이 작품은 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIAID), 국립 보건 연구소 (NIH), 미국의 교내 연구 부문에 의해 지원되었다. 모든 마우스는 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIAID)에서 실험 동물 관리 공인 동물 시설의 인증을위한 미국 협회에서 관리 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서에 설명 된 절차에 따라 보관 하였다 NIAID의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜의 후원하에.

1. 마우스 골수 세포의 분리 <ol><li> 기관의 동물 관리위원회의 승인 프로토콜을 사용하여 쥐를 안락사와 70 % 에탄올과 동물의 표면을 스프레이. </li><li> 중반 복부 피부의 절개를 확인하고 하반신을 덮고있는 피부를 포함한 마우스의 말초 부분에서 피부를 제거합니다. </li><li> 가위를 사용하여 하반신의 근육을 잘라 대퇴골 머리를 깨고 피하면서 조심스럽게 고관절의 비구를 탈구. </li><li> 메스와 가위를 사용하여 대퇴골과 경골에 남아있는 근육을 제거하고 뼈 끝을 중단하지 않도록 무릎 관절 운동 치료의 경골에서 대퇴골을 분리합니다. 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충 얼음처럼 차가운 RPMI 1640 1X를 포함하는 페트리 접시에 뼈를 놓습니다. </li><li> 조직 문화 후드에서 다음 단계를 진행합니다. neutrophi을 방지하기 위해 엄격한 무균 기술을 유지하기 위해 추가 조치를 취L 활성화. </li><li> 뼈의 표면에서 에탄올을 씻어하는 얼음처럼 차가운 멸균 PBS 세 이후의 세척 (배양 접시 내에서) 다음에 70 % 에탄올 (페트리 접시 이내) 각 뼈를 씻어. </li><li> 깨끗한 멸균 페트리 접시 안에, 뼈의 epiphyses을 차단하고 따로 보관하십시오. </li><li> 25 게이지 바늘과 RPMI 10 % FBS, 2 mM의 EDTA가 첨가 가득 12 CC 주사기를 사용하고, 100 μM가 장착 된 50 ML 나사 최고 팔콘 튜브에 뼈 샤프트의 양쪽 끝에서 골수 세포를 세척 필터링합니다. 효율적으로 모든 세포를 제거하기 위해 25 게이지 바늘을 사용하여 뼈의 안쪽 표면을 긁어. </li></ol> 참고 : 뼈의 창백은 세포가 충분히 긁어되었음을 나타냅니다. 참고 : 대퇴골 / 경골 쌍을 플러시 미디어의 약 10 ㎖를 사용합니다. 매체에 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 추가하면 세포의 응집 방지하기 위해 필수적이다. <ol start="9"><li> 뼈 epiphyses 컷메스와 2.5 ML Eppendorf의 Combitip 플러스 Biopur 피펫 팁의 뒤쪽 끝 부분을 사용하여 100 μm의 필터를 통해 그들을 부수어 작은 0.5 mm 3 조각합니다. </li><li> 4 ℃에서 12 분간 1,400 rpm으로 원심 분리 </li><li> 약 20 초 동안 염화나트륨 0.2 % 20ml에 세포 펠렛을 현탁하여 적혈구를 용해는 1.6 % 염화나트륨 20 mL를 첨가하여. (중요 : 골수 세포 죽음을 피하기 위해 저장성 용해 20 ~ 30 초를 초과하지 마십시오 후자는 호중구를 활성화 할 수있는 잠재력을 가지고 있기 때문에 용해에 대한 저장성 염화나트륨의 사용은 ACK lysing 버퍼에 좋습니다.). </li><li> 4에서 1,400 rpm으로 12 분 동안 원심 분리기 ° C 세포를 수집합니다. </li><li> 10 % FBS, 2 mM의 EDTA로 보충 RPMI 1640 1X와 세포를 씻고 단계 1.12에서와 같이 원심 분리기. </li><li> 이 방법을 사용하여 골수 세포의 수율은 약 60-80000000 감염 8~12주 된 C57BL / 6 마​​우스의 기준입니다. </li></ol> 2. 호중구의 분리밀도 기울기 원심 분리하여 <ol><li> 골수 세포를 계산하고 얼음처럼 차가운 멸균 PBS 1 ML에 resuspend을. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브에 Histopaque 1119 3 ㎖ (밀도 1.119 g / ㎖)를 추가합니다. </li><li> Histopaque 1119 3 ML에 Histopaque 1077의 오버레이 3 ML (밀도 1.077 g / ㎖). </li></ol> 참고 : Histopaque 1119 및 Histopaque 1077는 18-26로 예열해야 ° C 사용하기 전에. 중요한 단계 : 즉시 미리 그라디언트는 두 레이어와 최적 호중구 순결과 복구 사이에 확산 될 것 준비로 사용하기 전에 그라디언트를 준비합니다. 중요한 단계 : 오버레이하기 원심 분리하는 동안 세포 분리를 배제 할 두 가지 밀도, 혼합 방지하기 위해 천천히 수행 할 1119의 요구에 Histopaque 1077. <ol start="4"><li> Histopaque 1077의 상단에 골수 세포 현탁액을 오버레이. </li></ol> 중요한 단계 : Overl세포와 1077 Histopaque 사이의 인터페이스를 방해 방지하기 위해 천천히 수행 할 수 Histopaque 1077의 요구에 골수 세포 현탁액을 아잉. 참고 : PBS 1 ML에 감염되지 않은 쥐의 골수 세포를 현탁하여&gt; 90 %의 호중구 순도를 얻을 수 있습니다. 그러나 많은 골수 샘플을 풀링하여 호중구 순도를 떨어 뜨리고, 예를 들어, 3 ML PBS가 ~ 80 %&gt; 90 %에서 호중구의 순도를 줄일 수있는 300 X 10 6 세포를 현탁. 따라서 연구자들은 특정 실험에 이상적인 세포 수 / 볼륨 상태를 식별하는 파일럿 실험을 수행해야 <ol start="5"><li> 25 2,000 rpm에서 30 분 ° 브레이크없이 C를위한 원심 분리기. </li></ol> 참고 : 상온에서 기울기 원심 분리하여 호중구의 효과적인 분리를위한 중요하고 필수적이다. <ol start="6"><li> Histopaque 1119 인터페이스에서 호중구를 수집하고 1077 레이어를 Histopaque. </리&gt; <li> RPMI 두 번 수집 된 호중구를 씻어 1640 1X 10 % FBS, 4시 7 분을위한 1,400 rpm에서 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 원심 분리기 ° C.로 보충 </li><li> 호중구를 계산하고 자신의 생존을 결정합니다. </li></ol> 참고 : 호중구는 전형적으로&gt; FACS 분석에 의해 결정된 95 %의 생존과&gt; 90 % 순수. 감염 8~12주 된 C57BL / 6 마우스의 골수에서 호중구의 전형적인 수익률 (즉, 2 대퇴골 2 경골 뼈) ~ 6-12000000 세포이다. 백혈구는 감염 동물의 골수에서 수확 할 때이 숫자는 상당히 큽니다. 칸디다 균에 감염된 생쥐 세포 수확 6에 사용되었을 때 따라서, ~ 30-40000000 호중구 / 마우스를 회수 하였다. 3. CellTracker 염료를 사용하여 호중구의 레이블 <ol><li> 5시에 호중구를 resuspend을 X 10 6 세포 / PBS에 ML 37에 prewarmed ° C. </li><li> 최종 concent에서 CellTracker 염료를 추가5 μM의 식량. </li></ol> 참고 : CellTracker 그린 (CMFDA (5 Chloromethylfluorescein의 디아) 및 CellTracker 오렌지 (CMTMR (5 - (및-6)-4-클로로 벤조일 아미노 테트라 메틸)는 차동 야생형 유전자 결핍에서 호중구의 레이블이 프로토콜에서 사용 된 마우스. 참고 : 실험 당일까지 -80에서 10 CellTracker 녹색의 mm와 CellTracker 오렌지, 나누어지는 및 매장의 재고 솔루션 ° C를 준비합니다. <ol start="3"><li> 어둠 속에서 떨고 물 목욕 37 ° C에서 10 분에 해당하는 CellTracker 염료의 5 μM로 호중구를 품어. </li><li> 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충 얼음처럼 차가운 RPMI 1640 1X로 두 번 세포를 씻으십시오. </li></ol> 참고 : 세포의 효율적인 세정 CellTracker 염료와 라벨링 단계는 다운을 위해 차동 - 라벨 호중구 인구를 혼합하기 전에 염색 교차 오염을 방지하는 것이 필수적입니다 후tream 경쟁력을 다시 채우기 연구. 4. 마우스 및 유동 세포 계측법을 사용하여 전송 호중구의 분석에서 호중구의 입양 전송 <ol><li> 25 X 10 6 세포 / ㎖, 5 × 10 6 호중구는 마우스 당 전송되도록 측면 꼬리 정맥에 현탁액 200 μl를 주입 농도에 얼음처럼 차가운 PBS에서 호중구를 Resuspend. 경쟁력을 다시 채우기의 호중구 연구의 경우, 1:1의 비율로 야생형 유전자가 결핍 된 호중구를 혼합하고 상기와 같이 마우스 당 5 × 10 6 호중구의 총을 주입. </li></ol> 참고 : 적어도 최대 10 X 10 6 호중구가 adoptively 동물에 명백한 즉시 독성없이 마우스 당 전송할 수 있습니다. <ol start="2"><li> 입양 전송 (예 : 1, 2, 3 또는 4 시간 후 전송)에 따라 서로 다른 시간에, 마우스 및 수확 혈액을 안락사 및 / 또는 그 골수 및 / 또는 기타 표적 장기 (들). </li><li> SI 준비게시 된 프로토콜 6,15를 사용하여 adoptively 전송 표시 호중구의 양적 및 질적 분석을 위해 이러한 조직에서 ngle 세포 현탁액. </li><li> 죽은 / 라이브 생존 염색 구단 봉쇄, CD45 (클론 30-F11)의 라벨 세포 Ly6G (복제 1A8)와 CD11b (복제 M1/70) 및 게이트 라이브 CD45 + Ly6G + CD11b + 호중구합니다. 다음 이 게이트 호중구 FITC + (CellTracker 녹색으로 표시하는 경우) 또는 PE + (셀 추적기 주황색으로 표시하는 경우)은 수신자 마우스의 기본 호중구뿐만 아니라 adoptively 전송 표시 호중구를 포함합니다. </li></ol> 참고 : 호중구 적어도 4 시간 후 전송 칸디다 균에 감염된 생쥐의 혈액, 골수 및 신장에서 추적 할 수 있습니다. 참고 : PBS의 2 % 파라 포름 알데히드로 고정 나쁜 CellTracker의 할머니로 표시된 호중구의 평균 형광 강도에 영향을 미치지 않습니다최소 48 시간 동안 een과 나 CellTracker 오렌지.

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저자는 그들이 더 경쟁 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에 우리는 밀도 기울기 원심 분리 방식을 사용하여 고순도 생존과 생쥐의 골수에서 호중구의 큰 숫자의 절연을위한 신뢰성, 빠르고 간단하고 경제적 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜이 올바르게 수행 될 때, ~ 6-12 × 10 6 백혈구는 감염 마우스에서 복구 할 수 있으며, 많은 ~으로 30 ~ 40 × 10 6 백혈구는 감염 후 6 마우스에서 분리 할 수 있습니다. 격리 된 호중구 80-95 % ?...

호중구는 인간의 가장 풍부한 백혈구 수 있습니다. 그들은 미생물 침입에 대한 방어의 첫 번째 라인으로 타고난 면역 시스템과 법의 주요 세포 구성 요소입니다. 호중구 수 및 / 또는 기능에 영향을 인수 호중구 감소증 및 기본 면역 부전 환자 호스트 방어 1이 세포의 중요성을 강조 생명을 위협하는 침입 세균 및 곰팡이 감염을 개발할 수 있습니다. 염증 조직 2에 혈류에서 채용 호중구 수있는 화성 그라데이션을 생성 chemoattractants의 분비로 연결 조율 타고난 면역 반응의 유도에 자신의 동족 패턴 인식 수용체 결과에 감염 사이트에서 병원균 침입의 면역 인식 . 호중구는 감염 사이트를 입력 한 후, 그들은 활성화되고, 이는 사이토 카인과 케모카인 생산, 병원균의 이해에 이르게하고, 산화 비 산화 나를 통해 살해chanisms 3. 타고난 면역 자신의 잘 인식 역할 외에, 호중구는 최근 효과적인 적응 면역 반응 4 개시로 중요한 역할을 보여왔다. 5-7 감염 및 면역 질환의 다양한 같이 다른 한편으로는, 떨어져 면역 자신의 보호의 역할에서, 호중구는 또한 과도한 축적 및 / 또는 염증의 사이트에서 활성화로 인한 조직 손상과 면역 병리를 중재 할 수 있습니다. 설치 효과적인 타고난 면역 반응과 여러 전염성 질환 및 염증, 신뢰성 실험 프로토콜이 세포 부족을 취급와 기술적 인 문제에서의다면 발현 이펙터 기능이있는 호중구의 필수 불가결 한 역할에도 불구하고 지난 수십 년 동안 호중구와 연구를 방해하고있다. 따라서 호중구의 분리에 대한 재현성 분석의 사용은 호중구 매​​개 immunolo에 대한 추가 연구를 촉진해야한다gical 기능 전직 생체 내 및 생체있다. 지금까지 여러 가지 방법이 같은 인간의 혈액의 밀도 기울기 원심 분리 및 마우스 혈액이나 골수 8,9, 마우스 혈액이나 골수 10,11에서 호중구의 긍정적이거나 부정적인 면역 자기 농축으로 호중구의 분리에 대해 설명하고, 수확 한 thioglycollate이나 다른 염증성 에이전트 12의 복강 내 주입 후 생쥐의 복강에서 호중구. 호중구는 쉽게 인간의 혈액에서 큰 숫자에서 격리 할 수 있지만,이 방법은 기능 연구 또는 입양 전송 실험 13 충분한 호중구의 분리를 배제 마우스 혈액의 제한된 볼륨에 의한 생쥐에 최적입니다. 의 수율 thioglycollat​​e가-이끌어하지만 또한 복강에서 세포가 쥐의 혈액에 비해 큰 경우 염증 복막 세척에서 호중구의 순도 사이에 차이가중가와 격리 된 호중구가 활성화 표현형을 나타냅니다. 따라서, 세포는 마우스 복강이 정상 상태 12에서 몇 가지 호중구가이 방법 만, 활성화의 기능 연구를 수행하는 데 사용하지만 자극받지 호중구 수 있습니다 사용하여 수집. 대신, 골수 그런 다음 식균 작용, 살인 및 탈과립, 또는받는 마우스로 입양 전송 등의 다운 스트림 기능을 연구에 사용할 수있는 하나 비자극 또는 활성화 된 호중구 11,14, 많은 수확을위한 편리한 저수지이다. 여기에 우리는 높은 수율을 제공하는 간단하고 빠른 (~ 2 시간) 프로토콜을 설명 (~ 6-12 × 10 6 호중구 / 감염 마우스 또는 최대 30-40 × 10 6 호중구 / 감염된 마우스) 순수 (80 -95 %), 골수에서&gt; 95 % 생존율과 호중구. 이 방법은 밀도 기울기 세포 분리되어 있습니다 시중 Histopaque를 사용Ficoll 나트륨 diatrizoate 구성된 배급 매체는, 마우스의 골수에서 백혈구를 분리합니다. 이 방법은 혈액이나 복막 캐비티에 비해 마우스 당 호중구의 상당히 큰 숫자를 얻을, 그것은 정상 상태에서 또는 감염 후 두 생쥐에서 호중구를 수집하는 데 사용, 그것은 불연속을 사용하는 밀도 기울기 원심 분리 방식에 비해 레이어에 쉽게 할 수 있습니다 55 % / 65 % / PBS 9의 75 % Percoll로 구성된 Percoll 기울기. 또한, 시간과 순수한 호중구를 수집하는 데 필요한 자원이 크게 형광 활성화 된 셀 정렬을 사용하여 호중구의 분리에 비해 감소된다. 또한,이 방법은 면역 자기 농축 단계를 포함하지 않기 때문에,보다 비용 효율적이며, 따라서 호중구 활성화의 가능성을 감소, 자기 열에 항체에 세포의 노출을 방지 할 수 있습니다. 고립 neutroph의 기능 연구를 수행하는 이외에ILS 생체 및받는 생쥐에 세포의 입양 전송이 프로토콜은 서로 다른 CellTracker 염료를 사용하여 격리 된 호중구의 레이블하는 방법을 설명합니다. 다양한 유전 적 배경 생쥐에서 호중구의 차이 라벨은 혈액에서 호중구의 인신 매매의 특정 유전자의 직접적인 역할에 대한 기계론의 통찰력을 제공 할 수있는 유동 세포 계측법을 사용하여받는 사람 쥐의 조직에서 전송 된 호중구를 추적하기위한 경쟁 재 증식 연구에 적용 할 수 있습니다 대상 염증 기관 6에.

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES</td><td>Cellgro</td><td>10-041-CV</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)</td><td>GemCell</td><td>100500</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Quality Biological Inc</td><td>351-027-101</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.2% and 1.6% sodium chloride</td><td>JT Baker</td><td>3624</td><td>Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered</td></tr><tr><td>Sterile filtered Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td>Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Sterile filtered Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium</td><td>Cellgro</td><td>210-40-CV</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol (200 proof)</td><td>The Warner Graham Company</td><td>64-17-5</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate)</td><td>Invitrogen</td><td>C-7025</td><td>Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)</td><td>Invitrogen</td><td>C-2927</td><td>Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11)</td><td>eBioscience</td><td>170451-82</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>551461</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>560599</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11b (Clone M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>47-0112-82</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td>Use at 1:100 dilution</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td><td>Molecular Probes</td><td>L-23105</td><td>Use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>67-68-5</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td><td>USB Corporation</td><td>19943</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>C57BL/6 mice</td><td>Taconic</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml centrifuge tubes</td><td>Corning</td><td>430053</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>25 ml serological pipettes</td><td>Celltreat</td><td>229225B</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10 ml serological pipettes</td><td>Celltreat</td><td>229210B</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>5 ml serological pipettes</td><td>Celltreat</td><td>229205B</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Pasteur pipettes (3 ml)</td><td>BD Falcon</td><td>357575</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>12 ml syringes</td><td>Kendall monoject</td><td>512878</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)</td><td>BD</td><td>305122</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>100 mm cell strainers</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bactericidal Petri dishes</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Combitips Plus Biopur</td><td>Eppendorf</td><td>2249608-5</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel)</td><td>Biomedical Research Instruments</td><td>10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000</td><td>Instruments sterilized prior to use</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Tissue culture hood</td><td>The Baker Company</td><td>SG403</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>75004521</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C shaking water bath</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>3166721</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol.&lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments

호중구는 타고난 면역 시스템의 중요한 효과기 세포입니다. 그들은 빠르게 급성 염증의 사이트에서 모집하고 염증 환경에 따라 보호 또는 병원성 효과를 발휘합니다. 그럼에도 불구하고, 다른 전염성 질환 및 염증성 조건에서 호중구의 &#39;음향과 immunopathogenic 효과를 중재하는 분자 요인의 면역 자세한 이해 호중구의 필수 불가결 한 역할에도 불구하고 아직도 부분적으로 때문에 그들의 짧은 반감기, 이들의 처리에 어려움, 부족한 세포 및 다운 스트림 기능 연구와 입양 전송 실험 호중구의 충분한 숫자를 얻기위한 신뢰성있는 실험 프로토콜의 부족. 따라서, 간단하고, 빠르고, 경제적이며 신뢰할 수있는 방법은 식균 작용, 살인, 시토 킨 생산, 탈과립 및 인신 매매 등의 기능을 평가하기위한 마우스 호중구 충분한 수의 수확에 매우 바람직하다. 이를 위해,우리는 높은 순도와 가능성과 생쥐의 골수에서 백혈구의 큰 숫자를 분리하는 어떤 실험실에서 적용 할 수있는 재생 밀도 기울기 원심 분리 기반의 프로토콜을 제시한다. 더욱이, 우리는 adoptively 유동 세포 계측법을 사용하여 적어도 4 시간 후 전송받는 생쥐에 옮겨와 여러 조직에서 추적 할 수있는 고립 된 호중구, 레이블 CellTracker 염료를 사용하는 간단한 프로토콜을 제시한다. 이 방법을 사용하면 다른 CellTracker 염료와 야생형 유전자 결핍 생쥐에서 호중구의 차이 라벨이 성공적으로 생체 내 표적 조직에 혈액에서 호중구의 거래에서 특정 유전자의 직접적인 역할을 평가하기위한 경쟁력을 다시 채우기 연구를 수행하기 위해 고용 수 있습니다 .

이 프로토콜은 쥐의 골수 세포와 시중 Histopaque 세포 분리 매체를 사용하여 밀도 기울기 원심 분리하여 이들 세포에서 호중구의 연속적인 분리의 수확에 최적화되어 있습니다. 호중구는이 방법을 사용하는 것은 다운 스트림 기능 연구 전직 생체의 다양한 사람과받는 사람의 생쥐의 입양 전송 실험에 사용할 수입니다. 감염 8-12주 된 C57BL / 6 마​​우스 당 대퇴골과 경?...

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Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

우리는 밀도 기울기 원심 분리하여 및 CellTracker 염료를 사용하여 호중구 라벨링 마우스 골수에서 호중구의 분리 및 정제를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 스트림 기능 연구 또는 입양 전송 및 추적 실험 호중구의 큰 숫자를 얻기위한 간단하고 빠른 재생하고 경제적 인 방법을 나타냅니다.

분리, 정제 및 기능 연구 및 입양 전송 실험 쥐의 골수 호중구의 라벨링

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

isolation-purification-labeling-mouse-bone-marrow-neutrophils-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

61.7K 조회수.  National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH. 우리는 밀도 기울기 원심 분리하여 및 CellTracker 염료를 사용하여 호중구 라벨링 마우스 골수에서 호중구의 분리 및 정제를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 스트림 기능 연구 또는 입양 전송 및 추적 실험 호중구의 큰 숫자를 얻기위한 간단하고 빠른 재생하고 경제적 인 방법을 나타냅니다.

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Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

분리 및 설치류 골수의 정맥 주사 유래 단핵구

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in diameter. MPs are a newly evolving, important part of cell-to-cell communication and signaling machinery. Because of their size and the nature of their release, until recently MP existence was overlooked. However, with improved technology and analytical methods their function in health and disease is now emerging. The protocols presented here are aimed at isolating and characterizing PMN-MPs by flow cytometry and immunoblotting. Moreover, several implementation examples are given. These protocols for MP isolation are fast, low-cost, and do not require the use of expensive kits. Furthermore, they allow for the labeling of MPs following isolation, as well as pre-labeling of source cells prior to MP release, using a membrane-specific fluorescent dye for visualization and analysis by flow cytometry. These methods, however, have several limitations including purity of PMNs and MPs and the need for sophisticated analytical instrumentation. A high-end flow cytometer is needed to reliably analyze MPs and minimize false positive reads due to noise or auto-fluorescence. The described protocols can be used to isolate and define MP biogenesis, and characterize their markers and variation in composition under different stimulating conditions. Size heterogeneity can be exploited to investigate whether the content of membrane particles versus exosomes is different, and whether they fulfill different roles in tissue homeostasis. Finally, following isolation and characterization of MPs, their function in cellular responses and various disease models (including, PMN-associated inflammatory disorders, such as Inflammatory Bowel Diseases or Acute Lung Injury) can be explored.

New protocols are described here to isolate and characterize microparticles derived from human and mouse neutrophils. These protocols utilize ultracentrifugation, flow cytometry, and immunoblotting techniques to analyze microparticle content, and they can be used to study the role of microparticles derived from various cell types in cellular function.

절연 및 특성화 Neutrophil 파생 된 미의 기능 연구

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

Vivo에서 마우스 모델을 측정 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산 및 골 수 유래 수지상 세포에 의해 유도 된 Th1 차별화

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

A Comprehensive High-Efficiency Protocol for Isolation, Culture, Polarization, and Glycolytic Characterization of Bone Marrow-Derived Macrophages

Macrophages are among the most important antigen-presenting cells. Many subsets of macrophages have been identified with unique metabolic signatures. Macrophages are commonly classified as M1-like (inflammatory) and M2-like (anti-inflammatory) subtypes. M1-like macrophages are pro-inflammatory macrophages that get activated by LPS and/or pro-inflammatory cytokines such as INF-&#947;, IL-12 &#38; IL-2. M1-like polarized macrophages are involved in various diseases by mediating the host&#39;s defense to a variety of bacteria and viruses. That is very important to study LPS induced M1-like macrophages and their metabolic states in inflammatory diseases. M2-like macrophages are considered anti-inflammatory macrophages, activated by anti-inflammatory cytokines and stimulators. Under the pro-inflammatory state, macrophages show increased glycolysis in glycolytic function. The glycolytic function has been actively investigated in the context of glycolysis, glycolytic capacity, glycolytic reserve, compensatory glycolysis, or non-glycolytic acidification using extracellular flux (XF) analyzers.
This paper demonstrates how to assess the glycolytic states in real-time with easy-to-follow steps when the bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are respiring, consuming, and producing energy. Using specific inhibitors and activators of glycolysis in this protocol, we show how to obtain a systemic and complete view of glycolytic metabolic processes in the cells and provide more accurate and realistic results. To be able to measure multiple glycolytic phenotypes, we provide an easy, sensitive, DNA-based normalization method for polarization assessment of BMDMs. Culturing, activation/polarization and identification of the phenotype and metabolic state of the BMDMs are crucial techniques that can help to investigate many different types of diseases.
In this paper, we polarized the na&#239;ve M0 macrophages to M1-like and M2-like macrophages with LPS and IL4, respectively, and measured a comprehensive set of glycolytic parameters in BMDMs in real-time and longitudinally over time, using extracellular flux analysis and glycolytic activators and inhibitors.

This protocol provides detailed and comprehensive methods for the isolation, culture, polarization, and measurement of the glycolytic metabolic state of live bone marrow-derived macrophages (BMDMs). This paper provides step-by-step instructions with realistic visual illustrations for workflow and glycolytic assessment of BMDMs in real-time.

Macrophages are among the most important antigen-presenting cells. Many subsets of macrophages have been identified with unique metabolic signatures. ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

신생아 골수 유래 대식세포의 식세포 분석 평가 

Neonatal Mouse Bone Marrow Isolation and Preparation of Bone Marrow-Derived Macrophages

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging and time-consuming, yet for some models, it is translationally relevant and necessary. This protocol describes an efficient and straightforward method for preparing bone marrow cells from 7-9-day-old pups. These cells can then be further isolated or differentiated into specific cell types of interest. Macrophages are crucial immune cells that play a major role in inflammation and infection. During development, neonatal macrophages contribute significantly to tissue remodeling. Moreover, the phenotype and functions of neonatal macrophages differ from those of their adult counterparts. This protocol also outlines the differentiation of neonatal macrophages from the isolated bone marrow cells in the presence of L929-conditioned medium. Surface markers for differentiated neonatal macrophages were assessed using flow cytometric analysis. To demonstrate functionality, the phagocytic efficiency was also tested using pH-sensitive dye-conjugated Escherichia coli.

저자 스포트라이트: Developing a Reproducible Method for Isolating Bone Marrow-Derived macrophages from Neonatal Mice to Advance Early Life Immune Response(신생아 마우스에서 골수 유래 대식세포를 분리하여 조기 면역 반응을 촉진하기 위한 재현성 있는 방

This protocol describes a non-enzymatic and straightforward method for isolating 7-9-day-old neonatal mouse bone marrow cells and generating differentiated macrophages using a supernatant of L929 cells as a source of granulocyte colony-stimulating factor (M-CSF). The bone marrow-derived macrophages were further analyzed for surface antigens F4/80, CD206, CD11b, and functional competency.

신생아 마우스 골수 분리 및 골수 유래 대식세포의 준비

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging ...

분리, 정제 및 기능 연구 및 입양 전송 실험 쥐의 골수 호중구의 라벨링

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분리 및 설치류 골수의 정맥 주사 유래 단핵구

절연 및 특성화 Neutrophil 파생 된 미의 기능 연구

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

Vivo에서 마우스 모델을 측정 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산 및 골 수 유래 수지상 세포에 의해 유도 된 Th1 차별화

호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비

A Comprehensive High-Efficiency Protocol for Isolation, Culture, Polarization, and Glycolytic Characterization of Bone Marrow-Derived Macrophages

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

신생아 마우스 골수 분리 및 골수 유래 대식세포의 준비

신생아 마우스 골수 분리 및 골수 유래 대식세포의 준비

신생아 마우스 골수 분리 및 골수 유래 대식세포의 준비