우리는 영어 편집 닥터 사이먼 바 틀을 감사합니다. 이 연구는 Instituto de에서 교부 금에 의해 지원 되었다 건배 카를로스 3 세 (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), 미겔 세르 프로그램과 Fundación 라몬 Areces; 함께 Fondo Europeo 드 개발 지역 (페더)에서 공동 자금. CNIC 경제 산업성, 산업 및 경쟁력 (MEIC), 그리고 프로 CNIC 재단에서 지원 하 고는 세 베로 오 초아 센터의 우수 (SEV-2015-0505). RTF Fundación 라몬 Areces CNIC, VZG ISCIII, BHF Instituto de에 의해 의해 의해 설립 Investigación Sanitaria 병원 12 드 Octubre (imas12)와 ISCIII 미겔 세르 프로그램 및 imas12에 의해 JMG-G.

실험 절차 Fundación 센트 나시오날 드에 의해 승인 되었다 Investigaciones Cardiovasculares 카를로스 3 세 (CNIC)와 스페인과 유럽 지침에 따라 지방의 Autónoma 드 마드리드. 마우스는 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 조건에서 자란 했다 그리고 이산화탄소 (CO2) 흡입에 의해 안락사 되었다.
1. 절연 Tibias 화관에서 마우스 골 수 세포의
참고: C57BL/6 congenic 마우스 스트레인 운반 차동 백혈구 마커는 Ptprc는는, 야생-타입 C57BL 긴장 Ptprcb 대립 유전자, CD45.2 또는 Ly5.2로 알려진, 수행 하는 반면에, CD45.1 또는 Ly5.1로 일반적으로 인식 합니다. CD45.1 및 CD45.2 변종 cytometry 항 체를 사용 하 여 구분할 수 있습니다. CD45.1, CD45.2, 및 CD45.1/CD45.2 쥐 입양 전송, cytometry에 의해 뚜렷한 세포 인구의 추적을 허용에 대 한 셀 소스 또는 받는 사람으로 사용할 수 있습니다. 나이 우선적으로 사용-및 나이의 12 주 아래 섹스 일치 하는 남성 또는 여성 쥐.
<ol><li>
화관과 Tibias의 준비
	<ol>
<li>제도 동물 보호 위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 사용 하 여 마우스를 안락사</li>
		<li>70% 에탄올과 동물 표면에 분사 하 여 뒷 다리 사지를 소독.</li>
		<li>살 균가 위, 집게와 scalpels 사용 합니다. 메스로 피부에 상처를 만들고 후부 사지를 포함 하는 피부를 포함 하 여 마우스의 원심 부분에서 피부를 제거. 낮은 종 아리 근육 주위 피부 껍질과 다리에서 피부를 완전히 제거 (그림 2A, 2B).</li>
		<li>메스를 사용 하 여 대 퇴 골에서 quadriceps 근육을 구분 합니다. 고관절 대 퇴 골 머리 깨지 않고 disarticulate. 메스 (그림 2C, 2D)를 사용 하 여 경골에서 근육을 제거 합니다. 뼈 끝을 깨지 않고 경골에서 대 퇴 골을 구분 합니다.</li>
		<li>10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 1% 페니실린/스 얼음 1 x 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체에 포함 된 배양 접시에서 뼈를 유지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포 격리 참고: 모든 후속 단계는 문화 후드와 오염을 피하기 위하여 살 균 물자로 수행 되어야 합니다.<ol>
<li>멸 균 페 트리 접시에 메스와 각 뼈의 인접 하 고 원심 끝을 잘라 신중 하 게.</li>
		<li>완전 따뜻한 RPMI 매체 (RPMI + 10 %FBS, 2 mM EDTA, 1% 페니실린/스, 20 mM HEPES, 55 μ M 2-mercaptoethanol, 1mm 나트륨 pyruvate 및 2 m m L-글루타민)의 10 ml 전체 볼륨으로 반복적으로 뼈를 플러시. 1 mL 주사기에 부착 된 25g 바늘을 사용 하 여 양쪽에서 뼈를 플러시.</li>
		<li>50 mL 원뿔 튜브 70 µ m 나일론 웹 필터 장착 하는 effluate를 전송 합니다. 신중 하 게 부드러운 교 반 및 pipetting 파편 및 셀 대기업을 분리 하십시오.</li>
		<li>셀 서 스 펜 션 (RT) 실 온에서 10 분 동안 250 x g 에서 원심</li>
		<li>감기-적혈구 세포의 용 해 버퍼 (0.15 M NH4Cl + 1 m m KHCO3 + 0.1 m m EDTA, 1 N HCl, 0.4 µ m 살 균 필터링, 및 4 ° C에서 저장과 7.2에 조정된 산도)의 1 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 떨고 수동 5 분 동안 얼음에 유지 합니다.</li>
		<li>비활성화 하 고 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼 씻어 감기 버퍼 (버퍼링 하는 인산 염 (PBS) + 2 mM EDTA + 2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) x 1) 10 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심</li>
		<li>완전 한 RPMI 매체 및 4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에서 원심 분리기 25 mL로 세포 세척</li>
		<li>완전 한 RPMI 매체의 5 mL에 셀 resuspend 세포 현 탁 액 trypan 블루와 함께 1: 1의 혼합 50 µ L. 현미경으로 세 실에 휴대폰 번호를 확인 합니다. 수식을 사용 하 여 셀 수를 계산: 셀/mL = [(비-얼룩진 셀 수/4) 2 x 10000 x]12. 참고:이 방법은 수율 40 x 106 60 x 106 12 주 된 C57BL/6 마우스에 감염 되지 않은 8 당 골 수 세포 뼈.</li>
		<li>4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DC 분화, 성숙 및 항 원 로드
<ol><li>
BM 셀 수확
	<ol>
<li>6 잘 초 저-첨부 매체, 일반적으로 잘 당 5 mL의 mL 당 106 세포 표면 접시에 완전 한 문화 씨앗 차별화 된 대 식 세포는 문화 판에 연결 됩니다. 후 12 h, 주로 포함 monocytes, 6 잘 플레이트, 준수 대 식 세포와 오래 된 6 잘 플레이트를 폐기 시키려면 상쾌한 전송.</li>
		<li>세포 분화를 촉진 하는 비 부착 한 세포 상업적으로 재조합 murine GM-CSF 37 ° C와 5% 이산화탄소 (CO2)에서 얻은 20 ng/mL를 포함 하는 완전 한 RPMI 매체의 당 일반적으로 5 mL에 mL 당 5 x 105 셀에서 문화 및 매일 관찰 합니다.</li>
		<li>3 일 마다 중단된 셀 아래로 회전 5 mm EDTA PBS에 부착 세포를 수집 하 고 스핀 다운. 결합 하 고 5 × 105 셀/mL 신선한 매체 20 ng/mL rm-GM-CSF를 포함에서 resuspend.</li>
		<li>8 일에 위와 같이 부착 및 분리 된 세포를 수집 하 고 조직 문화 치료 비 멸 균 페 트리 접시, 유도 높은 MHC-II에에서 24 h에 대 한 중간 포함 20 ng/mL GM-CSF에서에서 5 x 105 셀/mL와 20 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) resuspend CD80 그리고 CD86 식.</li>
		<li>Cytometry 단계 2.2에에서 표시 된에 의해 확인 DC 차별화.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cytometry 분화 및 성숙 분석 흐름.
	<ol>
<li>4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심 이 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
		<li>마우스 Fc 수용 체 차단 (안티 마우스 CD16/CD32 IgG2b 항 체 순화) 제조업체의 지침에 따라 4 ° C에서 15 분에서 resuspended 셀 펠 릿을 배양 하 여 블록 Fc 수용 체.</li>
		<li>4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심</li>
		<li>각 프로브에 대 한 흐름 cytometry 버퍼 (PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA x 1) 4 ° c.의 300 µ L 250000 셀 resuspend</li>
		<li>96 잘 접시에 잘 당 셀 솔루션의 30 µ L를 전송 합니다.</li>
		<li>4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심</li>
		<li>상쾌한 삭제 하 고 포함 하는 항 체의 30 µ L 추가 버퍼를 각 제조업체의 표시를 따라 잘. 4 ° c.에 20 분에 대 한 항 체와 세포를 품 어 참고: 일반적으로 고용 마커 Dc, monocytes, 대 식 세포는 CD11b, CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 그리고 CD86 (그림 3).</li>
		<li>4 ° C에서 5 분 동안 250 x g 에서 샘플 원심 및 죽은 세포 (예를 들어, propidium 요오드 화물, 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 또는 아민 반응성 염료를 제외 마커를 포함 하는 흐름 cytometry 버퍼의 당 200 µ L에서 resuspend ) 제조 업체의 권장된 농도13에.</li>
		<li>교류 cytometry 튜브 샘플을 전송 하 고 죽은 세포를 제외 하 고 0, 3, 6, 9 일에 교류 cytometry 분석을 수행 하 여 세포 분화를 모니터링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DC 항 로드 합니다.
	<ol>
<li>8 일에 4 ° C에서 5 분 동안 250 x g 에서 샘플 원심 및 200 µ L 매체에 산 탄을 resuspend (RPMI + 10 %FBS 항생제 없이). 이 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
		<li>10 µ g/mL OVAp (323-339;와 Dc를 품 어 ISQAVHAAHAEINEAGR) 1 x 107 Dc에서에서 매체의 1 mL 당 (RMPI + 1 %FBS) 37 ° c.에 적어도 30 분 동안 플라스틱 튜브에 OVAp 로드 Dc를 사용 하 여 부정적인 제어 조건으로.</li>
		<li>4 ° C에서 5 분 동안 250 x g 에서 샘플 원심 고 200 µ L 완전 한 RPMI 매체에 산 탄을 resuspend. 이 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
		<li>4 ° C에서 5 분 동안 250 x g 에서 샘플 원심 및 200 µ L 매체에 산 탄을 resuspend (RPMI + 10 %FBS) 2 x 106 셀/mL에.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. OTII 마우스에서 순진한 CD4 T 세포의 고립
참고:이 방법은 12 주 된 C57BL/6 마우스에 감염 되지 않은 8 당 약 100 x 106 spleenocytes를 생성합니다. 남성과 여성 모두 사용할 수 있습니다. CD4 T 세포는 비장 또는 림프절;에서 고립 될 수 있다 CD4 T 세포는 각각 대략 25% 및이 기관에 있는 세포의 50%를 위한 계정. 무 균 조건에서 다음 단계를 수행 합니다.
<ol><li>사 타 구니, 겨드랑이, 상 완, 자 궁 경부, 그리고 mesenteric 림프절과 비장 OTII 유전자 변형 마우스 (그림 4)에서 분리 하 고 플라스틱 페 트리 접시 포함 하는 완전 한 RPMI 매체의 10 mL 그들을 전송.</li>
	<li>완전 한 RPMI 매체의 2 mL와 함께 셀 여과기를 헹 구 고 50 mL 튜브에서 제거. 전송 림프절과 비장 70 µ m 셀 스 트레이너를 50ml 튜브에 배치. (그림 5) 주사기 플런저를 사용 하 여 균질 하 고 매체 추가 최대 15 mL.</li>
	<li>4 ° C에서 5 분 동안 250 x g 에서 샘플 원심 하 고 완전 한 RPMI 매체의 15 mL에 펠 릿을 resuspend. 이 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
	<li>비장 세포 현 탁 액 셀 펠 릿 resuspend 및 단계 1.2.5에서 붉은 혈액 세포를 lyse.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심</li>
	<li>완전 한 RPMI 매체와 실시간에 5 분 동안 250 x g 에서 원심 분리기 25 mL로 세포 세척</li>
	<li>중간의 5 mL에 셀 resuspend Trypan 파랑 세포 현 탁 액 1: 1의 50 µ L를 혼합. 현미경 아래 세 챔버를 사용 하 여 셀 수를 결정 합니다. 수식을 사용 하 여 셀 수를 계산: 셀/mL = [(비-얼룩진 셀 수/4) 2 x 10000 x]12.</li>
	<li>2.2.2 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 셀 CD4 T 세포의 부정적인 선택 나중에 얼음에 30 분을 CD8α, IgM, B220, CD19, MHCII (난 Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25, DX5 biotinylated 항 체의 1:800 희석을 품 어.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라와 streptavidin 입히는 자기 microbeads의 필요한 금액을 계산 하 고 CD4 T 세포는 자기 세포 구분 및 적절 한 사용 하 여 격리 셀 수와 구슬의 용량에 따라, 분리의 열 있습니다.</li>
	<li>완전 한 RPMI 매체의 5 mL에 셀 resuspend 고 단계 3.7에서에서 설명한 대로 라이브 셀을 계산 하는 동안 얼음에 그들을 유지.</li>
	<li>2 x 105 셀을 추출 하 고 수집 된 셀 사용 하 여 안티 CD4, CD3, B220, CD8 항 체 희석 제조 업체 추천을 사용 하 여 교류 cytometer에서 형광 항 체의 순도 확인 하십시오.</li>
	<li>격리 된 순진한 CD4/OTII T 세포 얼룩, 500 µ L 버퍼 (PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA x 1) 106 셀 resuspend. 준비 하는 500 µ L 버퍼 (PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA x 1) 포함 된 중요 한 셀 추적 염료의 최종 제조업체 권장 농도 더블. 천천히 세포 현 탁 액을 세포 추적 솔루션을 추가 하 여 두 솔루션을 혼합. 37 ° c.에 5 분에 대 한 셀을 품 어</li>
	<li>완전 한 RPMI 매체와 4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g에서 원심 분리기의 5 mL로 세포 세척 이 단계를 두 번 반복 합니다. 1 x 107셀/mL에서 완전 한 RPMI 매체의 1 mL에 셀 resuspend</li>
</ol>4. Vivo에서 활성화, 확산 및 Th1 차별화 분석 결과
참고: 중요 한 셀 추적 염료 carboxyfluorescein diacetate succinimidyl 에스테 르 (CFSE) 및 다른 succinimidyl 에스테 르 기반 염료, 기쁘게 생각 하 고 다른 파장에서 형광을 방출, 널리 이용 된다 림프 톨 확산을 평가 하기 위해 흐름에 의해 그들의 높은 형광 강도, 긴 수명, 낮은 다양성, 및 낮은 독성14cytometry.
<ol><li>Adoptively 정 맥 (i.v.) 1 x 106 라이브 중요 한 셀 추적 염료 얼룩이 순진한 CD4/OTII T 셀 마우스 당 PBS의 100 µ L에 전송 합니다. 레이블이 T 세포 adoptively 꼬리 정 맥 또는 복고풍 궤도 주입15;으로 옮겨질 수 있다 두 경우 모두에서 세포 림프 기관 (그림 6A)에 홈 것입니다.</li>
	<li>도전 받는 사람 마우스 1 일 후 adoptively 100000 LPS 성숙 OVAp 로드 Dc 올리십시오 (그림 6B)에 피하 주사 (s.i.)로 전송 하 여.</li>
	<li>받는 사람 마우스에서 오 금 림프절을 수확 하 고 이전 3.1 및 3.2에 설명 된 동일한 단계를 수행 하는 단일 셀 정지의 획득까지 그들을 처리 합니다. 이렇게 하루 2 사후 예방 접종 CD4/OTII T 세포 활성화를 측정 하 고 확산 플러스 Th1 차별화를 측정 하는 5 일에.</li>
	<li>하루에 2 T 세포 활성화를 분석 하려면 얼룩 CD4, CD69와 CD25 형광 항 체와 세포 (선택적으로 CD45.1와 CD45.2) C69의 비율을 결정 하 고+CD25+ T 세포 CD4 인구. Cytometry (그림 7)에 의해 분석.</li>
	<li>5 일에 T 세포 증식을 확인 하려면 셀 c d 4와 선택적으로 CD45.1와 CD45.2에 대 한 적절 한 형광 항 체를 사용 하 여 얼룩. CD4 인구에서 중요 한 셀 추적 염료 신호 감퇴 cytometry (그림 8) 분석. 중요 한 셀 추적 염료와 각 형광 피크에 나누어 세포의 비율, 총 셀에 나누어 세포의 백분율을 표시 하는 세포에 의해 받은 셀 분할 수 등이 연구에 여러 매개 변수를 확인할 수 있습니다. 인구입니다.</li>
	<li>하루 5, Th1 차별화 플레이트 1 µ M ionomycin과 10 ng/mL phorbol 12 myristate 13 아세테이트 (PMA) 인큐베이터에서 37 ° C에서 6 시간을 포함 하는 완전 한 RPMI 매체의 200 µ L에서 96 잘 접시의 당 400000 셀을 결정 합니다. 마지막 4 h 3-10 µ g/mL brefeldin 매체에 cytokine 분 비를 차단 하는 추가 합니다.</li>
	<li>250 x g 4 ° c.에 5 분에 대 한 번호판을 원심 96 잘 접시의 급속 한 반전으로는 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
	<li>2.2.2 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>버퍼 (PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA x 1) 포함 된 항 체의 CD4 하 고 CD45.1 및 CD45.2 제조 업체 권장 희석에서 30 µ L에 4 ° C에서 15 분 동안 배양 하 여 세포 막 얼룩. 버퍼 (PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA x 1)의 150 µ L을 추가 하 여 셀을 세척 하 고 250 x g 4 ° C에서 5 분에 대 한 번호판을 원심 상쾌한 삭제.</li>
	<li>1000 x g 5 분 및 4 ° c.에 대 한 번호판 실시간 원심 분리기에서 20 분 동안 2 %paraformaldehyde/1% 자당의 100 µ L을 추가 하 여 셀을 수정 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>세포내 permeabilization 버퍼 (1 x PBS + 0.1 %BSA, 0.01 M HEPES, 0.3% 사포닌)의 50 µ L을 추가 하 여 세포를 permeabilize, 4 ° c.에 30 분 동안 품 어</li>
	<li>실시간 삭제는 상쾌한에서 1000 x g 에서 PBS와 5 분 동안 원심 분리기의 150 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>버퍼 (PBS + 0.1% 사포닌)에서 IFNγ 항 체 안티 fluorophore 활용의 30 µ L을 추가 하 여 세포내 cytokines 얼룩이 실시간에서 30 분 동안 품 어</li>
	<li>버퍼 (PBS + 0.1% 사포닌)의 150 µ L을 추가 하 여 셀을 씻어. RT에서 1000 x g 에 5 분 동안 접시를 원심 및 삭제는 상쾌한. 이 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
	<li>Cytometry (그림 8)에 의해 세포 인구를 분석 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Warth, S. C., Heissmeyer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+transduction+of+naive+CD4+T+cells+to+study+Treg+differentiation.">Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+the+mouse+popliteal+lymph+node.">Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li></ol>

저자 공개할 게 없다

이 프로토콜은 활성화, 확산, 그리고 순진한 CD4 T 세포의 분화를 조절 하는 BM 파생 된 Dc의 용량 특성에 대 한 수 있습니다. 또한, 그것은 또한 사용할 수 있습니다 변조 CD4 T 세포의 민감성을 평가 하기 위해 BM 파생 DCs에 의해. 이 프로토콜 측정 vivo에서이러한 이벤트에는 변경 될 수 있습니다.
조사 가설에 따라 T 세포와 Dc의 여러 가지 조합은 사용할 수 있습니다. 예를 들...

CD4 T 세포와 항 원 제시 세포 (Apc) Dc 같은 미생물 병원 체1,2면제의 필요한 중재자는. 주변 림프 기관에 CD4 T 세포 APCs3,,45에 의해 제시 하는 특정 항 원 인식에 따라 활성화 됩니다. 활성화 된 CD4 T 세포 증식 하 고 올바른 적합 한 면역 반응6,7의 개발에 필요한 별개 특정 효과 기 Th 세포로 분화. 이러한 프로세스의 제어는 유해한 조직 손상8을 생산 하지 않고는 병원 체를 죽이 적절 한 적응형 방어를 생산을 위한 중요 한. Th 셀 식 또는 표면 분자, 녹음 방송 요인과 이펙터 cytokines의 생산에 따라 정의 되 고 병원 체1응답에 필수이 고 정확한 기능을 수행. Th1 세포 부분 집합의 세포 전사 인자 T 내기와 사이토카인 인터페론 γ (IFNγ) 표현 하 고 세포내 병원 체1에 대 한 호스트 방어에 참여. 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산, 및 Th1 차별화의 정량화는 T 세포 재생의 역할 면역 반응을 평가 하는 유용한 수단입니다.
이 프로토콜 활성화에 비보 분석의 체 외-용량 생성 BM 파생 Dc 활성화, 확산, 및 Th1 순진한 CD4 T 세포의 분화를 조절 하. 프로토콜 또한 순진한 CD4 T 세포 활성화, 격 증, 유도의 용량을 평가 하 고 Th1 분화 (그림 1). 이 다양 한 프로토콜을 특별히 조작 하거나 순전히 프로토콜 vivo에서 공부 셀 채우기 선택 못하는 circumvents. 다양 한 분자와 Dc에 치료의 효과 BM 유전자 변형된 쥐5 에서 사용 하거나 치료 또는 격리 된 BM 셀9유전자 조작에 의해 공부 될 수 있다. 마찬가지로, T 세포 응답 서로 다른 소스에서 또는 여러 가지 조작을3,,810후 입양 전송에 대 한 T 세포를 획득 하 여 탐험 수 있습니다.
이 프로토콜의 주요 장점은 두 가지입니다. T 세포 활성화, 확산, 및 Th1 차별화 흐름 cytometry 접근;와 분석 그리고이 vivo에서 학문, 따라서 averting 체 외에서 발생할 수 있는 변경 및 세포 유형 및 기타 요인에만 그대로 장기11에서 발견을 포함 하 여 결합.
중요 한 염료의 사용 방사능의 사용을 피하고 있는 동안 세포의 확산을 추적 하는 널리 사용 되는 기술입니다. 이 시 약으로 확산의 측정 세포 분열 후 염료 희석을 기반으로 합니다. 또한, 이러한 염료 여러 파장에서 검출 될 수 있다 그리고 쉽게 여러 형광 항 체 또는 표식 함께 cytometry에 의해 분석 된다. 우리는 어떻게 T 세포 활성화, 확산, 및 Th1 차별화 cytometry에 의해 분석 될 수 있다 표시 하 여이 프로토콜의 유틸리티를 강조 표시 합니다.

<table><tbody><tr><td>Ethanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>20,824,365</td><td>5 L</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>10020-00</td><td>Box of 100 blades</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>SIGMA</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>LONZA</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)</td><td>GIBCO</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Petri dishes</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>25-gauge needle</td><td>BD Microlance 3</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>Novico</td><td>N15663</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m nylon web filter</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Red blood lysis buffer</td><td>SIGMA</td><td>R7757</td><td>100 Ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA</td><td>ED2SS-250</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>SIGMA</td><td>A7906</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>SIGMA</td><td>302643-25G</td><td></td></tr><tr><td>Culture-plates</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Cambrex</td><td>BE17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercaptoethanol</td><td>Merck</td><td>8-05740-0250</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>LONZA</td><td>BE13-115E</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>LONZA</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)</td><td>Prepotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>lipopolysaccharide (LPS)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>L2018</td><td></td></tr><tr><td>96-well-plate</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>v450 anti-mouse CD11b antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>560455</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-mouse CD64 antibody</td><td>BioLegend</td><td>139303</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-mouse CD115 antibody</td><td>BioLegend</td><td>135505</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse CD11c antibody</td><td>BioLegend</td><td>117305</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse MHCII antibody</td><td>BioLegend</td><td>125507</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD86 antibody</td><td>BioLegend</td><td>105011</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD80 antibody</td><td>BioLegend</td><td>104713</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometry tubes</td><td>Zelian</td><td>300800-1</td><td>PS 12X75 5mL</td></tr><tr><td>OTII Ovoalbumine peptide</td><td>InvivoGen</td><td>323-339</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse biotinylated CD8&amp;alpha; antibody</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0081-U500</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse biotinylated IgM antibody</td><td>BioLegend</td><td>406503</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse biotinylated B220 antibody</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0452-U500</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse biotinylated CD19 antibody</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0193-U500</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody</td><td>BioLegend</td><td>115302</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse biotinylated CD11b antibody</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0112-U500</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse biotinylated CD11c antibody</td><td>BioLegend</td><td>117303</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse biotinylated CD44 antibody</td><td>BioLegend</td><td>103003</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse biotinylated CD25 antibody</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0251-U100</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse biotinylated DX5 antibody</td><td>BioLegend</td><td>108903</td><td></td></tr><tr><td>streptavidin-coated magnetic microbeads</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic cell separator</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>QuadroMACS Separator</td></tr><tr><td>Separation columns</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-mouse CD4 antibody</td><td>BioLegend</td><td>100408</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD3 antibody</td><td>BioLegend</td><td>100235</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse CD8 antibody</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0081-U025</td><td></td></tr><tr><td>Cell Violet Tracer</td><td>Thermofisher</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD25 antibody</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-0251-U100</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 anti-mouse CD69 antibody</td><td>BioLegend</td><td>104518</td><td></td></tr><tr><td>PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>65-0453</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD45.1 antibody</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-0453</td><td></td></tr><tr><td>PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>60-0453</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse CD45.2 antibody</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0454</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA)</td><td>SIGMA</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A (BD GolgiPlug)</td><td>BD</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Millipore</td><td>8-18715-02100</td><td></td></tr><tr><td>Intracellular permeabilization buffer</td><td>eBioscience</td><td>00-8333</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse IFNg antibody</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-7311-U100</td><td></td></tr><tr><td>Fc-block (anti-mouse CD16/CD32)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161-U100</td><td></td></tr><tr><td>B6.SJL CD45.1 mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>002014</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa&amp;trade; Cell Analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td>649225</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Solution</td><td>Thermofisher</td><td>62248</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vivo mouse model to measure na&#239;ve cd4 t cell activation, proliferation and th1 differentiation induced by bone marrow-derived dendritic cells

순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산, 그리고 T 도우미 1 차별화의 정량화 (Th1) 세포 면역 반응에서 T 세포의 역할을 평가 하는 유용한 방법입니다. 이 프로토콜 granulocyte macrophage 식민지 자극 요소 (GM-CSF) 파생 된 모 수석 세포 (DCs)를 골 (BM) 창시자의 체 외에서 분화를 설명 합니다. Ovalbumin 펩 티 드 (OVAp)의 입양 전송 프로토콜에 대해서도 설명 합니다-로드 GM-CSF 파생 Dc 순진한 CD4 T 세포 OTII 유전자 변형 쥐에서 vivo에서 활성화, 확산, 및 Th1 분화를 분석 하기 위하여는 전송 된 CD4 T 세포입니다. 이 프로토콜 메서드의 순전히 vivo에서 특별히 조작 하거나 공부 셀 채우기를 선택 하는 무 능력에 의해 부과 된 제한 circumvents. 또한,이 프로토콜 변경 체 외에서 발생할 수 있는 기능적 요소와 세포 유형 및만 그대로 장기에 있는 다른 요인의 영향을 포함 하 여 피할 vivo에서 환경에서 연구를 수 있습니다. 프로토콜은 DCs에 변화를 생성 하기 위한 유용한 도구와 T 세포는 적응 면역 반응, 잠재적으로 제공 하는 원본 또는 수많은 면역 관련된 질병의 개발을 이해 하는 중요 한 결과 수정.

그림 1 에서는이 프로토콜에서 설명 하는 단계를 보여 줍니다. 그림 2 에서는 분리와 마우스 BM 세포의 문화를 보여 줍니다. 이러한 문화에 GM-CSF와 LPS의 추가 허용 한다 생체 외에서 생성 하 고 Dc. 그림 3 의 성숙 분화의 흐름 cytometry 분석과 취득된 Dc OVAp 로드 GM-CSF BM 파생 된 Dc의 성숙 보여 줍니다. 그...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Mouse Model to Measure NaÃ¯ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells at JoVE

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

여기, 우리가 순진한 CD4 T 세포 (T 세포) 활성화, 확산, 그리고 GM-CSF 골 (BM)에 의해 유도 된 Th1 차별화의 비보에 결정에 대 한 프로토콜을 제시-파생 된 모 수석 세포 (DCs). 또한,이 프로토콜 BM 및 T-세포 절연, DC 생성, 및 DC 및 T-세포 입양 전송을 설명합니다.

Vivo에서 마우스 모델을 측정 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산 및 골 수 유래 수지상 세포에 의해 유도 된 Th1 차별화

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

an-vivo-mouse-model-to-measure-nave-cd4-t-cell-activation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.4K 조회수.  Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC). 여기, 우리가 순진한 CD4 T 세포 (T 세포) 활성화, 확산, 그리고 GM-CSF 골 (BM)에 의해 유도 된 Th1 차별화의 비보에 결정에 대 한 프로토콜을 제시-파생 된 모 수석 세포 (DCs). 또한,이 프로토콜 BM 및 T-세포 절연, DC 생성, 및 DC 및 T-세포 입양 전송을 설명합니다.

비디오: An In Vivo Mouse Model to Measure Naïve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

B 세포의 CD40 - 정품 인증 Murine 모델

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

연구

면역학 및 감염병학

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

이식 - 대 - 호스트 질병의 유도 및<em&gt; 생체 내</emMHC 검색 손쥐 모델을 사용&gt; T 셀 모니터링

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

생물학

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% CD11c high dendritic cells in culture that home to the draining lymph node after subcutaneous injection and present antigen to antigen specific T cells (see video). Additionally, we use Essen Instruments Incucyte to track dendritic cell maturation, where, at day 10, the morphology of the cultured cells is typical of a mature dendritic cell and &lt;85% of cells are CD11chigh. The study of antigen presentation in peripheral lymph nodes by 2-photon imaging revealed that there are three distinct phases of dendritic cell and T cell interaction1, 2. Phase I consists of brief serial contacts between highly motile antigen specific T cells and antigen carrying dendritic cells1, 2. Phase two is marked by prolonged contacts between antigen-specific T cell and antigen bearing dendritic cells1, 2. Finally, phase III is characterized by T cells detaching from dendritic cells, regaining motility and beginning to divide1, 2. This is one example of the type of antigen-specific interactions that can be analyzed by two-photon imaging of antigen-loaded cell tracker dye-labeled dendritic cells.

Antigen presentation in secondary lymphoid organs by dendritic cells is crucial for the initiation of the T cell mediated adaptive immune response. Here we demonstrate the culture of bone marrow derived murine dendritic cells, activation, and labeling for 2-photon imaging.

골수의 생성은 2 광자 영상에서 사용하기 위해 Murine 돌기 세포를 유래

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

종양 특이 CD8+ T 세포 반응에서 면역 우세를 연구 하기 위한 생체 내 세포 독성 분석 법

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state against self-antigens as well as antigens derived from commensal organisms. The disruption of this immune homeostasis can lead to chronic inflammation and to the development of autoimmunity. Dendritic cells (DCs) are the professional antigen-presenting cells of the innate immune system involved in activating na&#239;ve T cells to initiate immune responses against foreign antigens. However, DCs can also be differentiated into TolDCs that act to maintain and promote T cell tolerance and to suppress effector cells contributing to the development of either autoimmune or chronic inflammation conditions. The recent advancement in our understanding of TolDCs suggests that DC tolerance can be achieved by modulating their differentiation conditions. This phenomenon has led to tremendous growth in developing TolDC therapies for numerous immune disorders caused due to break in immune tolerance. Successful studies in preclinical autoimmunity murine models have further validated the immunotherapeutic utility of TolDCs in the treatment of autoimmune disorders. Today, TolDCs have become a promising immunotherapeutic tool in the clinic for reinstating immune tolerance in various immune disorders by targeting pathogenic autoimmune responses while leaving protective immunity intact. Although an array of strategies has been proposed by multiple labs to induce TolDCs, there is no consistency in characterizing the cellular and functional phenotype of these cells. This protocol provides a step-by-step guide for the development of bone marrow-derived DCs in large numbers, a unique method used to differentiate them into TolDCs with a synthetic triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic acid-difluoro-propyl-amide (CDDO-DFPA), and the techniques used to confirm their phenotype, including analyses of essential molecular signatures of TolDCs. Finally, we show a method to assess TolDC function by testing their immunosuppressive response in vitro and in vivo in a preclinical model of multiple sclerosis.

Here, we present a protocol to develop and characterize tolerogenic dendritic cells (TolDCs) and evaluate their immunotherapeutic utility.

개발 및 Murine Tolerogenic 수지상 세포의 기능적 특성

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

의학

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

<meta charset="utf8"></head><body>유세포 분석을 사용한 Naive CD4+ T 세포에서 Th17 세포 분화

In Vitro Differentiation of Naive CD4+ T Cells into Pathogenic Th17 Cells in Mouse

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have been linked to a wide range of diseases in recent times, including multiple sclerosis (MS), rheumatoid arthritis, acute respiratory distress syndrome (ARDS), sepsis, and other autoimmune disorders. However, the currently known in vitro differentiation protocols have difficulty achieving high purity of pathogenic Th17 cells, with the induction efficiency often below 50%, which is a key challenge in in vitro experiments. In this protocol, we propose an enhanced in vitro culture and differentiation protocol for pathogenic Th17 cells, which is used to directly differentiate naive CD4+ T cells isolated from mouse spleens into pathogenic Th17 cells. This protocol provides detailed instructions on splenocyte isolation, purification of naive CD4+ T cells, and differentiation of pathogenic Th17 cells. Through this protocol, we can achieve a differentiation purity of approximately 90% for pathogenic Th17 cells, which meets the basic needs of many cellular experiments.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 사이토카인 농도 조절을 사용하여 Th17 세포의 고순도 In Vitro 분화 달성

This protocol describes the differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells into pathogenic Th17 cells in vitro. Specifically, when combined with a multi-parameter flow cytometry-based approach, 90% purity of pathogenic Th17 cells can be obtained from na&#239;ve CD4+ T cells using this differentiation method.

마우스에서 Naive CD4+ T 세포를 병원성 Th17 세포로 체외에서 분화

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have ...

Vivo에서 마우스 모델을 측정 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산 및 골 수 유래 수지상 세포에 의해 유도 된 Th1 차별화

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

B 세포의 CD40 - 정품 인증 Murine 모델

이식 - 대 - 호스트 질병의 유도 및

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

골수의 생성은 2 광자 영상에서 사용하기 위해 Murine 돌기 세포를 유래

마우스 나이브 CD4

종양 특이 CD8⁺ T 세포 반응에서 면역 우세를 연구 하기 위한 생체 내 세포 독성 분석 법

개발 및 Murine Tolerogenic 수지상 세포의 기능적 특성

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

마우스에서 Naive CD4⁺ T 세포를 병원성 Th17 세포로 체외에서 분화

마우스에서 Naive CD4⁺ T 세포를 병원성 Th17 세포로 체외에서 분화