg IV)와 perfuse하여 동물을 안락사 ° C 헤파린 500 단위 및 1ml 2 % 포함하는 0.1M 인산 버퍼에 4 % paraformaldehyde (산도 7.4) 다음 xylocaine . </li><li> 중 전두엽, 화살이나 수평면에 vibratome를 사용하여 50 100μm의 두뇌와 섹션을 제거합니다. Secions 25 ° C PBS에 부유를 수집하고 있습니다. </li><li> 1-2% 정상 염소 혈청의 잠복기, 1 % 트리톤 0.01M PBS에 X - 100 아비딘 비오틴 단지에 부화 (1시 50분 엘리트 Vectastain) 다음으로 DAB를위한 두뇌를 처리합니다. H 2 O 2와 니켈 - DAB를 사용하여 섹션을 반응. 텍사스 레드, 4 박 PBS에 아비딘 - 비오틴 복합 (1시 50분)에 품어 섹션 ° C 후 4 ° C 하룻밤에 PBST에 4% 텍사스 레드 아비딘 DCS에서 품어.위한 처리 23 ° C.에 형광 Nissl 얼룩 (NeuroTrace) 20 분들과 섹션 Counterstain </li><li> 신경 세포는 rhodamine로 주입 있었다면, 형광 현미경 (예 545nm)로 직접 주입 신경 세포를 시각화. </li></ol> 5. 역행 라벨, immunocytochemistry, 공촛점 이미징, 정량 colocalization 분석 방법을 결합 다른 방법이 기술을 결합의 성공은 좋은 상표 세포에 따라 크게 달라집니다. <ol><li> 방법은 쉽게 역행의 연결 라벨과 함께 조합하여 사용할 수 있습니다 여기에 시각. 이렇게하려면 70-10, 동물을 마취 및 무균 기술을 사용하여 이러한 양고추냉이 퍼옥시데이즈 (20 % 양고추냉이 퍼옥시데이즈. 시그마 VI, 시그마)으로의 연결을 추적기 삽입, 1 % 밀가루 - 세균은 턱 근육과 같은 말초 대상 지역으로 양고추냉이 퍼옥시데이즈 (시그마)를 aggultinated. 이것의 연결을 추적은 주변 axons로 최대 촬영 및 motoneuron의 somata에 axonal 수송을 통해 운반됩니다. 턱 근육 들어, 추적의 15μl는 살균 10 microliter의 microsyringe를 사용하여 근육에 주입합니다. 마취에서 회복 후 복구를 위해 자신의 새장에 배치까지 동물은 다음 가열 패드에 위치하고 모니터할 수 있습니다. 24 시간 후, 동물 마취 및 생리학 신경을 특징 및 intracellularly 그들을 얼룩. 다음 코발트와 안정기 및 심화로 chromagen 나트륨 tungstate로 tetramethylbenzidine (TMB)를 사용 HRP의 존재에 대한 이상 및 프로세스 조직 섹션에서 설명하는 것처럼 동물을 perfuse. 1 %의 나트륨에 넣어 섹션은 0.1M PBS (산도 6.5)와 15 절대 에탄올과 아세톤에 용해 0.0007 %의 TMB에 녹아있는 tungstate ° C 20 분. 그렇다면 0.3 % 60 분 부화 솔루션 100ml 당 H 2 O 2 1.0 ML를 추가하여 조직 섹션을 반응. 0.05 %의 diaminobenzidine (산도 7.4), 0.02 %의 코발트와 0.01 % H 2 10 분 0.1M PBS (산도 7.4)에서 O 2 0.1M PBS (산도 6.5)에 조직과 장소를 씻어. 37 ° C. 설명한대로 biotinamide로 주입 신경 세포의 시각화를위한 조직을 처리하고 표시된 감각 뉴런과 motoneurons 다양한 사이의 관계를 시각화. </li><li> 여기에 표시된 기술도 쉽게 immnocytochemistry와 함께하실 수 있습니다. 6 예를 들어, immunocytochemically 정확하게 표시 뉴런 사이 시냅스 (그림 3) 찾을 수 synaptophysin에 대한 두뇌를 처리합니다. 이렇게하려면 4 이일 ° C 그리고 23 1H에 대한 안티 마우스 FITC (1:400)에서 품어 ° C.에 대한 마우스 방지 synaptophysin 항체 (1:10,000)에서 뇌 부분을 품어 </li><li> 형광 마커로 표시하거나 형광 이미징을위한 처리 뉴런은 공촛점 이미징에 이상적입니다. 그림 3은 축삭의 부통 통해 공촛점 현미경과 취득 광학 섹션의 예입니다. (그림 3). 라벨 신경 세포 (그림 4)를 통해 여러 광학 부분을 인수하여 분류 뉴런의 애니메이션을 생성할 수 있습니다. </li><li> 이 방법으로 표시 뉴런은 양적 colocalization 분석에 사용할 수 있습니다. 이렇게하려면 (http://phy.ucsf.edu/ ° IDL / colocalization.htm에서 확인) NIH 이미지와 함께 공개 소프트웨어 매크로를 사용합니다. synaptophysin의 immunocytochemistry와 세포내 상표를 결합하여 단일 축삭 터미널 내에서 synaptophysin을 집중하다 6. </li></ol> 6. 대표 결과 : 이 방법을 사용하여 얻을 수있는 대표적인 결과의 개요는 그림 1에서 그림입니다. 이것은 하나의 brainstem 신경이 electrophysiologically 분명히 볼 수 있듯이, mandible 운동 기간 동안 기록되었다,이 신경 세포의 반응 (그림 1 왼쪽, 하늘색 하단)은 운동 중에 변조되었습니다. 이 신경 세포는 electrophysiological 특성 후 biotinamide와 함께 주입하고 이후 시각화에 대한 처리되었습니다. 재건축 신경 세포 (그림 1 중간, 녹색)가 실제 수해부 획기적인 테드,이 경우에는 삼차 모터 핵은 (빨간색 테두리) 지정. 움직임과 재건축 기간 동안의 연결에 따라 응답이 신경 세포는 보조 근육 스핀들 수입 성의 신경 세포로 확인할 수 있습니다. 그림 2 조 변위 동안 신경 세포의 생리적 반응의 대표적인 예를 보여줍니다. 신경 세포의 반응은 즉각적인 발사 주파수로 표현된다. 의 연결 응답이 밀접하게이 특정 신경 세포가 mandibular 위치에 관한 감각 피드백을 제공 나타내는 mandibular 변위를 모방 것을. 그림 3 참고 synaptophysin에 대한 얼룩과 Nissl은 얼룩과 함께 intracellularly 스테인드 축삭의 높은 배율 이미지입니다. 축삭 부통 이내 synaptophysin (노란색)의 colocalization을 확인합니다. 그림 4는 단일 생리학 특징 및 intracellularly 레이블 신경 세포의 애니메이션입니다. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 방법의 개요. 왼쪽 상단 : mandibular 변위. 하나의 신경 (노란색)에서 중간 세포 녹화 (녹색). 이 신경 세포의 형태는 세포 기록하고 주사 후 복원되었다. 레드 개요 삼차 모터 핵의 위치를​​ 나타냅니다. 왼쪽 하단 : 턱 운동 중에이 신경 세포의 생리 반응합니다. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. mandible 운동하는 동안 생체내에 기록된 하나의 근육 감각 신경 세포의 생리 반응 대표. 턱 변위로의 연결 응답의 유사성을 확인합니다. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 탐색 근육 동안 응답 intracellularly 묻은 감각 신경 세포의 시냅스 부튼스 (적색 swellings)와 터미널 axonal arborization. synaptophysin에 대한 후속 immunocytochemical 처리 axonal 부통 (노란색) 이내 synaptophysin의 지방화를 보여줍니다. 녹색 형광 Nissl가 얼룩이다. 그림 4. 생리 반응 mandibular 운동 중에 생체내에 기록된 근육 스핀들 주 수입 성의 신경 세포의 축삭의 애니메이션은 축삭은 다음 intracellularly 스테인드 및 가시화를위한 처리되었습니다. <a href="/files/ftp_upload/2650/collateral4.avi">여기에 그림 4의 고해상도 비디오를 다운로드</a> <a href="/files/ftp_upload/2650/medres.mov">여기에 그림 4의 중간 해상도 비디오를 다운로드</a>

<ol>
	<li>Cuellar, C. A., Tapia, J. A., Juarez, V., Quevedo, J., Linares, P., Marinez, L., Manjarrez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+sinusoidal+electrical+waves+along+the+spinal+cord+during+a+fictive+motor+task.">Propagation of sinusoidal electrical waves along the spinal cord during a fictive motor task.</a> J. Neurosci. 29, 798-810 (2010).</li><li>Frigon, A., Gossard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+specialized+rhythm-generating+mechanisms+in+the+adult+mammalian+spinal+cord.">Evidence for specialized rhythm-generating mechanisms in the adult mammalian spinal cord.</a> J. Neurosci. 30, 7061-7071 (2010).</li><li>Wang, W., Chan, S. S., Heldman, D. A., Moran, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+cortical+representation+of+hand+translation+and+rotation+during+reaching.">Motor cortical representation of hand translation and rotation during reaching.</a> J. Neurosci. 30, 958-962 (2010).</li><li>Ma, C., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+investigating+cortical+control+of+stand+and+squat+in+conscious+behavioral+monkeys.">A method for investigating cortical control of stand and squat in conscious behavioral monkeys.</a> J. Neurosci. Meth. 192, 1-6 (2010).</li><li>Dessem, D., Donga, R., Luo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary-+and+secondary-like+jaw-muscle+spindle+afferents+have+characteristic+topographic+distributions.">Primary- and secondary-like jaw-muscle spindle afferents have characteristic topographic distributions.</a> J. Neurophysiol. 77, 2925-2944 (1997).</li><li>Dessem, D., Moritaini, A., Ambalavanar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+craniofacial+muscle+primary+afferent+neurons+synapse+in+both+the+rostral+and+caudal+brain+stem.">Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem.</a> J. Neurophysiol. 98, 214-223 (2007).</li><li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inputs+from+identified+jaw-muscle+spindle+afferents+to+trigeminothalamic+neurons+in+the+rat:+a+double-labeling+study+using+retrograde+HRP+and+intracellular.">Inputs from identified jaw-muscle spindle afferents to trigeminothalamic neurons in the rat: a double-labeling study using retrograde HRP and intracellular.</a> J. Comp. Neurol. 353, 50-66 (1995).</li><li>Dessem, D., Luo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jaw-muscle+spindle+afferent+feedback+to+the+cervical+spinal+cord+in+the+rat.">Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 128, 451-459 (1999).</li><li>Luo, P., Wong, R., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection+of+jaw-muscle+spindle+afferents+to+the+caudal+brainstem+in+rats+demonstrated+using+intracellular+biotinamide.">Projection of jaw-muscle spindle afferents to the caudal brainstem in rats demonstrated using intracellular biotinamide.</a> J. Comp. Neurol. 358, 63-78 (1995).</li><li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+anatomy+of+physiologically+identified+jaw-muscle+spindle+afferent+terminations+onto+retrogradely+labeled+jaw-elevator+motoneurons+in+the+rat.">Ultrastructural anatomy of physiologically identified jaw-muscle spindle afferent terminations onto retrogradely labeled jaw-elevator motoneurons in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 406, 384-401 (1999).</li><li>Hassani, O. K., Henny, P., Lee, M. G., Jones, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+intermingled+with+orexin+and+MCH+neurons+in+the+lateral+hypothalamus+discharge+maximally+during+sleep.">GABAergic neurons intermingled with orexin and MCH neurons in the lateral hypothalamus discharge maximally during sleep.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 448-457 (2010).</li><li>Inokawa, H., Yamada, H., Matsumoto, N., Muranishi, M., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juxtacellular+labeling+of+tonically+active+neurons+and+phasically+active+neurons+in+the+rat+striatum.">Juxtacellular labeling of tonically active neurons and phasically active neurons in the rat striatum.</a> Neuroscience. 168, 395-404 (2010).</li></ol>

동물 실험 (1985 개정 NIH 출판 번호 86-23) 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 설명서에 명시된 guidlines 및 규정에 따라와 메릴랜드 애니멀 케어 대학에서 수행하고위원회를 사용했다.

여기에 그림이 메서드는 단일 뉴런의 기능에 중요한 통찰력을 제공하는 방법과 각각의 뉴런의 반응의 연결 회로에 기여하는 강력한 기법입니다. 아홉이 지식은 sensorimotor 기능을 이해하는 데 필수적입니다. 이 기법의 가장 큰 장점은 생리학, 형태학 및 신경 형태학 및 배포를 포함한 신경 세포에 대한 매개 변수의 다수의 결정을 허용된다는 점입니다. 이 방법의 예 등의 연결 회로로 후퇴?...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약이나 장비의 명칭 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 전자기 진동 </td><td> 링 동적 시스템 </td><td> V101 </td><td></td></tr><tr><td> 신호 발생기 </td><td> 피드백 시스템 </td><td> PFG605 </td><td> 사다리꼴 출력 신호를 생산 할 수 </td></tr><tr><td> 전극 유리 </td><td> 서터 인 스트 루먼트 </td><td> AF100 - 68-10 </td><td> 필라멘트와 함께 </td></tr><tr><td> 전극 풀러 </td><td> 서터 인 스트 루먼트 </td><td> 모델 P - 2000 P - 80 </td><td></td></tr><tr><td> biotinamide </td><td> 벡터 연구소 </td><td> SP - 1120 </td><td> 4 저장 ° C </td></tr><tr><td> 텍사스 레드 아비딘 DCS </td><td> 벡터 연구소 </td><td> A - 2016 </td><td></td></tr><tr><td> tetramethlyrhodamine </td><td> 분자 프로브 </td><td> D - 3308 </td><td> 3,000 분자량, 라이신 고칠수 </td></tr><tr><td> 마우스 방지 synaptophysin 항체 </td><td> Chemicon </td><td> MAB5258 </td><td></td></tr><tr><td> 형광 Nissl 얼룩 </td><td> Neurotrace, 분자 프로브 </td><td> N - 21480 </td><td></td></tr><tr><td> 전극 시험기 </td><td> 윈스턴 전자 </td><td> BL - 1000 - B </td><td> 전극 임피던스를 측정하는 </td></tr><tr><td> 전위계 </td><td> 액슨 인 스트 루먼트 </td><td> Axoprobe 1A, 2B Axoclamp </td><td></td></tr></tbody></table>

physiological, morphological and neurochemical characterization of neurons modulated by movement

개별 뉴런과의 연결 회로에서 함수의 역할은 감각과 운동 기능의의 연결 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다. 동물은 운동하는 동안 정적 1,2 또는 레코드 세포의 연결 활동을하는 동안 sensorimotor 메커니즘 대부분의 조사는 뉴런 중 하나가 검사에 의존하고 있습니다. 3,4를 이러한 연구는 sensorimotor 기능을 위해 근본적인 배경을 제공하는 동안, 그들 중 기능적 정보를 평가하지 이것은 운동 중에 발생하거나 완전히 신경의 해부, 생리 및 neurochemical 표현형을 특징하는 능력에 제한됩니다. 기술은 생체내 운동의 기간 동안 개별 뉴런의 광범위한 특성을 허용하는 여기에 표시됩니다. 이 기술은 기본 수입 성의 뉴런을 공부뿐만 아니라 motoneurons 및 sensorimotor의 interneurons을 특성화하기 위해뿐만 아니라 사용하실 수 있습니다. 처음에는 하나의 신경 세포의 반응은 신경 세포에 대한 수용 분야의 결정 다음 mandible의 다양한 움직임 동안 electrophysiological 방법을 사용하여 기록됩니다. 의 연결을 추적은 다음 intracellularly 신경 세포에 주입되고 두뇌는 신경 세포가 빛을, 전자 또는 공촛점 현미경 (그림 1)과 시각 수 있도록 처리됩니다. 의 연결 형태가 신경 세포 (Figs. 2,3)의 생리적 반응과 상관 수 있도록 특성화 신경 세포의 자세한 형태는 다음 복원됩니다. 의사 소통이이 기술의 성공적인 구현을위한 중요한 핵심 세부 사항 및 도움말이 제공됩니다. 유용한 추가 정보는 다른 방법과이 방법을 결합하여 연구에서 신경 세포에 대한 결정하실 수 있습니다. 역행의 연결 레이블이 뉴런을 결정하는 데 사용할 수있는 레이블이 붙은 신경 세포의 시냅스와;의 연결 회로의 수 있으므로 자세한 결의. Immunocytochemistry은 표시 신경 세포 내의 신경 전달 물질을 검토하고있는 레이블 신경 세포의 시냅스가 뉴런의 화학 phenotypes을 결정하기 위해이 방법과 함께하실 수 있습니다. 분류 뉴런은 또한 레이블 신경 세포의 ultrastructural 기능과 microcircuitry을 결정하기 위해 전자 현미경을 위해 처리될 수 있습니다. 전체이 기술은 철저하게되므로 sensorimotor 기능에 신경 세포의 역할에 상당한 통찰력을 수 있단 운동의 동안 신경을 특성화하기위한 강력한 방법입니다.

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Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

기술은 운동하는 동안 포유류의 뉴런의 생체내 생리적 반응을 수량과의 연결 형태, neurochemical 표현형 및 시냅스 microcircuitry와 신경 세포의 생리 신원을 확인하도록 설명되어 있습니다.

운동에 의해 변조된 뉴런의 생리, 형태학의 및 Neurochemical 특성화

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

physiological-morphological-neurochemical-characterization-neurons

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K 조회수.  University of Maryland. 기술은 운동하는 동안 포유류의 뉴런의 생체내 생리적 반응을 수량과의 연결 형태, neurochemical 표현형 및 시냅스 microcircuitry와 신경 세포의 생리 신원을 확인하도록 설명되어 있습니다.

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Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulation 및 Mitochondrial 교통 : 긴 기간이 이상 Hippocampal 뉴런의 라이브 영상

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

연구

신경과학

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

교양 CNS의 뉴런의 돌기 스파인 형태론 분석

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracellularly의 근육 모터 풀에 모터 뉴런을 확인<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

3 차원 영상 및 인간 Intraepidermal 신경 섬유 내 미토 콘 드리 아의 분석

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

형광 프로브를 이용한 배양 된 뉴런의 엔도 좀과 리소좀 기능의 정량화

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human neurons, which may contribute to neurodegeneration in various disease states. Although it is challenging to examine mitochondrial dynamics in live human nerves, such paradigms are critical for studying the role of mitochondria in neurodegeneration. Described here is a protocol for analyzing mitochondrial transport and mitochondrial morphology in forebrain neuron axons derived from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). The iPSCs are differentiated into telencephalic glutamatergic neurons using well-established methods. Mitochondria of the neurons are stained with MitoTracker CMXRos, and mitochondrial movement within the axons are captured using a live-cell imaging microscope equipped with an incubator for cell culture. Time-lapse images are analyzed using software with &#34;MultiKymograph&#34;, &#34;Bioformat importer&#34;, and &#34;Macros&#34; plugins. Kymographs of mitochondrial transport are generated, and average mitochondrial velocity in the anterograde and retrograde directions is read from the kymograph. Regarding mitochondrial morphology analysis, mitochondrial length, area, and aspect ratio are obtained using the ImageJ. In summary, this protocol allows characterization of mitochondrial trafficking along axons and analysis of their morphology to facilitate studies of neurodegenerative diseases.

Impaired mitochondrial transport and morphology are involved in various neurodegenerative diseases. The presented protocol uses induced pluripotent stem cell-derived forebrain neurons to assess mitochondrial transport and morphology in hereditary spastic paraplegia. This protocol allows characterization of mitochondrial trafficking along axons and analysis of their morphology, which will facilitate the study of neurodegenerative disease.

유전 경직 성 하반신 마비에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런에서 미토콘드리아 수송 및 형태 분석

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

An Introduction to Neurophysiology

Neurophysiology is broadly defined as the study of nervous system function. In this field, scientists investigate the central and peripheral nervous systems at the level of whole organs, cellular networks, single cells, or even subcellular compartments. A unifying feature of this wide-ranging discipline is an interest in the mechanisms that lead to the generation and propagation of electrical impulses within and between neurons. This subject is important not only for our understanding of the fascinating processes driving human thought, but also for our ability to diagnose and treat disorders related to nervous system malfunction. This video will provide an introduction to the field of neurophysiology, beginning with a brief history of neurophysiological research that showcases landmark studies like Galvani&#8217;s observations of twitching frog legs and Eccles&#8217;s discovery of the chemical synapse. Next, key questions asked by neurophysiologists are introduced, followed by an overview of some prominent experimental tools used to answer those questions. The methods presented range from techniques used to investigate single cells, like patch clamping, to those that can measure activity across large regions of the brain, like electroencephalography (EEG). Finally, applications of neurophysiological research are discussed, including the development of brain-machine interfaces that allow for device control using thought.

Introduction to Neurophysiology: Methods &amp; Applications

신경 생리학 소개

 Neurophysiology is broadly defined as the study of nervous system function. In this field, scientists investigate the central and peripheral nervous ...

교육

JoVE Science Education

심화생물학

An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience

Cellular and molecular neuroscience is one of the newest and fastest growing subdisciplines in neuroscience. By investigating the influences of genes, signaling molecules, and cellular morphology, researchers in this field uncover crucial insights into normal brain development and function, as well as the root causes of many pathological conditions.
This video introduction to the fascinating world of cellular and molecular neuroscience begins with a timeline of landmark studies, from the discovery of DNA in 1953 to more recent breakthroughs like the cloning of ion channels. Next, key questions in the field are introduced, such as how genes influence neuron activity and how the nervous system is modified by experience. This is followed by brief descriptions of some prominent methods used to analyze genetic material in neurons, manipulate expression of genes, and visualize neurons and their parts. Finally, several applications of molecular and cellular neuroscience are presented to demonstrate how cellular and molecular approaches can be used to profile neuron populations and explore their functions.

Cellular and Molecular Neuroscience Research

세포 및 분자 신경 과학 소개

Cellular and molecular neuroscience is one of the newest and fastest growing subdisciplines in neuroscience. By investigating the influences of genes, ...

운동에 의해 변조된 뉴런의 생리, 형태학의 및 Neurochemical 특성화

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